菠蘿AcMADS41 基因的克隆及其在花發(fā)育中的表達分析

鄭雪文，歐陽嫣惟，，潘曉璐，張紅娜，楊轉(zhuǎn)英

（1.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南 海口 570228）

【研究意義】菠蘿（Ananas comosusL.Merr）是鳳梨科最重要的經(jīng)濟作物，在許多熱帶和亞熱帶國家廣泛種植［1］，是世界最著名的熱帶水果之一［2］。根據(jù)FAO 數(shù)據(jù)，2019 年全球菠蘿年產(chǎn)量約為2 600 萬t。菠蘿果實中含有人體必需的維生素C、多種菠蘿蛋白酶和有機酸等，具有豐富的營養(yǎng)價值且風(fēng)味獨特，深受廣大消費者的喜愛［3］。種植2～3 年的菠蘿自然結(jié)果率一般在60%～80%之間，開花時間具有不確定性。人工誘導(dǎo)開花不僅能促使菠蘿提早開花、增強開花時間的一致性，還能顯著提高結(jié)果率［4］。乙烯是迄今為止已發(fā)現(xiàn)的能直接啟動菠蘿生殖生長的唯一一種植物激素，國內(nèi)外學(xué)者對外源刺激誘導(dǎo)菠蘿成花的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利誘導(dǎo)開花的效果除受施用濃度、外界環(huán)境和植株生長狀況影響外，不同品種菠蘿對乙烯利誘花的效果也存在較大差異，這也導(dǎo)致一些對乙烯利不敏感的優(yōu)良品種在市場上難以推廣［5-8］。鑒于此，揭示菠蘿成花機理對生產(chǎn)上誘導(dǎo)菠蘿開花具有重要的指導(dǎo)作用。【前人研究進展】自然界中植物的花形態(tài)各異，花器官通常由萼片、花瓣、雄蕊和心皮組成，以上組成部分在花的生長發(fā)育中均具有獨特作用［9］。根據(jù)ABC 模型，花器官的4 個組成部分一般由3 類基因調(diào)控，后來又發(fā)現(xiàn)了D 類基因SINGSTICK（STK）和E 類基因SEPALLATA1-4（SEP1-4）［10-11］，構(gòu)成ABCDE 模型。目前研究驗證在擬南芥中調(diào)控花發(fā)育的相關(guān)基因有APETALA1（AP1）和APETALA2（AP2）、APETALA3/PISTILLATA（AP3/PI）、LEAFY（LFY）、FRUITFULL（FUL）、AGAMOUS（AG）等，除AP2外均屬于MADSbox 家族成員［9，12-13］。MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，是參與花器官形成、花期調(diào)控、果實發(fā)育等的關(guān)鍵基因。MADS-box 基因分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類，Ⅱ型基因比Ⅰ型多3 個保守域，可分為MIKC* 和MIKCC 兩個亞家族。AP3是MADS-box 家族MIKCC 亞族的一個分支，屬于ABCDE 模型中的B 類功能基因，在擬南芥中主要參與植物花發(fā)育中花瓣與雄蕊的形成［11，14-17］。目前，在多種植物花發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)AP3起著重要作用，如藏紅花CsAP3可調(diào)節(jié)柱頭發(fā)育［18］。白菜和油菜的B.AP3.a基因決定花瓣和雄蕊的發(fā)育，而B.AP3.b基因只參與雄蕊的發(fā)育［19］；在番茄中，TAP3參與雄蕊和花瓣的發(fā)育，TM6則主要調(diào)控雄蕊的發(fā)育［20］。【本研究切入點】目前在菠蘿中關(guān)于AP3基因及其功能的研究尚沒有相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從乙烯誘導(dǎo)后的巴厘品種菠蘿中克隆出一個新的AP3同源全長基因，命名為AcMADS41，通過生物信息學(xué)技術(shù)對該基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、物種進化樹等進行系統(tǒng)分析，并利用RNA-sep 分析其在菠蘿花芽發(fā)育不同階段和不同花器官中的表達差異，為進一步研究AcMADS41在菠蘿成花過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菠蘿植株品種為巴厘（Ananas comosusL.cv.Comte de Paris），選取200 株健康生長植株，使用30 mL 濃度為200 mg/L 的乙烯利灌心處理［4］，以清水為對照，在處理后0、4、8、16、32、48 d分別對花芽進行取樣，花器官分化后對不同花器官分別采樣單獨保存，用液氮速凍，保存于-80℃。

RNA 提取試劑盒Quick RNA isolation Kit 購于北京華越洋生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購于Thermo Fisher Scientific，Trans Taq?DNA polymerase High Fidelity 試劑盒、pEASY-T1 載體和DH5α 大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。試驗所用儀器包括Eppendorf 離心機、Germany 超微量分光光度計、Thermo Fisher Scientific PCR 儀。

1.2 總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)多糖多酚植物RNA 提取試劑盒說明書操作，從菠蘿花芽與花器官中提取總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。通過超微量紫外分光光度計檢測RNA 濃度和質(zhì)量后，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA［5，21］。

1.3 目的基因的克隆

通過前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析得到AcMADS41的CDS 序列，使用Primer Premier 設(shè)計目的基因的引物（AcMADS-F、AcMADS-R，表1），以菠蘿花芽的混合cDNA 為模板。用Trans Taq? DNA Polymerase High Fidelity 試劑盒克隆目的基因的片段，PCR 反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，38 個循環(huán)，72℃后延伸7 min。擴增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將得到的目的基因進行切膠回收，得到純化產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)中，陽性檢測正確后送測序。

表1 基因克隆引物序列Table 1 Sequences of primers for gene cloning

1.4 AcMADS41 的生物信息學(xué)分析

1.4.1AcMADS41的理化性質(zhì)分析 從菠蘿基因組數(shù)據(jù)中搜索得到AcMADS41的全長序列，通過擬南芥數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）得到擬南芥AtAP3的CDS 序列和DNA 全長序列，將CDS 序列和DNA 全長序列用Bioxm 2.6軟件進行比對，比對結(jié)果通過Exon-Intron Graphic Maker 在線網(wǎng)站進行修飾。用Expasy-Translate 分析并翻譯AcMADS41的CDS 序列，使用Expasy-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析該基因氨基酸序列的等電點（PI）、分子量（MW）、氨基酸組成、蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)和脂肪族指數(shù)等。使用SWISS-MODEL 預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型（https://swissmodel.expasy.org/）［3］。

1.4.2AcMADS41基因結(jié)構(gòu)、保守域和同源性分析 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分 析AcMADS41 蛋 白結(jié)構(gòu)域。在NCBI 和PlantTFDB 數(shù)據(jù)庫進行blastP得到AcMADS41不同物種的同源蛋白序列并下載，通過clustalX 對同源蛋白序列進行多序列比對，用Mega6.0 通過鄰位連接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1 000 次。選取其中7個物種的同源蛋白序列和AcMADS41 蛋白序列用DNAMAN 進行多序列比對。

1.4.3 菠蘿AcMADS41啟動子順式作用元件分析 通過菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫（http://pineapple.angiosperms.org/pineapple/html/index.html）搜索得到AcMADS41 基因的啟動子序列，在PlantCARE 在線網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上進行分析［22］，得到的數(shù)據(jù)再通過Tbtools 軟件進一步處理。

1.5 菠蘿AcMADS41 基因的表達分析

通過菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫搜索得到菠蘿花、果、葉和根組織部位的基因組數(shù)據(jù)進行分析。從轉(zhuǎn)錄組（論文待發(fā)表）數(shù)據(jù)中分析AcMADS41在乙烯利處理后0、4、8、16、32、48 d 菠蘿花芽中的表達情況，并分析其在不同花器官中的表達。使用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對菠蘿AcMADS41在花器官不同組成部分的表達進行分析。使用Primer Premier 設(shè)計目的基因的引物，以Acactin作為內(nèi)參基因（表2）。試驗所用試劑為Thermo Fisher Scientific 的PowerUp ? SYBR ? Green預(yù)混液，儀器為LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀。qRT-PCR 反應(yīng)終體系為10 μL，qRTPCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃15 s、57 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。每個樣品3 次重復(fù)，利用2-ΔΔCt法計算AcMADS41相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR 引物序列Table 2 Sequences of primers for real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 菠蘿AcMADS41 蛋白互作分析

以擬南芥作為參考，使用String 在線網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/）對AcMADS41 蛋白與其他蛋白間的互作進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcMADS41 基因的全長克隆

從菠蘿花芽與花器官中提取總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測質(zhì)量和濃度，電泳條帶清晰完整，濃度為500～1 000 ng/μL，OD260/280比值在2.0～2.2 之間，可以進行后續(xù)試驗。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，通過PCR 技術(shù)擴增AcMADS41基因的全長cDNA序列，電泳檢測其長度為468 bp（圖1）。連接pEASY-T1 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)（DH5α），測序結(jié)果顯示序列正確。

圖1 AcMADS41 基因的全長克隆電泳結(jié)果Fig.1 Full-length clone electrophoresis result of AcMADS41 gene

2.2 AcMADS41 的生物信息學(xué)分析

2.2.1AcMADS41的理化性質(zhì)分析AcMADS41基因組DNA 全長序列為5 098 bp，編碼區(qū)為458 bp，編碼155 個氨基酸（圖2C）。將擬南芥AP3（AtAP3）和菠蘿AP3（AcMADS41）AcMADS41基因組全長序列比對后發(fā)現(xiàn)該基因內(nèi)含子、外顯子與擬南芥的差異顯著（圖2A）。AtAP3基因含有5'UTR、3'UTR、7 個外顯子和6 個內(nèi)含子，而AcMADS41基因含有5'UTR、3'UTR、5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，后者3'UTR 的長度遠大于前者3'UTR 的長度。根據(jù)Expasy-ProtParam 預(yù)測分析結(jié)果，AcMADS41 蛋白的分子量（MW）為18 242.90，等電點（PI）為9.56，賴氨酸（Lys）含量最高、占總氨基酸數(shù)的10.2%，帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為20，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為29。該蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為31.21，表明蛋白質(zhì)穩(wěn)定；脂肪指數(shù)為75.42，親水性的平均值（GRAVY）為-0.849，表明該蛋白為親水蛋白。以6byy.2.A 為模板［23］，通過SWISS-MODEL 預(yù)測AcAP3 蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型發(fā)現(xiàn)，該模型為同型二聚體，序列相似性為0.43，全球模型質(zhì)量估計（GMQE）為0.23，QMEAN為-0.54（圖2B），表明預(yù)測模型的質(zhì)量較高。

圖2 AcMADS41 的理化性質(zhì)預(yù)測分析Fig.2 Prediction and analysis of physicochemical property of AcMADS41

2.2.2 AcMADS41 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測和同源性比對 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫預(yù)測AcAP3 蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖3A）顯示，該蛋白在2～80 bp 處含有高度保守的MADS 域（MADS-box），在83～153 bp處含有K 域（K-box），表明該蛋白為MIKC 型MADS-box 基因中MIKCc 型蛋白的一員。

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫和PlantTFDB 數(shù)據(jù)庫得到多個與AcMADS41同源的其他蛋白序列，并選取海棗（Phoenix dactylifera）、油棕（Elaeis guineensis）、石刁柏（Asparagus officinalis）、鶴頂蘭（Phaius tancarvilleae）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、短柄草（Brachypodium distachyon）和本氏煙草（Nicotiana benthamiana）等7 個物種的AP3 同源蛋白與AcMADS41 蛋白進行多序列比對，結(jié)果（圖3B）發(fā)現(xiàn)其序列長度相對較短，但在同等長度部分與其他序列之間的相似性較高，均含有MADS-box 和K-box 結(jié)構(gòu)域。

圖3 AcMADS41 蛋白的保守域預(yù)測分析Fig.3 Prediction and analysis of AcMADS41 protein domain

利用MEGA6.0 軟件對AcMADS41 氨基酸序列與其他22 個物種中的同源蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)Ac 進化樹主要分為單子葉植物和雙子葉植物兩大類。菠蘿AcMADS41 氨基酸序列與海棗和油棕被聚類到同一條分支上，可見其與海棗、油棕等熱帶植物中AP3 同源蛋白的親緣關(guān)系較近。

圖4 AcMADS41 的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AcMADS41

2.2.3 菠蘿AcMADS41啟動子順式作用元件預(yù)測分析 在菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫搜索得到一個2 468 bp 的AcMADS41啟動子。經(jīng)PlantCARE 預(yù)測啟動子順式作用元件結(jié)果（圖5）顯示，AcMADS41啟動子有19 種、97 個順式作用元件，共97 個，除TATA-box 和CAAT-box 等啟動子基本元件外，還有光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件等（表3），其中光響應(yīng)元件的數(shù)量最多。

表3 菠蘿AcMADS41 基因啟動子順式作用元件類型Table 3 Types of cis-acting element of AcMADS41 gene promoter in pineapple

圖5 菠蘿AcMADS41 基因啟動子順式作用元件預(yù)測分析Fig.5 Prediction and analysis of cis-acting elements of AcMADS41 gene promoter in pineapple

2.3 菠蘿AcMADS41 基因的表達分析

從菠蘿基因組數(shù)據(jù)中搜索得到菠蘿花、葉、果、根4 個部位的AcMADS41基因的表達數(shù)據(jù)并分析，結(jié)果（圖6 A）發(fā)現(xiàn)該基因只在菠蘿花組織中高度表達，表明其可能與菠蘿花發(fā)育有關(guān)。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分析菠蘿AcMADS41在花芽發(fā)育過程中的表達情況，發(fā)現(xiàn)該基因在乙烯利處理后32 d 才開始變化，在處理后48 d 高度表達（圖6 B），推測該基因主要作用于菠蘿花器官發(fā)育階段。

圖6 菠蘿AcMADS41 基因表達分析Fig.6 Expression analysis of ACMADS41 in pineapple

利用qRT-PCR 對AcMADS41在不同組織部位和花器官中的相對表達量進行分析，以熱圖形式展示定量結(jié)果。由圖7 可以看出，AcMADS41在花器官-花柱中的表達量最高，且明顯高于其他花器官組成部分，其次在花瓣和雄蕊中也有部分表達量，推測AcMADS41的作用主要是參與菠蘿花柱的發(fā)育。

圖7 菠蘿AcMADS41 的組織特異性表達Fig.7 Specific expression of AcMADS41 in pineapple tissues

2.4 AcMADS41 蛋白互作預(yù)測分析

使用 String 在線網(wǎng)站對AcMADS41 蛋白與其他蛋白間的互作進行預(yù)測，以擬南芥作為參考，預(yù)測結(jié)果（圖8）顯示該蛋白可能與LFY、FYPP3、UFO、PI 等10 個蛋白進行互作。UFO 與LFY 功能聯(lián)系綜合得分相對較高，互作的可能性更大，推測該蛋白參與了花的發(fā)育。AcMADS41還可能與PI 和SUP 共表達。PI 與AP3 的同源性最高，在擬南芥中PI 與AP3 形成異源二聚體，共同參與花瓣和雄蕊的發(fā)育［24］。推測菠蘿中的AcMADS41 蛋白也有可能與PI 蛋白形成異源二聚體共同參與花的發(fā)育。

圖8 菠蘿AcMADS41 蛋白與其他蛋白的功能預(yù)測Fig.8 Function prediction of AcMADS41 protein and other proteins in pineapple

3 討論

花和果實發(fā)育的機理研究一直是植物界研究的重要方向，MADS-box 基因家族作為調(diào)控花果發(fā)育的一類關(guān)鍵基因近年來也備受關(guān)注。AP3 是MADS-box 家族MIKCC 亞族的一個分支，含有典型的MADS-box 和K-box 結(jié)構(gòu)域，屬于ABCDE開花模型中的B 類功能基因［17］，在擬南芥［12］、蘿卜［25］、番茄［26］、梅花［27］、蓮［28］等多種植物中已被證實參與調(diào)控花瓣和雄蕊的發(fā)育。但近年發(fā)現(xiàn)AP3基因不僅限于花瓣和雄蕊中表達。在蘭花中，高階SP 復(fù)合體（OAP3-1/OAGL6-1/OAGL6-1/OPI）調(diào)控萼片和花瓣的發(fā)育；OAP3和OAGL6基因的協(xié)同作用可能調(diào)控花被和唇瓣的顏色分化［29-30］。在藏紅花中，CsAP3基因參與花被和雄蕊的發(fā)育，是調(diào)節(jié)柱頭發(fā)育的重要基因［18，31］。在葡萄中，VvAP3在花瓣、心皮和雄蕊中均為高表達［32］。本研究從菠蘿花芽中克隆出一個AP3同源基因AcMADS41，通過保守域分析證實其含有典型MADS-box 和K-box 結(jié)構(gòu)域。通過與擬南芥DNA 結(jié)構(gòu)和7 個不同物種的AP3同源序列進行多序列分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列長度較短，但在DNA 結(jié)構(gòu)中3'UTR 序列長度較長。

通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因與油棕和海棗的親緣關(guān)系較近，菠蘿、油棕和海棗均為單子葉熱帶植物。油棕中AP3同源蛋白EgDEF1 通常在細胞內(nèi)形成DEF/GLO 異二聚體復(fù)合物，共同參與花器官的表達，目前已證實EgGLO2在雄花和雌花中均有表達，可見EgDEF1也可能參與雄花和雌花的形成［33］；石刁柏AoDEF基因則在雄蕊和內(nèi)部花被中表達［34］。

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)分析AcMADS41基因在菠蘿根、果、花和葉4 個部位的相對表達量，發(fā)現(xiàn)AcMADS41在花中的表達量最高，在其他3 個部位幾乎不表達，更加驗證了“AcMADS41參與菠蘿花的發(fā)育”這一推斷。B 類功能基因一般參與花瓣和雄蕊的形成，AcMADS41是AP3-Like 基因，分析其在菠蘿花芽發(fā)育不同階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其在成花后期表達量最高、在前期幾乎不表達，推測它可能參與花器官的形成。本研究發(fā)現(xiàn)AcMADS41在花器官-花柱中的表達量最高，其次在花瓣和雄蕊中也有表達，推測AcMADS41主要參與了菠蘿花柱的發(fā)育，這與藏紅花中的CsAP3基因功能［18，31］相似。

通過與其他蛋白質(zhì)的互作關(guān)系預(yù)測，發(fā)現(xiàn)AcMADS41與LFY、FYPP3、UFO、PI 等10 個蛋白可能進行互作，其中與UFO、LFY 蛋白互作的可能性更大。這些蛋白大多與成花相關(guān)，推測AcMADS41 蛋白在菠蘿成花過程中可起到除參與花器官形成外的其他作用，這為進一步研究菠蘿成花分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在菠蘿中克隆得到1 個新的AP3 全長基因AcMADS41，通過對AcMADS41進行一系列生物信息學(xué)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)AcMADS41含有MIKC 型MADS-box 家族特有的MADS-BOX和K-BOX 結(jié)構(gòu)域，其蛋白質(zhì)較穩(wěn)定。經(jīng)系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)菠蘿AcMADS41與海棗、油棕等熱帶單子葉植物中AP3 同源蛋白的親緣關(guān)系最近。AcMADS41啟動子中有19 種順式作用元件，除TATA-box 和CAAT-box 等啟動子基本元件外，光響應(yīng)元件的數(shù)量最多。經(jīng)基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，AcMADS41在花柱中相對表達量最高，推測AcMADS41在菠蘿花柱發(fā)育過程中起著重要作用。