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    杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組分析

    2022-03-03 13:25:38李玉娟
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:杜梨青葉花葉

    陳 燕, 郭 聰, 王 瑩, 李玉娟

    (江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇南通 226541)

    杜梨(Bunge)隸屬于薔薇科梨屬,原產(chǎn)于我國,耐寒耐旱,是常用的梨砧木。杜梨的枝葉、樹皮、根和果實(shí)均有藥效,能消食止痢,潤肺止咳。杜梨作為我國本土樹種,耐鹽堿性強(qiáng),具有林用、觀賞、果用等許多優(yōu)良特性,是一個(gè)值得深度開發(fā)的樹種。將杜梨種植在難以治理的鹽堿化等地區(qū)進(jìn)行綠化,可以緩解環(huán)境污染、水土流失,擴(kuò)大綠化面積,提高觀賞性和生態(tài)效益。近年來,江蘇省極力推進(jìn)沿海大開發(fā),沿海灘涂綠化與生態(tài)保護(hù)建設(shè)方興未艾。

    國內(nèi)外對杜梨的生物學(xué)研究多集中于耐鹽、耐旱的分子機(jī)制上,與葉色相關(guān)的研究只有馬春暉等報(bào)道過,即以我國梨屬主要植物種(杜梨、豆梨、西洋梨)以及近緣屬植物榅桲為試材,通過植物葉片色澤和類別進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)它們之間存在一定的相關(guān)性。然而,尚未見關(guān)于其葉片轉(zhuǎn)錄組測序方面的研究報(bào)道。

    RAN-Seq測序技術(shù)能夠分析植物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng),是研究彩葉植物呈色機(jī)制的重要方法。郭聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)了7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控花青素生物合成途徑來改變美國紅楓葉色。Gang等通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃綠葉突變體樺樹中光合作用天線蛋白代表最重要的富集途徑,其表達(dá)水平對葉片顏色的形成至關(guān)重要。褚江濤對三角楓新品種齊魯金葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,共鑒定出75個(gè)差異表達(dá)基因,并通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測,篩選出180個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子基因。陸小雨等對紅花槭特殊單株不同色葉進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)秋季花青素苷通路中大量基因的表達(dá)量上調(diào)是紅花槭葉片變色的主要驅(qū)動(dòng)因子。申建雙研究了金葉連翹葉片的呈色機(jī)制,對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),與金葉連翹葉色形成及響應(yīng)光照度有關(guān)的基因45個(gè)、轉(zhuǎn)錄因子23個(gè)。其中,15個(gè)基因表達(dá)不受光照度影響,30個(gè)基因和23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均受光照度的影響。最終篩選出6個(gè)基因和1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在黃葉型連翹中顯著低表達(dá)或不表達(dá),為連翹葉色變黃及響應(yīng)不同光照度的關(guān)鍵候選基因。

    綜上,轉(zhuǎn)錄組測序已廣泛應(yīng)用于植物葉片呈色機(jī)制的分子研究中,但目前還未見杜梨葉色轉(zhuǎn)錄組測序分析相關(guān)的報(bào)道。本研究以轉(zhuǎn)色期杜梨青葉、花葉、紅葉為試驗(yàn)材料,分析比較基因表達(dá)差異,以期開發(fā)出可用于耐鹽地開發(fā),集綠化、林用等多功能的紅葉杜梨園林植物新品種(系),做到春天觀花、夏天觀果、秋后賞紅葉,為城市美化與江蘇沿海地區(qū)大開發(fā)生態(tài)環(huán)境建設(shè)作出貢獻(xiàn)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    2019年11月下旬于江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所杜梨培育基地采集杜梨單株上不同分枝的紅葉、花葉、青葉為試驗(yàn)材料(圖1),每組葉片分別取3次重復(fù),編號(hào)見表1;將葉片用錫箔紙包裹好后,迅速置于液氮中。

    杜梨高通量測序和分析由北京百邁克生物科技有限公司負(fù)責(zé)進(jìn)行。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 杜梨總RAN提取及質(zhì)量檢測 采用試劑盒法提取RNA并采用超微量分光光度計(jì)對樣品RNA質(zhì)量、濃度、完整性進(jìn)行檢測。杜梨葉片的總 RNA 的提取是采用試劑盒NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,美國)。RNA 樣品的完整性是通過 NanoDrop6000 (AgilentTechnologies,美國)進(jìn)行檢測。

    1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建 以合格的mRNA為模板,通過六堿基隨機(jī)引物、AMPure XP beads核酸純化試劑盒和 PCR 富集等相關(guān)工具和技術(shù)獲得 cDNA 文庫。

    1.2.3 文庫質(zhì)控及測序 使用Q-PCR方法對cDNA文庫的有效濃度(文庫有效濃度>2nmol/L)進(jìn)行準(zhǔn)確定量;庫檢合格后,用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 杜梨轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

    對9個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測序和分析,共獲得67.78 Gb測序數(shù)據(jù),各樣品總堿基數(shù)均達(dá)到6.79 Gb,測序數(shù)據(jù)質(zhì)量大于或等于30的堿基所占的百分比(Q30)在91.73%及以上,GC含量百分比均在46.22%及以上(表1),可用于下一步組裝。利用StringTie軟件對比對到參考基因組上的片段(mapped reads)進(jìn)行拼接組裝,共得到60 611個(gè)基因,并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較,經(jīng)篩選共發(fā)掘出1 059個(gè)新基因。

    表1 杜梨樣品測序數(shù)據(jù)評估

    2.2 差異表達(dá)分析

    皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson’s correlation coefficient,)是評估生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的重要指標(biāo),越接近1,說明相關(guān)性越強(qiáng)。從圖2可以看出,CK1、CK2、CK3,B1、B2、B3,H1、H2、H3之間的均大于0.900,表明樣本間相關(guān)性強(qiáng),所有樣本數(shù)據(jù)均可用于后續(xù)分析。

    將(fold change,差異倍數(shù))≥2且(false discovery rate,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn),對杜梨3組不同顏色葉片的差異表達(dá)基因進(jìn)行對比分析。從表2、圖3可以看出, 青葉和花葉共有57個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化,其中15個(gè)DEGs上調(diào),42個(gè)DEGs下調(diào);青葉和紅葉共有2 084個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化,其中1 447個(gè)DEGs上調(diào),637個(gè)DEGs下調(diào);紅葉和花葉對比下,共有1 795個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化,其中568個(gè)DEGs上調(diào),1 227個(gè)DEGs下調(diào)。

    表2 杜梨差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

    將每組差異基因進(jìn)行比對,通過韋恩圖來了解差異基因在每組中的分布情況(圖4),青葉與花葉、青葉與紅葉之間共有20個(gè)差異表達(dá)基因;紅葉與青葉、花葉之間共有1 258個(gè)差異表達(dá)基因,花葉與青葉、紅葉之間共有20個(gè)差異表達(dá)基因,三者共有9個(gè)差異表達(dá)基因。

    2.3 基因功能注釋

    將全部基因序列與COG(clusters of orthologous groups,直系同源群)、GO(gene ontology,基因本體)、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes,京都基因與基因組百科全書)、KOG(eukaryotic orthologous groups,真核生物同源組)、Pfam(protein family,蛋白家族)、Swiss-Prot(manually annotated and reviewed protein sequence database)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous groups)、NR(non-redundant,非冗余數(shù)據(jù)庫)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(表3)發(fā)現(xiàn),共57 669個(gè)基因得到功能注釋,注釋率為95.15%。其中,序列長度在≥300~1 000 bp之間的基因占總注釋基因的37.91%(21 862/57 669),序列長度≥1 000 bp的占59.71%(34 436/57 669)。對差異表達(dá)基因功能注釋進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)青葉與花葉、青葉與紅葉、花葉與紅葉分別有56、2 064、1 769個(gè)差異表達(dá)基因被注釋,分別占98.25%(56/57)、99.04%(2 064/2 084)、98.55%(1 769/1 795),均超過98%(表4),表明差異表達(dá)基因的高注釋率可能為杜梨色葉研究和新品種選育提供了理論基礎(chǔ)。

    表3 unigene功能注釋統(tǒng)計(jì)

    表4 差異表達(dá)基因功能注釋統(tǒng)計(jì)

    2.4 差異表達(dá)基因GO分類和功能富集

    將杜梨全部基因序列與GO 數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)30 403個(gè)基因得到了功能注釋,其中差異表達(dá)基因得到功能注釋數(shù)最多的為青葉與紅葉,共1 394個(gè);注釋率最高的為青葉與花葉,為76.79%(表5)。注釋的基因涉及49個(gè)功能組,主要集中在膜(細(xì)胞組分)、催化活性(分子功能)、代謝過程(生物學(xué)過程)等(圖5)。通過GO分類,把杜梨基因按照功能進(jìn)行分類,為杜梨抗逆性等研究提供了依據(jù)。

    表5 GO數(shù)據(jù)庫三大功能主類DEG數(shù)

    2.5 差異表達(dá)基因KEGG注釋和富集分析

    通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對,共有16 594個(gè)杜梨基因得到注釋。其中,青葉和花葉有11個(gè)DEGs可以分配到16個(gè)KEGG通路中,6個(gè)差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢,5個(gè)基因呈下調(diào)趨勢,顯著富集在碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成中;青葉和紅葉共有383個(gè)差異表達(dá)基因得到注釋信息,分配到105個(gè)KEGG通路中,其中262個(gè)差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢,121呈下調(diào)趨勢,顯著富集在植物-病原體相互作用、碳代謝等通路中;紅葉和花葉共有318個(gè)差異表達(dá)基因得到注釋信息,分配到106個(gè)KEGG通路中,其中119個(gè)差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢,199個(gè)呈下調(diào)趨勢,顯著富集在植物-病原體相互作用、碳代謝等通路中(圖6、圖7)。綜上,碳代謝、植物-病原體相互作用一直是杜梨葉片轉(zhuǎn)色過程中排名前三的代謝通路,可能參與杜梨葉片轉(zhuǎn)色。

    2.6 與葉色相關(guān)基因分析

    類黃酮是植物中通過苯丙烷途徑合成的次生代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生3種主要化合物:黃酮醇,原花青素和花青素,與葉色息息相關(guān)。在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期間,從紅葉、花葉、青葉等3種不同葉色的葉片中篩選出10個(gè)與類黃酮相關(guān)的基因,分別屬于UDPGT(Chr2.g42475、Chr11.g09871、Chr11.g10237、Chr14.g49947、Chr15.g03978)、NAD dependent epimerase/dehydratase family(Chr5.g05869)、2OG-Fe(Ⅱ) oxygenase superfamily(Chr5.g09527)、ABC transporters(Chr12.g36590)、Transferase(Chr17.g27158)、Chalcone(Scaffold29.g59180)等6個(gè)基因家族,主要通過類黃酮的生物合成過程、花青素還原酶活性調(diào)節(jié)、黃酮醇合酶活性調(diào)節(jié)、花青素在紫外線下于組織中積累、黃酮類生物合成過程等機(jī)制對杜梨葉色進(jìn)行調(diào)控(表6)。

    表6 與葉色相關(guān)差異表達(dá)候選基因及GO注釋

    為了探索這10個(gè)基因在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期間的表達(dá)模式,本研究對這10個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果(圖8)發(fā)現(xiàn),每個(gè)基因都呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平,大部分轉(zhuǎn)錄因子在紅葉中的表達(dá)量大于在青葉和花葉中的表達(dá)量。

    2.7 SNP分析

    本研究對所篩選出的SNP位點(diǎn)數(shù)目、轉(zhuǎn)換類型比例、顛換類型比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,從表7可以看出,共篩選出452 501個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)生頻率為1/411。其中,堿基轉(zhuǎn)換位點(diǎn)共277 789個(gè),占SNP總數(shù)61.39%;堿基顛換位點(diǎn)共174 712個(gè),占38.61%。所有的變異類型中,轉(zhuǎn)換類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顛換類型,本研究結(jié)果極大地豐富了杜梨SNP位點(diǎn)信息,為今后杜梨種質(zhì)資源篩選、新品種選育等研究提供了理論基礎(chǔ)。

    表7 SNP類型分析

    3 討論與結(jié)論

    近年來,RNA-Seq、Chip-Seq等新一代技術(shù)取得了前所未有的發(fā)展,已經(jīng)通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等不同層面和角度對植物呈色機(jī)制進(jìn)行深度解析,為彩葉植物新品種培育等研究奠定了基礎(chǔ)。其中,紫薇、美國紅楓、銀杏、花葉矢竹、墨蘭、鳳香果等彩葉植物已進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。本研究對杜梨葉片(青葉、花葉、紅葉)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,共獲得了67.78GB總堿基,Q30堿基比例均大于91.73%。通過組裝得到60 611個(gè)基因,包括1 059個(gè)新基因,為今后杜梨葉片呈色機(jī)制的研究、相關(guān)基因的挖掘以及新品種的選育提供了理論基礎(chǔ)。

    相關(guān)研究表明,同一個(gè)轉(zhuǎn)錄分析中unigene的序列越長,匹配率越高。本研究共發(fā)現(xiàn)57 669個(gè)基因得到功能注釋(注釋效率為95.15%),其中有21 862個(gè)已注釋基因的序列長度在≥300~1 000 bp 之間,34 436個(gè)已注釋基因序列長度≥1 000 bp,與前者研究相似。類黃酮物質(zhì)在植物葉片變色期起到重要的作用,其包含的一類物質(zhì)——花色苷是植物葉片呈色的主要因素,其中UDPGT家族在花色苷合成途徑中起重要的作用。本研究共篩選出10個(gè)與類黃酮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,其中屬于UDPGT家族的共有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,推測這5個(gè)UDPGT轉(zhuǎn)錄因子可能與郭聰?shù)仍诿绹t楓轉(zhuǎn)錄組中和王瑩等在紫薇轉(zhuǎn)錄組中篩選的UDPGT轉(zhuǎn)錄因子具有同源性,在杜梨葉片變色期起到重要的作用。另外,在杜梨轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)Chr5.g09527在3種葉片中的表達(dá)量顯著高于其他的轉(zhuǎn)錄因子,但在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期的作用還需進(jìn)一步分析。

    SNP分子標(biāo)記在品種鑒定、功能基因定位等方面具有重要的作用。本研究從杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中共搜索到452 501個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)生頻率為1/411,低于水稻(1/89)、玉米(1/61)等模式植物以及梨(1/344)、蘋果(1/288)、葡萄(1/64)、火龍果(1/204)等果樹,可能與基因組測序深度深、物種間的遺傳背景差異大有關(guān),也可能與SNP檢測方法有關(guān)。另外,在杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中的所有SNP變異類型中,堿基轉(zhuǎn)換類型(61.39%)高于顛換類型(38.61%),這與梨(31.50%、31.66%)等大多數(shù)植物研究結(jié)果相似。堿基轉(zhuǎn)換類型比例高可能與甲基化等原因相關(guān)。

    本研究對杜梨轉(zhuǎn)色期葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析,共獲得了67.78 Gb測序數(shù)據(jù),通過組裝共獲得60 611個(gè)基因,其中包含1 059個(gè)新基因;使用Blast軟件將全部基因序列與8個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,統(tǒng)計(jì)到57 669個(gè)基因得到功能注釋;GO分析顯示30 403個(gè)基因得到功能注釋,共涉及49個(gè)功能組,主要集中在膜(細(xì)胞組分)、催化活性(分子功能)、代謝過程(生物學(xué)過程)等中;KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)16 594個(gè)基因得到注釋,要對碳代謝和植物-病原體相互作用等生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)節(jié);在杜梨不同顏色的葉片中共篩選出10個(gè)與類黃酮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,主要通過類黃酮的生物合成過程、花青素還原酶活性調(diào)節(jié)、黃酮醇合酶活性調(diào)節(jié)、花青素在紫外線下于組織中積累、黃酮類生物合成過程等機(jī)制對杜梨葉色進(jìn)行調(diào)控,并且大部分轉(zhuǎn)錄因子在紅葉中的表達(dá)量大于在青葉和花葉中的表達(dá)量;在杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中共搜索到452 501個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)生頻率為1/411,所有的變異類型中轉(zhuǎn)換類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顛換類型。

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