基于Akt/mTOR及ERK/mTOR信號通路探究活心丸對心肌肥大大鼠自噬的影響

高展旺，張 昕，莫尊匯，廖弈秋，王羚酈*

基于Akt/mTOR及ERK/mTOR信號通路探究活心丸對心肌肥大大鼠自噬的影響

高展旺1，張 昕1，莫尊匯2, 3，廖弈秋2, 3，王羚酈1*

1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006 2.廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠，廣東 廣州 510515 3.廣東省化學藥原料與制劑關鍵技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510515

基于蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/mTOR信號通路探究活心丸對心肌肥大大鼠自噬的影響。SD大鼠ip鹽酸異丙腎上腺素誘導心肌肥大，分別給予活心丸和鹽酸普萘洛爾進行干預，檢測大鼠超聲心動圖，采用ELISA法檢測大鼠血清中心肌肥大指標心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）及炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察大鼠心肌組織病理變化；采用免疫組化法檢測大鼠心肌組織微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）蛋白表達情況；采用Western blotting法檢測大鼠心肌組織ERK、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和LC3蛋白表達情況。與模型組相比，各給藥組大鼠心肌肥大緩解，心肌組織病理損傷減輕，血清中ANP、BNP、TNF-α和IL-6水平顯著降低（＜0.01、0.001）；心肌組織中p-ERK/ERK、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），LC3 Ⅱ/LC3 I蛋白表達水平顯著降低（＜0.001）?；钚耐柰ㄟ^抑制自噬減輕大鼠心肌肥大，其機制可能與激活Akt/mTOR及ERK/mTOR通路相關。

活心丸；心肌肥大；自噬；蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路

心力衰竭是一種使心臟無法維持向機體供應含氧血液的衰弱狀況[1]。造成心力衰竭的原因可能為慢性心臟應激或損傷，包括壓力或容量超負荷（如高血壓、心臟瓣膜病）及心肌梗塞和遺傳疾病[2]。心臟最初為了恢復正常心血管功能，通過增加大小和質(zhì)量的方式來對超負荷或心臟損傷進行代償性反應，這種心臟擴大的現(xiàn)象通常被稱為病理性心肌肥大。心肌肥大雖可以有效維持心臟的正常功能，但持續(xù)病理性心肌肥大會導致心肌結構和功能異常，發(fā)生心臟重構，最終導致心力衰竭[3-4]。因此改善心肌肥大對預防心力衰竭至關重要。

近年來，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥在防治心血管疾病的治未病和防病變方面發(fā)揮著獨特優(yōu)勢[5]?；钚耐铻閲抑兴幈Ｗo品種、常用中醫(yī)藥方劑，人參、附子為君藥，發(fā)揮補氣、溫陽之功效；臣藥由靈芝、蟾酥、紅花組成，3味藥共行通經(jīng)活血之效；同時配以4味動物藥，達到解毒、醒神、鎮(zhèn)心、定志、安魂的作用；冰片作為佐使藥，發(fā)揮通竅開經(jīng)絡、引藥透達的作用，在臨床上已廣泛用于治療心力衰竭及冠心病[6-8]。但其治療心肌肥大的機制未見明確報道。

自噬是維持心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要生理活動，主要利用溶酶體消化損傷、衰老或過量的細胞質(zhì)物質(zhì)如細胞器和長壽蛋白[9]。基礎自噬對于維持細胞穩(wěn)態(tài)至關重要，而過度的自噬活動會加劇心臟肥大，并可能導致心力衰竭的發(fā)生[1]。抑制過度的自噬活動已成為一種新穎且有前景的治療心肌肥大策略[10-11]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路與自噬密切相關。因此，本研究旨在探究活心丸是否通過作用于MAPK和PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)自噬，進而抑制心肌肥大，為活心丸治療心肌肥大及相關心血管疾病提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學分析

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmspsearch.php）和BATMAN數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman）收集活心丸的主要活性成分和靶點。以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為條件，篩選TCMSP數(shù)據(jù)庫中活心丸的活性成分；以Score cutoff≥39為條件，篩選BATMAN數(shù)據(jù)庫中活心丸動物藥的活性成分。

從GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中篩選心肌肥大相關的靶點。使用Venn圖獲得活心丸活性成分和心肌肥大的交集靶點，利用R語言進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，對KEGG通路富集分析前30個條目進行可視化分析。

1.2 體內(nèi)驗證實驗

1.2.1 動物 SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（粵）2018-0002。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學中藥學院動物實驗室，溫度（25±2）℃，濕度60%～70%，人工12 h光/暗循環(huán)（8: 00～20: 00），動物喂食標準為大鼠標準飼料和無菌水。動物實驗經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（批準號ZYD-2021-074）。

1.2.2 藥品與試劑 鹽酸異丙腎上腺素（質(zhì)量分數(shù)99.0%，批號C10935510）購自上海麥克林生化科技有限公司；普萘洛爾（批號2020117）購自天津力生制藥股份有限公司；活心丸（批號1190002）購自廣州白云山制藥總廠；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）抗體、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體、p-mTOR抗體、微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC3B）抗體、β-actin抗體和HPR標記的二抗購自美國Affinity公司；BCA蛋白定量測定試劑盒（批號BB20101）購自貝博公司；心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號分別為MM-21097R2、MM-0060M1、MM-0180R1、MM-0190R1。

1.2.3 儀器 Vevo 2100型超高分辨率小動物超聲實時影像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）；D3024R型高速冷凍離心機（美國Scilogex公司）；Eclipse Ci-L型正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon公司）；JJ-12J型脫水機、RM2016型切片機、JB-L5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；JB-P5型包埋機（上海徠卡儀器有限公司）。

1.2.4 動物分組和造模 60只SD大鼠適應性飼養(yǎng)3 d，隨機分為對照組、模型組、普萘洛爾（40 mg/kg）組和活心丸低、中、高劑量（12、24、48 mg/kg，分別相當于1、2、4倍臨床等效劑量）組，每組10只。模型組及各給藥組ip鹽酸異丙腎上腺素（15 mg/kg），對照組ip等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d，導致大鼠心肌肥大。造模成功后，各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.5 超聲心動圖檢測 末次給藥前禁食24 h，末次給藥后，大鼠吸入4.5%異氟烷氣體進行麻醉，前胸部剃毛備皮，酒精棉球消毒。取胸骨旁左室短軸切面，由二維超聲引導M型曲線并進行測量。測量指標包括超聲心動圖圖像、左心室前壁厚度和左心室后壁厚度。

1.2.6 血清中心肌肥大標志物（ANP、BNP）及炎癥因子（TNF-α、IL-6）水平的檢測 大鼠ip戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，按照試劑盒說明書測定血清中ANP、BNP、TNF-α和IL-6水平。

1.2.7 臟器系數(shù)的測定 采血結束后，迅速將大鼠心臟組織及脛骨取出，以預冷的PBS溶液洗凈，吸水紙吸干后，稱定心臟質(zhì)量，測量脛骨長度，計算心臟系數(shù)，即心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、左心室質(zhì)量/體質(zhì)量和心臟質(zhì)量/脛骨長度。

1.2.8 心肌組織病理變化檢測 心臟于4%多聚甲醛中固定，留取左室心肌組織，濾紙拭干，快速剪取左室心尖部心肌組織，于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片（厚4 μm），分別進行蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色，于顯微鏡下觀察心臟病理變化。

1.2.9 免疫組化法檢測心肌組織LC3蛋白表達情況 取心臟組織切片，裝片至載玻片，于40 ℃溫水中放置，撈出后于37 ℃烘箱中晾干。載玻片依次浸入二甲苯、梯度乙醇中脫蠟10 min，水洗后，加入3% H2O2封閉10 min，水洗2次，檸檬酸緩沖液煮3 min，冷卻至室溫，水洗2次，PBS溶液浸泡2次，每次5 min。加入正常山羊血清，于37 ℃烘箱中封閉30 min，加入LC3抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜；用PBS溶液洗滌3次，每次5 min，加入二抗，37 ℃孵育1 h；用PBS溶液洗滌后，加入鏈霉親和素-生物素復合物（1∶100），37 ℃孵育30 min，加入DAB顯色，并用蘇木精復染。于光學顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro plus軟件分析。

1.2.10 Western blotting法檢測心肌組織ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3B蛋白表達情況 取大鼠左心室心臟組織，加入含1% PMSF的裂解液后，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入無蛋白快速封閉液溶液封閉，TBST洗脫5次，每次5 min，分別加入ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3B和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，加入ECL顯色劑顯影，采用Image軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.2.11 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析處理，數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用單因素方差（One way ANOVA）分析，滿足方差齊性則用LSD分析，若不滿足方差齊性則用Dunnett3分析。

2 結果

2.1 網(wǎng)絡藥理學分析

活心丸活性成分和心肌肥大共有161個交集靶點，選擇前30條顯著富集的KEGG通路，如圖1所示，富集的通路包括糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）- AGE受體（receptor of AGEs，RAGE）信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、MAPK信號通路和PI3K/Akt信號通路。MAPK信號通路和PI3K/Akt信號通路作為自噬的上游信號通路，可以通過磷酸化多種底物，調(diào)控自噬。

圖1 活心丸活性成分-心肌肥大交集靶點的KEGG通路富集分析(前30)

2.2 活心丸對心肌肥大大鼠超聲心動圖及心臟系數(shù)的影響

如圖2、3所示，與對照組比較，模型組大鼠左心室前壁厚度、左心室后壁厚度、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、左心室質(zhì)量/體質(zhì)量和心臟質(zhì)量/脛骨長度顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠左心室前壁、左心室后壁、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、左心室質(zhì)量/體質(zhì)量和心臟質(zhì)量/脛骨長度顯著降低（＜0.05、0.01）。

2.3 活心丸對心肌肥大大鼠血清中ANP、BNP、TNF-α和IL-6水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中ANP、BNP、TNF-α和IL-6水平顯著升高（＜0.01、0.001）；與模型組相比，各給藥組大鼠血清中ANP、BNP、TNF-α和IL-6水平顯著降低（＜0.01、0.001）。表明活心丸具有減輕心肌肥大的作用。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下同

圖3 活心丸對心肌肥大大鼠心臟系數(shù)的影響(, n = 10)

圖4 活心丸對心肌肥大大鼠血清中ANP、BNP、IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 10)

2.4 活心丸對心肌肥大大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色（圖5）結果顯示，對照組大鼠心肌細胞排列有序，細胞核在中心。模型組心肌細胞肥大，呈方形，細胞核被溶解，細胞邊界不清晰，大量心肌細胞出現(xiàn)死亡。各給藥組心肌細胞損傷減輕，細胞核位置清晰，壞死細胞較少。Masson染色結果顯示，模型組心肌纖維化面積較對照組大，各給藥組心肌纖維化面積明顯減少。以上結果表明活心丸可以改善鹽酸異丙腎上腺素誘導的心肌肥大大鼠的心肌組織結構并減少心肌纖維化。

箭頭表示心肌細胞損傷（肥大、炎癥浸潤、心肌纖維化）

2.5 活心丸對心肌肥大大鼠心肌組織LC3蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織LC3陽性表達增多（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠心肌組織LC3陽性表達減少（＜0.01、0.001），表明活心丸能夠抑制心肌肥大大鼠心肌細胞自噬。

2.6 活心丸對心肌肥大大鼠心肌組織ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和LC3蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中p-ERK/ERK、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），LC3 Ⅱ/LC3 I蛋白表達水平顯著升高（＜0.001）；與模型組相比，各給藥組大鼠心肌組織中p-ERK/ERK、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），LC3 Ⅱ/LC3 I蛋白表達水平顯著降低（＜0.001）。表明活心丸對異丙腎上腺素誘導的心肌細胞過度自噬的抑制作用，可能與激活Akt/mTOR和ERK/mTOR通路有關。

3 討論

病理性心肌肥大是心血管發(fā)病率和死亡率增加的一種獨立危險因素，最終會發(fā)展成心力衰竭[11-12]。心肌肥大的發(fā)病機制十分復雜，越來越多的證據(jù)表明，平衡自噬活動可以預防心臟肥大[13]。自噬從低等真核生物到哺乳動物都是保守的，是一種正常的生理降解機制。它是一種重要的分解代謝降解過程，可消除多余蛋白質(zhì)與細胞器，基礎自噬在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[9,14]。在橫向主動脈縮窄誘導的心肌肥厚和心力衰竭小鼠模型中，心肌細胞中的自噬標志物顯著減少，但在接下來的幾周內(nèi)隨著心臟肥大的形成而增加[15]。多種心肌肥厚動物模型中均出現(xiàn)自噬激活[16-18]。調(diào)節(jié)自噬水平涉及AMP 激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路、B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）蛋白家族和mTOR通路等多種信號通路[14]。其中，mTOR作為自噬的主要調(diào)節(jié)劑，對自噬的調(diào)節(jié)本質(zhì)上也是生長與代謝之間的調(diào)節(jié)[19]。因此，本研究主要基于MAPK和PI3K/Akt信號通路，探究活心丸調(diào)節(jié)自噬進而抑制心肌肥大的作用機制。

圖6 活心丸對心肌肥大大鼠心肌組織LC3蛋白表達的影響(, n = 3)

Akt是將生長因子信號連接到下游通路的中心節(jié)點，與自噬誘導有關。在生長因子存在的情況下，Akt磷酸化結節(jié)性硬化復合體1/2（tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）、富含脯氨酸Akt1底物蛋白（proline-rich Akt1 substrate of 40 kDa，PRAS40）、糖原合成酶激酶（glycose sythase kinase3，GSK3）、FoxO等多種底物，導致這些蛋白質(zhì)失活。相反，生長因子限制可能導致這些底物的激活，發(fā)生隨后的自噬啟動[1,9]。ERK會轉移到細胞核并磷酸化多種底物包括環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）和Ets樣蛋白1（Ets-like protein 1，Elk1）等轉錄因子，核靶標的激活或抑制均會導致細胞的生長、增殖以及死亡[21]。本研究利用異丙腎上腺素造成大鼠心肌肥大，然后給予活心丸進行早期心肌肥大病癥治療。研究結果表明，活心丸可以顯著降低大鼠心肌肥大程度和心肌纖維化，對心肌細胞有明顯的保護作用，進一步防止由病理性心肌肥大發(fā)展為心力衰竭。網(wǎng)絡藥理學結果表明，活心丸可以通過作用于MAPK和PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗心肌肥大作用。PI3K/Akt和MAPK通路均為mTOR的上游調(diào)節(jié)因子，能夠通過激活mTOR信號通路抑制細胞自噬活動[20]。本研究結果表明，活心丸可以上調(diào)心肌肥大大鼠心肌組織p-ERK、p-Akt蛋白表達水平，進而調(diào)控底物p-mTOR蛋白表達水平，下調(diào)心肌組織中LC3 II蛋白表達水平，從而抑制自噬，減輕心肌肥大。

綜上所述，活心丸可以通過激活Akt/mTOR和MAPK/ERK/mTOR信號通路抑制自噬，從而調(diào)節(jié)病理性心臟肥大。同時，活心丸與自噬之間的相互作用為減輕心肌肥大提供了新的策略，也證實了活心丸具有多靶點的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Huoxin Pills on autophagy of cardiac hypertrophy rats based on Akt/mTOR and ERK/mTOR signaling pathways

GAO Zhan-wang1, ZHANG Xin1, MO Zun-hui2, 3, LIAO Yi-qiu2, 3, WANG Ling-li1

1.School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2.Baiyunshan Pharmaceutical General Factory, Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co., Ltd., Guangzhou 510515, China 3.Key Laboratory of Key Technology Research on Chemical Raw Materials and Preparations of Guangdong Province, Guangzhou 510515, China

To explore the effect of Huoxin Pills (活心丸) on autophagy in rats with cardiac hypertrophy based on protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) and extracellular regulated protein kinases (ERK)/mTOR signaling pathways.SD rats were ip isoproterenol to induce cardiac hypertrophy, Huoxin Pills and propranolol hydrochloride were given for intervention, echocardiography of rats was detected, ELISA method was used to detect levels of cardiac hypertrophy indicators atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP) and inflammatory factors TNF-α and IL-6 in serum of rats; HE and Masson staining were used to observe the pathological changes of myocardial tissue in rats; Immunohistochemistry was used to detect microtubule associated protein 1 light chain 3 (LC3) protein expression in myocardial tissue of rats; Western blotting was used to detect the protein expressions of ERK, phosphorylated ERK (p-ERK), Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR and LC3 in myocardial tissue of rats.Compared with model group, myocardial hypertrophy of rats in each administration group was relieved, pathological damage of myocardial tissue was alleviated, and levels of ANP, BNP, TNF-α and IL-6 in serum were significantly decreased (< 0.01, 0.001); Protein expression levels of p-ERK/ERK, p-Akt/Akt and p-mTOR/mTOR were significantly increased (< 0.05, 0.01), and LC3 II/LC3 I protein expression level was significantly decreased (< 0.001).Huoxin Pills can reduce cardiac hypertrophy in rats by inhibiting autophagy, and its mechanism may be related to the activation of Akt/mTOR and ERK/mTOR pathways.

Huoxin Pills; cardiac hypertrophy; autophagy; protein kinase B/mTOR pathway; extracellular regulated protein kinases/mTOR pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)05 - 1442 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.019

2021-11-03

廣州市科技計劃項目（202103000049）

高展旺（1998—），男，碩士，研究方向為中藥學。Tel: 16624670427 E-mail: 20201110890@stu.gzucm.edu.cn

通信作者：王羚酈，女，碩士生導師，副研究員，主要從事中藥學及其藥理學研究。E-mail: wlingli@gzucm.edu.cn

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