• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組分析

    2022-03-03 13:25:38李玉娟
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:杜梨青葉花葉

    陳 燕, 郭 聰, 王 瑩, 李玉娟

    (江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇南通 226541)

    杜梨(Bunge)隸屬于薔薇科梨屬,原產(chǎn)于我國,耐寒耐旱,是常用的梨砧木。杜梨的枝葉、樹皮、根和果實(shí)均有藥效,能消食止痢,潤肺止咳。杜梨作為我國本土樹種,耐鹽堿性強(qiáng),具有林用、觀賞、果用等許多優(yōu)良特性,是一個(gè)值得深度開發(fā)的樹種。將杜梨種植在難以治理的鹽堿化等地區(qū)進(jìn)行綠化,可以緩解環(huán)境污染、水土流失,擴(kuò)大綠化面積,提高觀賞性和生態(tài)效益。近年來,江蘇省極力推進(jìn)沿海大開發(fā),沿海灘涂綠化與生態(tài)保護(hù)建設(shè)方興未艾。

    國內(nèi)外對杜梨的生物學(xué)研究多集中于耐鹽、耐旱的分子機(jī)制上,與葉色相關(guān)的研究只有馬春暉等報(bào)道過,即以我國梨屬主要植物種(杜梨、豆梨、西洋梨)以及近緣屬植物榅桲為試材,通過植物葉片色澤和類別進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)它們之間存在一定的相關(guān)性。然而,尚未見關(guān)于其葉片轉(zhuǎn)錄組測序方面的研究報(bào)道。

    RAN-Seq測序技術(shù)能夠分析植物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng),是研究彩葉植物呈色機(jī)制的重要方法。郭聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)了7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控花青素生物合成途徑來改變美國紅楓葉色。Gang等通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃綠葉突變體樺樹中光合作用天線蛋白代表最重要的富集途徑,其表達(dá)水平對葉片顏色的形成至關(guān)重要。褚江濤對三角楓新品種齊魯金葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,共鑒定出75個(gè)差異表達(dá)基因,并通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測,篩選出180個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子基因。陸小雨等對紅花槭特殊單株不同色葉進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)秋季花青素苷通路中大量基因的表達(dá)量上調(diào)是紅花槭葉片變色的主要驅(qū)動(dòng)因子。申建雙研究了金葉連翹葉片的呈色機(jī)制,對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),與金葉連翹葉色形成及響應(yīng)光照度有關(guān)的基因45個(gè)、轉(zhuǎn)錄因子23個(gè)。其中,15個(gè)基因表達(dá)不受光照度影響,30個(gè)基因和23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均受光照度的影響。最終篩選出6個(gè)基因和1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在黃葉型連翹中顯著低表達(dá)或不表達(dá),為連翹葉色變黃及響應(yīng)不同光照度的關(guān)鍵候選基因。

    綜上,轉(zhuǎn)錄組測序已廣泛應(yīng)用于植物葉片呈色機(jī)制的分子研究中,但目前還未見杜梨葉色轉(zhuǎn)錄組測序分析相關(guān)的報(bào)道。本研究以轉(zhuǎn)色期杜梨青葉、花葉、紅葉為試驗(yàn)材料,分析比較基因表達(dá)差異,以期開發(fā)出可用于耐鹽地開發(fā),集綠化、林用等多功能的紅葉杜梨園林植物新品種(系),做到春天觀花、夏天觀果、秋后賞紅葉,為城市美化與江蘇沿海地區(qū)大開發(fā)生態(tài)環(huán)境建設(shè)作出貢獻(xiàn)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    2019年11月下旬于江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所杜梨培育基地采集杜梨單株上不同分枝的紅葉、花葉、青葉為試驗(yàn)材料(圖1),每組葉片分別取3次重復(fù),編號(hào)見表1;將葉片用錫箔紙包裹好后,迅速置于液氮中。

    杜梨高通量測序和分析由北京百邁克生物科技有限公司負(fù)責(zé)進(jìn)行。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 杜梨總RAN提取及質(zhì)量檢測 采用試劑盒法提取RNA并采用超微量分光光度計(jì)對樣品RNA質(zhì)量、濃度、完整性進(jìn)行檢測。杜梨葉片的總 RNA 的提取是采用試劑盒NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,美國)。RNA 樣品的完整性是通過 NanoDrop6000 (AgilentTechnologies,美國)進(jìn)行檢測。

    1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建 以合格的mRNA為模板,通過六堿基隨機(jī)引物、AMPure XP beads核酸純化試劑盒和 PCR 富集等相關(guān)工具和技術(shù)獲得 cDNA 文庫。

    1.2.3 文庫質(zhì)控及測序 使用Q-PCR方法對cDNA文庫的有效濃度(文庫有效濃度>2nmol/L)進(jìn)行準(zhǔn)確定量;庫檢合格后,用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 杜梨轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

    對9個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測序和分析,共獲得67.78 Gb測序數(shù)據(jù),各樣品總堿基數(shù)均達(dá)到6.79 Gb,測序數(shù)據(jù)質(zhì)量大于或等于30的堿基所占的百分比(Q30)在91.73%及以上,GC含量百分比均在46.22%及以上(表1),可用于下一步組裝。利用StringTie軟件對比對到參考基因組上的片段(mapped reads)進(jìn)行拼接組裝,共得到60 611個(gè)基因,并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較,經(jīng)篩選共發(fā)掘出1 059個(gè)新基因。

    表1 杜梨樣品測序數(shù)據(jù)評估

    2.2 差異表達(dá)分析

    皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson’s correlation coefficient,)是評估生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的重要指標(biāo),越接近1,說明相關(guān)性越強(qiáng)。從圖2可以看出,CK1、CK2、CK3,B1、B2、B3,H1、H2、H3之間的均大于0.900,表明樣本間相關(guān)性強(qiáng),所有樣本數(shù)據(jù)均可用于后續(xù)分析。

    將(fold change,差異倍數(shù))≥2且(false discovery rate,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn),對杜梨3組不同顏色葉片的差異表達(dá)基因進(jìn)行對比分析。從表2、圖3可以看出, 青葉和花葉共有57個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化,其中15個(gè)DEGs上調(diào),42個(gè)DEGs下調(diào);青葉和紅葉共有2 084個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化,其中1 447個(gè)DEGs上調(diào),637個(gè)DEGs下調(diào);紅葉和花葉對比下,共有1 795個(gè)DEGs表達(dá)量發(fā)生變化,其中568個(gè)DEGs上調(diào),1 227個(gè)DEGs下調(diào)。

    表2 杜梨差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

    將每組差異基因進(jìn)行比對,通過韋恩圖來了解差異基因在每組中的分布情況(圖4),青葉與花葉、青葉與紅葉之間共有20個(gè)差異表達(dá)基因;紅葉與青葉、花葉之間共有1 258個(gè)差異表達(dá)基因,花葉與青葉、紅葉之間共有20個(gè)差異表達(dá)基因,三者共有9個(gè)差異表達(dá)基因。

    2.3 基因功能注釋

    將全部基因序列與COG(clusters of orthologous groups,直系同源群)、GO(gene ontology,基因本體)、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes,京都基因與基因組百科全書)、KOG(eukaryotic orthologous groups,真核生物同源組)、Pfam(protein family,蛋白家族)、Swiss-Prot(manually annotated and reviewed protein sequence database)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous groups)、NR(non-redundant,非冗余數(shù)據(jù)庫)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(表3)發(fā)現(xiàn),共57 669個(gè)基因得到功能注釋,注釋率為95.15%。其中,序列長度在≥300~1 000 bp之間的基因占總注釋基因的37.91%(21 862/57 669),序列長度≥1 000 bp的占59.71%(34 436/57 669)。對差異表達(dá)基因功能注釋進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)青葉與花葉、青葉與紅葉、花葉與紅葉分別有56、2 064、1 769個(gè)差異表達(dá)基因被注釋,分別占98.25%(56/57)、99.04%(2 064/2 084)、98.55%(1 769/1 795),均超過98%(表4),表明差異表達(dá)基因的高注釋率可能為杜梨色葉研究和新品種選育提供了理論基礎(chǔ)。

    表3 unigene功能注釋統(tǒng)計(jì)

    表4 差異表達(dá)基因功能注釋統(tǒng)計(jì)

    2.4 差異表達(dá)基因GO分類和功能富集

    將杜梨全部基因序列與GO 數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)30 403個(gè)基因得到了功能注釋,其中差異表達(dá)基因得到功能注釋數(shù)最多的為青葉與紅葉,共1 394個(gè);注釋率最高的為青葉與花葉,為76.79%(表5)。注釋的基因涉及49個(gè)功能組,主要集中在膜(細(xì)胞組分)、催化活性(分子功能)、代謝過程(生物學(xué)過程)等(圖5)。通過GO分類,把杜梨基因按照功能進(jìn)行分類,為杜梨抗逆性等研究提供了依據(jù)。

    表5 GO數(shù)據(jù)庫三大功能主類DEG數(shù)

    2.5 差異表達(dá)基因KEGG注釋和富集分析

    通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對,共有16 594個(gè)杜梨基因得到注釋。其中,青葉和花葉有11個(gè)DEGs可以分配到16個(gè)KEGG通路中,6個(gè)差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢,5個(gè)基因呈下調(diào)趨勢,顯著富集在碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成中;青葉和紅葉共有383個(gè)差異表達(dá)基因得到注釋信息,分配到105個(gè)KEGG通路中,其中262個(gè)差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢,121呈下調(diào)趨勢,顯著富集在植物-病原體相互作用、碳代謝等通路中;紅葉和花葉共有318個(gè)差異表達(dá)基因得到注釋信息,分配到106個(gè)KEGG通路中,其中119個(gè)差異表達(dá)基因呈上調(diào)趨勢,199個(gè)呈下調(diào)趨勢,顯著富集在植物-病原體相互作用、碳代謝等通路中(圖6、圖7)。綜上,碳代謝、植物-病原體相互作用一直是杜梨葉片轉(zhuǎn)色過程中排名前三的代謝通路,可能參與杜梨葉片轉(zhuǎn)色。

    2.6 與葉色相關(guān)基因分析

    類黃酮是植物中通過苯丙烷途徑合成的次生代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)生3種主要化合物:黃酮醇,原花青素和花青素,與葉色息息相關(guān)。在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期間,從紅葉、花葉、青葉等3種不同葉色的葉片中篩選出10個(gè)與類黃酮相關(guān)的基因,分別屬于UDPGT(Chr2.g42475、Chr11.g09871、Chr11.g10237、Chr14.g49947、Chr15.g03978)、NAD dependent epimerase/dehydratase family(Chr5.g05869)、2OG-Fe(Ⅱ) oxygenase superfamily(Chr5.g09527)、ABC transporters(Chr12.g36590)、Transferase(Chr17.g27158)、Chalcone(Scaffold29.g59180)等6個(gè)基因家族,主要通過類黃酮的生物合成過程、花青素還原酶活性調(diào)節(jié)、黃酮醇合酶活性調(diào)節(jié)、花青素在紫外線下于組織中積累、黃酮類生物合成過程等機(jī)制對杜梨葉色進(jìn)行調(diào)控(表6)。

    表6 與葉色相關(guān)差異表達(dá)候選基因及GO注釋

    為了探索這10個(gè)基因在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期間的表達(dá)模式,本研究對這10個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果(圖8)發(fā)現(xiàn),每個(gè)基因都呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平,大部分轉(zhuǎn)錄因子在紅葉中的表達(dá)量大于在青葉和花葉中的表達(dá)量。

    2.7 SNP分析

    本研究對所篩選出的SNP位點(diǎn)數(shù)目、轉(zhuǎn)換類型比例、顛換類型比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,從表7可以看出,共篩選出452 501個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)生頻率為1/411。其中,堿基轉(zhuǎn)換位點(diǎn)共277 789個(gè),占SNP總數(shù)61.39%;堿基顛換位點(diǎn)共174 712個(gè),占38.61%。所有的變異類型中,轉(zhuǎn)換類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顛換類型,本研究結(jié)果極大地豐富了杜梨SNP位點(diǎn)信息,為今后杜梨種質(zhì)資源篩選、新品種選育等研究提供了理論基礎(chǔ)。

    表7 SNP類型分析

    3 討論與結(jié)論

    近年來,RNA-Seq、Chip-Seq等新一代技術(shù)取得了前所未有的發(fā)展,已經(jīng)通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等不同層面和角度對植物呈色機(jī)制進(jìn)行深度解析,為彩葉植物新品種培育等研究奠定了基礎(chǔ)。其中,紫薇、美國紅楓、銀杏、花葉矢竹、墨蘭、鳳香果等彩葉植物已進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。本研究對杜梨葉片(青葉、花葉、紅葉)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,共獲得了67.78GB總堿基,Q30堿基比例均大于91.73%。通過組裝得到60 611個(gè)基因,包括1 059個(gè)新基因,為今后杜梨葉片呈色機(jī)制的研究、相關(guān)基因的挖掘以及新品種的選育提供了理論基礎(chǔ)。

    相關(guān)研究表明,同一個(gè)轉(zhuǎn)錄分析中unigene的序列越長,匹配率越高。本研究共發(fā)現(xiàn)57 669個(gè)基因得到功能注釋(注釋效率為95.15%),其中有21 862個(gè)已注釋基因的序列長度在≥300~1 000 bp 之間,34 436個(gè)已注釋基因序列長度≥1 000 bp,與前者研究相似。類黃酮物質(zhì)在植物葉片變色期起到重要的作用,其包含的一類物質(zhì)——花色苷是植物葉片呈色的主要因素,其中UDPGT家族在花色苷合成途徑中起重要的作用。本研究共篩選出10個(gè)與類黃酮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,其中屬于UDPGT家族的共有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,推測這5個(gè)UDPGT轉(zhuǎn)錄因子可能與郭聰?shù)仍诿绹t楓轉(zhuǎn)錄組中和王瑩等在紫薇轉(zhuǎn)錄組中篩選的UDPGT轉(zhuǎn)錄因子具有同源性,在杜梨葉片變色期起到重要的作用。另外,在杜梨轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)Chr5.g09527在3種葉片中的表達(dá)量顯著高于其他的轉(zhuǎn)錄因子,但在杜梨葉片轉(zhuǎn)色期的作用還需進(jìn)一步分析。

    SNP分子標(biāo)記在品種鑒定、功能基因定位等方面具有重要的作用。本研究從杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中共搜索到452 501個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)生頻率為1/411,低于水稻(1/89)、玉米(1/61)等模式植物以及梨(1/344)、蘋果(1/288)、葡萄(1/64)、火龍果(1/204)等果樹,可能與基因組測序深度深、物種間的遺傳背景差異大有關(guān),也可能與SNP檢測方法有關(guān)。另外,在杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中的所有SNP變異類型中,堿基轉(zhuǎn)換類型(61.39%)高于顛換類型(38.61%),這與梨(31.50%、31.66%)等大多數(shù)植物研究結(jié)果相似。堿基轉(zhuǎn)換類型比例高可能與甲基化等原因相關(guān)。

    本研究對杜梨轉(zhuǎn)色期葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析,共獲得了67.78 Gb測序數(shù)據(jù),通過組裝共獲得60 611個(gè)基因,其中包含1 059個(gè)新基因;使用Blast軟件將全部基因序列與8個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,統(tǒng)計(jì)到57 669個(gè)基因得到功能注釋;GO分析顯示30 403個(gè)基因得到功能注釋,共涉及49個(gè)功能組,主要集中在膜(細(xì)胞組分)、催化活性(分子功能)、代謝過程(生物學(xué)過程)等中;KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)16 594個(gè)基因得到注釋,要對碳代謝和植物-病原體相互作用等生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)節(jié);在杜梨不同顏色的葉片中共篩選出10個(gè)與類黃酮相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,主要通過類黃酮的生物合成過程、花青素還原酶活性調(diào)節(jié)、黃酮醇合酶活性調(diào)節(jié)、花青素在紫外線下于組織中積累、黃酮類生物合成過程等機(jī)制對杜梨葉色進(jìn)行調(diào)控,并且大部分轉(zhuǎn)錄因子在紅葉中的表達(dá)量大于在青葉和花葉中的表達(dá)量;在杜梨葉片轉(zhuǎn)錄組中共搜索到452 501個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)生頻率為1/411,所有的變異類型中轉(zhuǎn)換類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顛換類型。

    猜你喜歡
    杜梨青葉花葉
    倉山
    釀酒酵母對制取杜梨種子的影響
    北方果樹(2020年6期)2020-11-14 01:35:42
    倉山
    倉山
    秋天?花葉
    花葉昆蟲世界
    花葉蘆竹及其優(yōu)化栽培技術(shù)
    梨子變形記
    創(chuàng)意花葉畫
    快樂語文(2017年9期)2017-06-15 20:28:36
    瞎想什么呢
    国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品野战在线观看| 日韩有码中文字幕| 久久久久久久精品吃奶| а√天堂www在线а√下载| 欧美激情高清一区二区三区| a级毛片a级免费在线| 女性生殖器流出的白浆| 99热只有精品国产| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜影院日韩av| 韩国精品一区二区三区| 自线自在国产av| 亚洲成人久久性| 精品电影一区二区在线| 嫩草影视91久久| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 丝袜在线中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲五月色婷婷综合| 色老头精品视频在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产黄片美女视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 男人舔女人的私密视频| 亚洲真实伦在线观看| 一a级毛片在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 免费高清视频大片| 日韩视频一区二区在线观看| 香蕉丝袜av| 狠狠狠狠99中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99精品欧美一区二区三区四区| 宅男免费午夜| 午夜福利欧美成人| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 男女午夜视频在线观看| 色在线成人网| 亚洲第一av免费看| 午夜a级毛片| 亚洲激情在线av| 在线天堂中文资源库| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品爽爽va在线观看网站 | www日本黄色视频网| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 欧美zozozo另类| 免费搜索国产男女视频| 一本久久中文字幕| 欧美日韩一级在线毛片| 国产区一区二久久| www.精华液| 人人澡人人妻人| 日本一本二区三区精品| 黄片播放在线免费| 精品高清国产在线一区| 亚洲中文日韩欧美视频| 可以在线观看毛片的网站| 99国产精品99久久久久| 亚洲午夜理论影院| 无限看片的www在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 激情在线观看视频在线高清| 日本熟妇午夜| 亚洲三区欧美一区| 国产精品综合久久久久久久免费| 老司机靠b影院| 免费看a级黄色片| 午夜福利18| 国产主播在线观看一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲av美国av| 啦啦啦 在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久精品吃奶| av福利片在线| 特大巨黑吊av在线直播 | 最好的美女福利视频网| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲男人天堂网一区| 淫秽高清视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 国产成年人精品一区二区| 极品教师在线免费播放| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | tocl精华| 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 久久伊人香网站| 黄色a级毛片大全视频| 88av欧美| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 十八禁网站免费在线| 久久中文字幕一级| 久久久久久久精品吃奶| 日韩欧美三级三区| 国产成年人精品一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 在线天堂中文资源库| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜福利免费观看在线| 俺也久久电影网| 欧美国产日韩亚洲一区| 曰老女人黄片| 午夜福利18| 成在线人永久免费视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲成人免费电影在线观看| 在线视频色国产色| 免费高清在线观看日韩| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 脱女人内裤的视频| 999久久久精品免费观看国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 麻豆av在线久日| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 一区二区三区国产精品乱码| 12—13女人毛片做爰片一| 在线永久观看黄色视频| 免费在线观看完整版高清| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久国内视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产免费男女视频| 在线观看免费视频日本深夜| 国产一区二区三区视频了| 亚洲片人在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 露出奶头的视频| 久久精品91无色码中文字幕| 99久久国产精品久久久| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 窝窝影院91人妻| 老司机在亚洲福利影院| 色老头精品视频在线观看| 亚洲 国产 在线| 久久99热这里只有精品18| 丝袜美腿诱惑在线| 国产av又大| 99久久综合精品五月天人人| 免费在线观看日本一区| av电影中文网址| 国产视频一区二区在线看| 亚洲 国产 在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 岛国视频午夜一区免费看| 一级片免费观看大全| 美女 人体艺术 gogo| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产激情欧美一区二区| 亚洲av五月六月丁香网| 12—13女人毛片做爰片一| 黄色女人牲交| 欧美日韩乱码在线| 操出白浆在线播放| 国产av一区在线观看免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 精品人妻1区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久久久久久久黄片| 黑丝袜美女国产一区| 午夜免费激情av| xxxwww97欧美| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲午夜理论影院| 亚洲熟女毛片儿| 成人三级黄色视频| 久久精品影院6| av视频在线观看入口| 99精品久久久久人妻精品| 国产久久久一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 精品福利观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美午夜高清在线| 日本免费a在线| 久久香蕉激情| 亚洲第一电影网av| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产男靠女视频免费网站| 国产一卡二卡三卡精品| 免费看美女性在线毛片视频| 无人区码免费观看不卡| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久婷婷成人综合色麻豆| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久精品欧美日韩精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品永久免费网站| 看片在线看免费视频| 成人av一区二区三区在线看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 天天添夜夜摸| 亚洲avbb在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品人妻1区二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| a在线观看视频网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲国产精品合色在线| 韩国精品一区二区三区| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲五月天丁香| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 色哟哟哟哟哟哟| 日本 av在线| 久久久久久久精品吃奶| 精品午夜福利视频在线观看一区| 91在线观看av| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 欧美日韩一级在线毛片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线永久观看黄色视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 三级毛片av免费| 亚洲午夜理论影院| 欧美在线黄色| 满18在线观看网站| 首页视频小说图片口味搜索| 成人欧美大片| 免费在线观看影片大全网站| 久久精品影院6| 91国产中文字幕| 亚洲国产精品久久男人天堂| 无限看片的www在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 欧美乱色亚洲激情| 亚洲 国产 在线| av在线天堂中文字幕| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品亚洲美女久久久| 无遮挡黄片免费观看| 日韩欧美免费精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| av欧美777| 欧美zozozo另类| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 天天添夜夜摸| 国产日本99.免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 无遮挡黄片免费观看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产极品粉嫩免费观看在线| 可以在线观看毛片的网站| 老司机靠b影院| 国产三级黄色录像| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 在线观看www视频免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美乱妇无乱码| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜福利一区二区在线看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美久久黑人一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一区二区三区高清视频在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| av有码第一页| 久99久视频精品免费| 久久 成人 亚洲| 成人国产一区最新在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 免费在线观看亚洲国产| 不卡av一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美zozozo另类| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 高清毛片免费观看视频网站| 日本一本二区三区精品| 女同久久另类99精品国产91| 精品久久久久久,| cao死你这个sao货| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产一区二区激情短视频| 国产成人av教育| 91在线观看av| 久久99热这里只有精品18| a级毛片在线看网站| 久久久久久久久免费视频了| 免费在线观看影片大全网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产久久久一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 成人免费观看视频高清| 成年免费大片在线观看| 日韩国内少妇激情av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 久久午夜综合久久蜜桃| 嫩草影视91久久| 久久久久久久午夜电影| 99久久综合精品五月天人人| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人国语在线视频| 亚洲电影在线观看av| a级毛片a级免费在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美黄色片欧美黄色片| xxxwww97欧美| 手机成人av网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 操出白浆在线播放| 变态另类丝袜制服| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产一区二区在线av高清观看| 婷婷丁香在线五月| 午夜视频精品福利| 亚洲九九香蕉| www.精华液| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线观看舔阴道视频| avwww免费| 大香蕉久久成人网| 看片在线看免费视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人精品无人区| xxx96com| 悠悠久久av| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久伊人香网站| 日韩免费av在线播放| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜久久久久精精品| 国产爱豆传媒在线观看 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜福利成人在线免费观看| 黄色成人免费大全| av中文乱码字幕在线| 黄色视频,在线免费观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 美女午夜性视频免费| 国产精品av久久久久免费| 中出人妻视频一区二区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩视频一区二区在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 久久久久久人人人人人| 黄色视频,在线免费观看| 91大片在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| www.www免费av| 日韩国内少妇激情av| 久久香蕉国产精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| ponron亚洲| 两个人视频免费观看高清| 国产精品电影一区二区三区| 色在线成人网| 午夜精品在线福利| 又黄又粗又硬又大视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品国产一区二区精华液| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产高清有码在线观看视频 | 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产精品永久免费网站| 日本一本二区三区精品| 日日夜夜操网爽| 搞女人的毛片| 动漫黄色视频在线观看| 男人舔女人的私密视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 91大片在线观看| 色在线成人网| a级毛片在线看网站| 欧美日本视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 三级毛片av免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久久大精品| 国产精品 欧美亚洲| 欧美又色又爽又黄视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产精品野战在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 搞女人的毛片| 长腿黑丝高跟| 伦理电影免费视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 香蕉久久夜色| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产成人欧美在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| av视频在线观看入口| 国产激情欧美一区二区| 国产精品久久久久久精品电影 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久国产成人精品二区| 12—13女人毛片做爰片一| 最近最新免费中文字幕在线| 9191精品国产免费久久| 在线免费观看的www视频| 高清在线国产一区| 精华霜和精华液先用哪个| 国产熟女午夜一区二区三区| 黄色成人免费大全| 日本一本二区三区精品| 久久香蕉精品热| 日本a在线网址| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 悠悠久久av| www.www免费av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线永久观看黄色视频| 欧美中文日本在线观看视频| 国产爱豆传媒在线观看 | cao死你这个sao货| 亚洲国产欧美网| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产在线观看jvid| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 好男人在线观看高清免费视频 | 一区福利在线观看| 一级片免费观看大全| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 美女大奶头视频| 欧美zozozo另类| 成人18禁在线播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 搞女人的毛片| 国产不卡一卡二| 久久性视频一级片| 国产激情欧美一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 美女大奶头视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜福利18| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久性视频一级片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 夜夜爽天天搞| 欧美精品亚洲一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美在线一区亚洲| 成年免费大片在线观看| 热99re8久久精品国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 又大又爽又粗| 国语自产精品视频在线第100页| 国产高清有码在线观看视频 | 久久久久免费精品人妻一区二区 | 中文字幕av电影在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜免费鲁丝| 露出奶头的视频| 国产免费男女视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲中文av在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产伦人伦偷精品视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久性视频一级片| 午夜福利18| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲片人在线观看| 免费观看精品视频网站| 香蕉丝袜av| 日本成人三级电影网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 51午夜福利影视在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品久久久av美女十八| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 婷婷亚洲欧美| 1024手机看黄色片| 国产成人系列免费观看| 日韩欧美在线二视频| 国产av不卡久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产视频一区二区在线看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲国产精品sss在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99国产综合亚洲精品| 又紧又爽又黄一区二区| 热99re8久久精品国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久草成人影院| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 一区二区三区国产精品乱码| 满18在线观看网站| 999精品在线视频| 久久久国产成人精品二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 91在线观看av| 99riav亚洲国产免费| 男女午夜视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 制服诱惑二区| 国产精品久久久av美女十八| 脱女人内裤的视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国产成人欧美| 99久久综合精品五月天人人| 免费高清视频大片| 亚洲国产精品合色在线| 女警被强在线播放| 两个人免费观看高清视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久久精品吃奶| 自线自在国产av| 日本三级黄在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 婷婷精品国产亚洲av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 麻豆av在线久日| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久 成人 亚洲| 满18在线观看网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本在线视频免费播放| 听说在线观看完整版免费高清| 女同久久另类99精品国产91| 日韩有码中文字幕| 欧美黑人精品巨大| 亚洲国产欧美网| 日韩高清综合在线| 国产野战对白在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 精品免费久久久久久久清纯| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色av中文字幕| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 午夜精品在线福利| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久青草综合色| 免费搜索国产男女视频| 亚洲专区中文字幕在线| 色尼玛亚洲综合影院| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 在线观看免费视频日本深夜| 国产亚洲欧美98| 亚洲久久久国产精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜免费激情av| 国产成人系列免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 免费看十八禁软件| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 男女那种视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频|