銀花青蒿梔子方抗A6型柯薩奇病毒活性成分的分離

李 菲，趙新亞#，趙雪梅，畢研平，李 娟，崔清華，田景振

銀花青蒿梔子方抗A6型柯薩奇病毒活性成分的分離

李 菲1，趙新亞1#，趙雪梅1，畢研平1，李 娟1，崔清華2，田景振2

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院，新發(fā)傳染病病因流行病學(xué)重點(diǎn)實驗室，山東 泰安 271016 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

研究銀花青蒿梔子方（Yinhua Qinghao Zhizi Description，YQZ）抗A6型柯薩奇病毒（Coxsavirus A6，CV-A6）的活性成分。對YQZ進(jìn)行提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定，以病毒抑制率為指標(biāo)追蹤其抗CV-A6活性成分，利用Discovery Studio2017軟件將其與受體蛋白進(jìn)行分子對接。YQZ醇提物的石油醚部位分離得到的青蒿酸和青蒿素、正丁醇部位分離得到的梔子苷、綠原酸和木犀草苷對CV-A6的抑制率顯著高于陽性對照利巴韋林（＜0.05、0.01），上述成分分子和CV-A6衣殼蛋白VP1之間均存在多個氫鍵、范德華引力等作用，親和力大。YQZ中的青蒿酸、青蒿素、梔子苷、綠原酸和木犀草苷具有良好的抗CV-A6活性，可能與抑制病毒衣殼蛋白VP1有關(guān)。

銀花青蒿梔子方；A6型柯薩奇病毒；抗病毒；活性成分；分子對接；青蒿酸；青蒿素；梔子苷；綠原酸；木犀草苷

自2008年A6型柯薩奇病毒（coxsavirus A6，CV-A6）首次引起手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）暴發(fā)流行以來，CV-A6感染致HFMD發(fā)病率呈上升趨勢，并成為部分地區(qū)的主要流行株[1-3]。但是，國內(nèi)外對HFMD病原體的研究主要集中于腸道病毒71型（enterovirus，EV71）和CV-A16，圍繞CV-A6的相關(guān)研究匱乏，對于抗CV-A6藥物的研究迫在眉睫。

清熱解毒類中藥制劑在病毒性感染疾病的治療上不僅能抗病毒、消炎、退熱，還能提高人體免疫力，具有多靶點(diǎn)治療、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)[4-5]。銀花青蒿梔子方（Yinhua Qinghao Zhizi Description，YQZ）源于名老中醫(yī)經(jīng)驗方，組方為金銀花3～15 g、青蒿6～25 g和梔子3～12 g，具有清熱解毒、疏風(fēng)解表之功效[6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)該方開發(fā)的中藥制劑對甲型H1N1流感病毒、新型冠狀病毒及腸道病毒EV71和CV-A16等均有一定程度的抑制作用[7-9]。

基于前期研究發(fā)現(xiàn)YQZ具有抗CV-A6作用，本研究以活性追蹤為主線，將YQZ醇提物進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定，并采用分子對接技術(shù)分析活性成分和病毒靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，以期明確YQZ抗CV-A6的活性成分，并為后期作用機(jī)制研究和制劑制備、質(zhì)量控制及藥動學(xué)研究提供目標(biāo)成分。

1 材料與儀器

1.1 病毒和細(xì)胞

CV-A6引自中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所毒種室；人橫紋肌瘤RD細(xì)胞，引自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所病毒研究室。

1.2 藥材

金銀花（批號20170306）、青蒿（批號20170306）、梔子（批號20170306）均購自泰安市金泰聯(lián)藥店，經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院高紅莉教授鑒定分別為忍冬科忍冬屬植物忍冬Thunb.的干燥花蕾、菊科蒿屬植物黃花蒿L(fēng).的干燥地上部分、茜草科梔子屬植物梔子Elis的干燥果實。

1.3 試劑

MEM培養(yǎng)基（Gbico公司，批號10098-143）；胎牛血清（Gbico公司，批號10098-143）；CCK-8（聯(lián)科生物，批號6366831）；柱色譜硅膠（200～300 目，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；D101大孔樹脂（天津海光化工有限公司）；聚酰胺（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Sephadex LH-20凝膠（GE公司）；利巴韋林（ribavirin，RBV，中國食品藥品檢定研究院，批號140629-201713）。

1.4 儀器

植物粉碎機(jī)FW-177型（天津市泰新特儀器有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；倒置顯微鏡（尼康株式會社）；Infinite M 200 Pro酶標(biāo)儀（Tecan公司）；Varian Mercury-Plus 400 MHz型核磁共振儀（美國Varian公司）。

2 方法

2.1 提取與分離

按3∶15∶2比例稱取金銀花、青蒿、梔子粗粉共計6.0 kg，加入8倍量75%乙醇浸泡2 h，室溫超聲提取2次，每次20 min。合并提取液，40 ℃減壓回收乙醇得粗提液，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取得石油醚部位（petroleum ether extract，PEE）、醋酸乙酯部位（ethyl acetate extract，EAE）、正丁醇部位（-butanol extract，BE）和水部位（water extract，WE）。

采用硅膠柱色譜法分離PEE（100 g），以石油醚-醋酸乙酯（10∶0→7∶3）梯度洗脫，TLC分析合并得11個組分Fr.1～11。組分Fr.8和Fr.10具有抗病毒活性，采用硅膠柱色譜法分離。組分Fr.8（1.17 g）以石油醚-醋酸乙酯（95∶5→90∶10）梯度洗脫，合并相同組分，其中Fr.8-2出現(xiàn)結(jié)晶，經(jīng)石油醚重結(jié)晶得化合物1（23.1 mg）。組分Fr.10（2.63 g）以石油醚-醋酸乙酯（90∶10→80∶20）梯度洗脫，合并相同組分，其中Fr.10-3出現(xiàn)結(jié)晶，經(jīng)丙酮重結(jié)晶得化合物2（35.7 mg）。

采用硅膠柱色譜法分離EAE（166 g），以二氯甲烷-甲醇（10∶0→7∶3）梯度洗脫，TLC分析合并得9個組分Fr.1～9。其中，F(xiàn)r.3、Fr.5和Fr.9具有抗CV-A6活性，F(xiàn)r.3活性小，F(xiàn)r.9與BE的成分相似，對Fr.5進(jìn)行分離。采用硅膠柱色譜法分離Fr.5（11.2 g），以二氯甲烷-甲醇（95∶5→80∶20）梯度洗脫，得組分Fr.5-1～5-5。組分Fr.5-4具有抗病毒活性，采用Sephadex LH-20凝膠柱、以甲醇為洗脫液進(jìn)行分離，得化合物3（19.0 mg）。

BE（175 g）經(jīng)D-101大孔吸附樹脂依次用水及30%、60%、95%乙醇溶液洗脫，繼續(xù)分離30%乙醇洗脫物（Fr.1）和60%乙醇洗脫物（Fr.2）。Fr.1（39 g）采用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（90∶10→80∶20）梯度洗脫，得到5個組分Fr.1 -1～1-5。Fr.1-2經(jīng)醋酸乙酯重結(jié)晶得到化合物4（1.1 g），F(xiàn)r.1-4經(jīng)甲醇重結(jié)晶得到化合物5（0.2 g）。Fr.2（75 g）采用聚酰胺柱色譜分離，以50→75%乙醇梯度洗脫，合并相同組分，F(xiàn)r.2-2經(jīng)95%乙醇重結(jié)晶得化合物6（36.0 mg）。

2.2 細(xì)胞毒性測定

在96孔板接種5×104/mL的RD細(xì)胞，每孔100 μL。細(xì)胞形成單層后，將PEE、EAE和BE分離得到組分和單體分別加二甲亞砜和PBS溶解，再用維持液進(jìn)行倍比稀釋，接種于細(xì)胞，每孔100 μL。置于37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，正常細(xì)胞對照組加入同體積維持液。采用CCK8法測定波長450 nm的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率，Probit回歸法確定半數(shù)毒性濃度（median toxic concentration，TC50）和最大無毒濃度（maximal atoxic concentration，TC0）。

2.3 抗病毒活性測定

在96孔板接種RD細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄液。將藥液和病毒液1∶1混合，加到細(xì)胞中，每孔100 μL [藥物濃度=TC0，感染復(fù)數(shù)（MOI）＝1]。正常對照組加入同體積維持液，模型組加入維持液和病毒液的1∶1混合液，陽性對照組加入RBV溶液（200 μg/mL）和病毒液的1∶1混合液。置于37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。棄液，加維持液繼續(xù)孵育至48 h。顯微鏡下觀察CPE，CCK8法測定細(xì)胞存活率，計算病毒抑制率。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用表示，以＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義，＜0.01表示顯著性差異。

2.5 活性成分與病毒靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用

通過藥物設(shè)計軟件Discovery Studio2017 R2進(jìn)行病毒蛋白靶點(diǎn)和潛在目標(biāo)化合物的分子對接，對化合物和蛋白之間的相互作用進(jìn)行分析。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）中下載標(biāo)記為5YHQ的CV-A6病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)（virus-like particle，VLP），選擇衣殼蛋白VP1作為靶點(diǎn)蛋白。VP1的surface-exposed loops和C端結(jié)構(gòu)是主要的免疫原性位點(diǎn)[10]，作為分子對接的結(jié)合部位。對接前將靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水、加氫處理，將化合物的二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成三維結(jié)構(gòu)，作為配體與受體蛋白進(jìn)行對接。

3 實驗結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶（石油醚）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 12.42 (1H, s, 12-COOH), 6.17 (1H, brs, H-1), 5.40 (1H, brs, H-13), 4.94 (1H, brs, H-13), 2.71 (1H, d,= 12.0 Hz, H-3), 2.59 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-3), 1.94 (1H, d,= 12.0 Hz, H-10), 1.86 (1H, d,= 6.0 Hz, H-5), 1.75 (1H, d,= 12.0 Hz, H-4), 1.69 (1H, d,= 12.0 Hz, H-8), 1.66 (1H, m, H-9), 1.53 (1H, dd,= 14.1, 7.8 Hz, H-6), 1.40 (1H, m, H-8), 1.56 (3H, s, H-14), 1.33 (1H, d,= 8.2 Hz, H-4), 1.27 (1H, dd,= 12.5, 3.1 Hz, H-7), 1.03 (1H, dd,= 11.6, 3.4 Hz, H-7), 0.87 (3H, d,= 5.8 Hz, H-15)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 173.3 (C-12), 148.8 (C-2), 139.4 (C-11), 128.7 (C-1), 125.3 (C-13), 46.9 (C-10), 46.1 (C-9), 42.6 (C-5), 39.9 (C-6), 32.4 (C-4), 31.1 (C-8), 30.7 (C-3), 30.4 (C-7), 28.8 (C-14), 24.8 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比基本一致[11]，故鑒定化合物1為青蒿酸。

化合物2：白色針狀結(jié)晶（丙酮）；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.13 (1H, s, H-5), 3.16 (1H, dd,= 7.1, 5.5 Hz, H-11), 2.26 (1H, m, H-3α), 2.05 (1H, dd,= 17.4, 4.1 Hz, H-3?), 1.93 (1H, dd,= 7.1, 3.9 Hz, H-2α), 1.72 (1H, m, H-8α), 1.64 (1H, dd,= 13.0, 3.3 Hz, H-9?), 1.50 (1H, m, H-10), 1.36 (3H, s, H-15), 1.32 (1H, m, H-2?), 1.29 (1H, m, H-1), 1.15 (1H, dd,= 13.1, 2.9 Hz, H-8?), 1.07 (3H, d,= 7.3 Hz, H-13), 0.92 (3H, d,= 6.3 Hz, H-14)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 172.0 (C-12), 105.2 (C-4), 93.8 (C-5), 80.1 (C-6), 50.0 (C-1), 44.4 (C-7), 36.6 (C-10), 36.0 (C-3), 33.6 (C-9), 33.0 (C-11), 25.4 (C-15), 24.9 (C-2), 22.9 (C-8), 20.1 (C-14), 12.9 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比基本一致[12]，故鑒定化合物2為青蒿素。

化合物3：黃色結(jié)晶（甲醇）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 12.98 (1H, s, 5-OH), 10.08 (3H, brs, 7, 3′, 4′-OH), 7.43 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 7.41 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.90 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.67 (1H, s, H-3), 6.45 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 182.1 (C-4), 164.6 (C-7), 164.3 (C-2), 162.7 (C-9), 161.9 (C-5), 157.7 (C-4′), 150.1 (C-3′), 121.9 (C-6′), 119.4 (C-1′), 116.5 (C-5′), 113.8 (C-2′), 104.1 (C-10), 103.3 (C-3), 99.3 (C-6), 94.3 (C- 8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比基本一致[13]，故鑒定化合物3為木犀草素。

化合物4：白色結(jié)晶性粉末；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.47 (1H, d,= 0.9 Hz, H-3), 6.09 (1H, dd,= 5.6, 3.0 Hz, H-6), 5.68 (1H, d,= 3.0 Hz, H-7), 5.12 (1H, d,= 6.9 Hz, H-1), 4.53 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1')；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 167.3 (C-11), 152.0 (C-3), 144.5 (C-8), 125.9 (C-7), 111.4 (C-4), 99.0 (C-1′), 96.2 (C-1), 77.7 (C-3′), 77.1 (C-5′), 73.7 (C-2′), 70.4 (C-4′), 61.4 (C-6′), 59.8 (C-10), 51.5 (-OCH3), 46.3 (C-9), 38.4 (C-6), 34.9 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比基本一致[14]，故鑒定化合物4為梔子苷。

化合物5：白色粉末；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 12.40 (1H, s, 5′-COOH), 9.57 (1H, s, 4-OH), 9.13 (1H, s, 3-OH), 7.44 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.04 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.98 (1H, dd,= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.76 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.13 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 5.07 (1H, m, H-1′), 3.93 (1H, m, H-2′), 3.57 (1H, m, H-3′), 2.02～1.97 (4H, m, H-4′, 6′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 175.3 (C-7), 166.1 (C-9′), 148.8 (C-4′), 146.0 (C-3′), 145.4 (C-7′), 126.0 (C-1′), 121.8 (C-6′), 116.2 (C-5′), 115.2 (C-2′), 114.7 (C-8′), 73.9 (C-3), 71.3 (C-4), 70.8 (C-5), 68.5 (C-1), 37.6 (C-6), 36.7 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比基本一致[15]，故鑒定化合物5為綠原酸。

化合物6：黃色粉末；1H-NMR (400 MHz, CDCl3):12.98 (1H, s, 5-OH), 7.62～7.44 (1H, m, H-6′), 7.43 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2′), 6.91 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5′), 6.79 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 6.75 (1H, s, H-3), 6.45 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 5.09 (2H, d,= 7.3 Hz, H-1″), 3.18～3.72 (4H, m, H-2″～5″)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 182.3 (C-4), 164.9 (C-2), 163.4 (C-7), 161.6 (C-5), 157.4 (C-9), 150.4 (C-4′), 146.2 (C-3′), 121.8 (C-1′), 119.6 (C-6'), 116.4 (C-5′), 114.0 (C-2′), 105.8 (C-10), 103.6 (C-3), 100.3 (C-6), 100.0 (C-8), 95.2 (C-1″), 77.6 (C-5″), 76.8 (C-3″), 73.6 (C-2″), 70.0 (C- 4″), 61.1 (C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對比基本一致[16]，故鑒定化合物6為木犀草苷。

3.2 細(xì)胞毒性研究

YQZ醇提物的各萃取部位及分離得到的組分和單體對RD細(xì)胞的TC50和TC0見表1。

3.3 抗病毒活性研究

YQZ醇提物的PEE、EAE和BE體外對CV-A6的抑制率均大于對照RBV，PEE和對照組之間存在顯著性差異（＜0.05），WE無活性。PEE分離得到的組分Fr.8、Fr.10和分離得到的化合物1（青蒿酸）和2（青蒿素）對CV-A6的抑制率顯著高于RBV（＜0.05、0.01）。EAE中分離得到組分Fr.5及其分離得到的Fr.5-4病毒抑制率高于RBV，分離得到的化合物3（木犀草素）活性較低。BE分離得到的Fr.1及化合物4（梔子苷）、5（綠原酸）和6（木犀草苷）對CV-A6的抑制率顯著高于對照RBV（＜0.01）。見圖1。

表1 對RD細(xì)胞的細(xì)胞毒性

圖1 石油醚部位(A)、醋酸乙酯部位(B) 和正丁醇部位(C) 對CV-A6的抑制率()

3.4 活性成分與病毒靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用

活性成分作為配體與受體蛋白VP1進(jìn)行分子對接，相關(guān)參數(shù)見表2。表2中各成分和靶蛋白分子對接的絕對自由能和Lib Dock得分均較高，說明其與蛋白結(jié)合緊密。分子對接的二維和三維結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。

表2 分子對接的相關(guān)參數(shù)

由圖2可見，綠原酸分子和VP1蛋白的ASN、TYR等6個氨基酸殘基之間存在氫鍵作用，梔子苷分子與MET、ASP等7個氨基酸之間形成氫鍵，親和力強(qiáng)。青蒿酸分子和氨基酸ARG、GLU之間形成氫鍵，和ASP、TYR等多個殘基之間存在范德華引力。木犀草苷分子與ASN、CYS等5個氨基酸之間存在氫鍵作用，同時與其他氨基酸存在碳?xì)滏I、范德華引力、Pi-Sulfur等相互作用。上述成分分子與氨基酸殘基之間的相互作用使二者具有良好的親和力，使其起到抑制VP1蛋白的作用。

4 討論

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥發(fā)揮治療作用的化學(xué)成分（群）[17]，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是闡明中藥作用機(jī)制的關(guān)鍵，是優(yōu)化制劑處方工藝的依據(jù)，是保證質(zhì)量控制具有科學(xué)性的核心，是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化和國際化的重要研究內(nèi)容[18-20]。本研究將YQZ醇提物采用萃取、硅膠柱色譜、大孔吸附樹脂、凝膠柱色譜、聚酰胺柱色譜、重結(jié)晶等多種方式進(jìn)行分離，通過測定分離產(chǎn)物的病毒抑制率進(jìn)行活性追蹤。結(jié)果表明YQZ醇提物的PEE、EAE和BE具有良好的抗CV-A6活性，WE基本無活性，這和前期研究中水提物和醇提物的體外抗病毒活性篩選結(jié)果是一致的。PEE和BE分別分離得到的青蒿酸和青蒿素、木犀草苷、綠原酸和梔子苷具有良好的抗CV-A6活性。

CV-A6屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，病毒顆?；蚪M編碼的多聚蛋白水解為3個蛋白前體（P1～P3）。P1進(jìn)一步水解為4個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4），共同構(gòu)成病毒衣殼。VP4位于病毒衣殼內(nèi)側(cè)，VP1～VP3位于衣殼表面，是抗原決定簇存在的主要部位。其中，VP1的surface-exposed loops和C端結(jié)構(gòu)是主要的免疫原性位點(diǎn)，作為分子對接的結(jié)合部位。分子對接結(jié)果表明，青蒿酸、青蒿素、綠原酸、梔子苷和木犀草苷分子均與CV-A6衣殼蛋白存在多個氫鍵、范德華引力等作用，生成穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，青蒿酸、青蒿素、綠原酸、梔子苷和木犀草苷成分是YQZ抗CV-A6的重要活性成分，其抗病毒作用可能與抑制衣殼蛋白有關(guān)。

近年來，清熱解毒類中藥及其活性成分的抗病毒作用和在治療病毒感染性疾病中的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注。研究結(jié)果表明，中藥青蒿中的青蒿素及其衍生物具有抗病毒活性，其中青蒿素具有抑制巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒等多種病毒的作用[21-22]。中藥梔子和金銀花均為常用清熱解毒藥，梔子中的主要成分梔子苷具有抗甲型H1N1流感病毒和EV71活性[23-24]；綠原酸為金銀花的主要成分之一，對EV71、腺病毒、HBV、HSV等多種病毒具有抑制作用[25-26]。迄今為止，尚未有上述活性成分抗CV-A6作用的報道。因此，對上述成分抗CV-A6的體內(nèi)作用及其他作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

1-綠原酸 2-梔子苷 3-青蒿酸 4-青蒿素 5-木犀草苷

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 樊曄, 田新貴, 張日新.我國手足口病分子流行病學(xué)及防控管理措施探討 [J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2018, 38(2): 139-148.

[2] 李方, 許紅梅.手足口病柯薩奇病毒A6和A10流行病學(xué)特點(diǎn) [J].兒科藥學(xué)雜志, 2017, 23(7): 60-63.

[3] 金美彤.浙江省手足口病流行病學(xué)和病原學(xué)特征分析 [D].杭州: 浙江大學(xué), 2015.

[4] 劉旭.清熱解毒中藥的抗病毒作用芻議 [J].國醫(yī)論壇, 2012, 27(4): 39.

[5] 邢世華, 李曉波.清熱解毒類中藥抗病毒活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展 [J].中國藥理學(xué)通報, 2014, 30(4): 464-468.

[6] 張平.一種用于清熱解毒的藥物及其制備方法: 中國, CN1374126A [P].2012-01-04.

[7] 王振中, 鮑琳琳, 孫蘭, 等.熱毒寧注射液抗甲型H1N1流感病毒作用機(jī)制研究 [J].中草藥, 2014, 45(1): 90-93.

[8] 常秀娟, 孫曉萍, 胡晗緋, 等.熱毒寧注射液對EV71病毒感染Vero細(xì)胞和乳鼠的作用及其機(jī)制研究 [J].中草藥, 2018, 49(9): 2097-2102.

[9] 陳元堃, 曾奧, 羅振輝, 等.熱毒寧注射液治療新型冠狀病毒肺炎的活性成分與潛在作用機(jī)制初探 [J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報, 2020, 36(3): 381-387.

[10] Chen J H, Zhang C, Zhou Y,.A 3.0-angstrom resolution cryo-electron microscopy structure and antigenic sites of coxsackievirus A6-like particles [J]., 2018, 92(2): e01257-e01217.

[11] 陳靖, 周玉波, 張欣, 等.黃花蒿幼嫩葉的化學(xué)成分 [J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2008, 25(11): 866-870.

[12] 黃敬堅, Nicholls K M, 陳朝環(huán), 等.青蒿素的二維核磁共振研究 [J].化學(xué)學(xué)報, 1987, 45(3): 305-308.

[13] 胡峻, 石任兵, 張援虎, 等.荊芥穗化學(xué)成分研究 [J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2006, 29(1): 38-40.

[14] 李敏, 胡慶華, 李磊, 等.梔子柏皮湯化學(xué)成分研究 [J].時珍國醫(yī)國藥, 2014, 25(9): 2069-2071.

[15] 魏偉, 范春林, 王貴陽, 等.廣王不留行的化學(xué)成分研究 [J].中草藥, 2014, 45(5): 615-621.

[16] 張永欣, 張啟偉, 李春, 等.忍冬葉中抗氧化化學(xué)成分研究 [J].中國中藥雜志, 2015, 40(12): 2372-2377.

[17] 汪小莉, 劉曉, 韓燕全, 等.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要研究方法概述 [J].中草藥, 2018, 49(4): 941-947.

[18] 羅奇志.雙黃連方藥抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)研究 [D].廣州: 南方醫(yī)科大學(xué), 2009.

[19] 肖平, 李祥, 陳建偉, 等.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路與方法概述[J].時珍國醫(yī)國藥, 2014, 25(8): 1935-1938.

[20] 張創(chuàng)峰, 沈碩, 宋聯(lián)強(qiáng), 等.連花清瘟膠囊的化學(xué)成分研究(Ⅱ) [J].中草藥, 2018, 49(14): 3222-3225.

[21] Efferth T, Romero M R, Wolf D G,.The antiviral activities of artemisinin and artesunate [J]., 2008, 47(6): 804-811.

[22] Romero M R, Efferth T, Serrano M A,.Effect of artemisinin/artesunate as inhibitors of hepatitis B virus production in an “in vitro” replicative system [J]., 2005, 68(2): 75-83.

[23] Zhang Y S, Yao J, Qi X,.Geniposide demonstrates anti-inflammatory and antiviral activity against pandemic A/Jiangsu/1/2009 (H1N1) influenza virus infectionand[J]., 2017, 22(7): 599-611.

[24] Lin Y J, Lai C C, Lai C H,.Inhibition of71 infections and viral IRES activity by Fructus gardeniae and geniposide [J]., 2013, 62C: 206-213.

[25] Li X, Liu Y Y, Hou X L,.Chlorogenic acid inhibits the replication and viability of71[J]., 2013, 8(9): e76007.

[26] Wang G F, Shi L P, Ren Y D,.Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid, quinic acid and caffeic acidand[J]., 2009, 83(2): 186-190.

Isolation of antivial constituents of Yinhua Qinghao-Zhizi Descriptionagainst Coxsavirus A6

LI Fei1, ZHAO Xin-ya1, ZHAO Xue-mei1, BI Yan-ping1, LI Juan1, CUI Qing-hua2, TIAN Jing-zhen2

1.Key Laboratory of Etiology and Epidemiology of Emerging Infectious Diseases, Department of Pharmacy, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Taian 271016, China 2.Department of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

To explore the active constituents of YQZ (Yinhua Qinghao Zhizi Description, YQZ) against Coxsavirus A6 (CV-A6)Active constituents were extracted and isolated from YQZ and identified, which was proceeded with virus inhibition rate as the evaluation index.Molecule docking between active constituents and target protein was performed using Discovery Studio 2017 software.Compared with ribavirin, the virus inhibition rate of artemisic acid and artemisinin seperated from petroleum ether extract, and geniposide, chlorogenic acid as well as luteoloside from-Butanol extract from YQZ ethanol extract was significantly higher (< 0.01, 0.05).Dense interaction involving hydrogen bonds and van der waals force, etc.exsited between molecules of the aboved constituents and CV-A6 capsid protein VP1.Artemisic acid, artemisinin, geniposide, chlorogenic acid, and luteoloside in YQZ has significant anti-CV-A6 effect, which may be ralated with the inhibition of capsid protein VP1.

Yinhua-Qinghao-ZhiziDescription; CV-A6; antivirus; active constituents; molecule docking; artemisic acid; artemisinin; geniposide; chlorogenic acid; luteoloside

R284.1

A

0253 - 2670(2022)05 - 1365 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.011

2021-09-23

山東省重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017GSF19106）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃（2017-248）；山東第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)提升計劃（2019LJ003）

李 菲（1980—），女，山東肥城人，副教授，博士，研究方向為中藥抗病毒。

通訊作者：田景振，教授，研究方向為中藥抗病毒。E-mail: tianjingzhen@163.com

#并列第一作者：趙新亞，藥物制劑專業(yè)。E-mail:zxy19980519@126.com

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