大菱鲆弧菌耐藥譜、耐藥基因檢測(cè)和ERIC-PCR分型分析

沈 飛，翟玉菲，王 浩,2，呂利群,2

1.上海海洋大學(xué)/國家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306

2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306

大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 俗稱為“多寶魚”，1992年引入中國，7年后實(shí)現(xiàn)國內(nèi)繁育，迅速掀起工廠化養(yǎng)殖的熱潮[1]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，鲆魚產(chǎn)量?jī)H次于鱸魚 (Lateolabrax japonicus)，居全國海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量第二位，較2019年提高了7.54%。大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū)自北向南主要分布在遼寧、天津、河北、山東和江蘇，其中遼寧地區(qū)產(chǎn)量最大，2019年產(chǎn)量占總產(chǎn)量的67.13%[2]。以工廠化流水養(yǎng)殖為主的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致大菱鲆病害頻發(fā)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展的推進(jìn)，流水養(yǎng)殖將逐漸被取代。細(xì)菌性疾病是大菱鲆養(yǎng)殖過程中最常見的病害，致病原主要有遲緩愛德華氏菌 (Edwardsiella tarda)[3]、大菱鲆弧菌 (Vibrio scophthalmi)[4]、溶藻弧菌 (V.alginolyticus)[5]、鰻弧菌 (V.anguillarum)[6]和假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas)[7]等。這些致病菌容易引起大菱鲆腹水病，其癥狀為腹部膨脹，嚴(yán)重時(shí)胃部和鰭部出血，腹部凹陷，死亡率高達(dá)80%[8]。其中，大菱鲆弧菌是一種條件致病菌[9]；當(dāng)宿主受到環(huán)境脅迫或者其他致病菌攻擊時(shí)，體內(nèi)的大菱鲆弧菌更容易引起繼發(fā)性感染并加劇宿主死亡。感染大菱鲆弧菌宿主癥狀同腹水病一樣，腹部積水，肝脾出血和腸道出血[5]。2016年4—10月，葫蘆島地區(qū)患病大菱鲆分離株中大菱鲆弧菌檢出率最高，占總弧菌的47.27%[10]。2018年7—10月，王鶴等[11]從山東大菱鲆養(yǎng)殖地區(qū)分離到了28株病原菌，其中有9株大菱鲆弧菌，說明大菱鲆弧菌在患病大菱鲆中檢出率很高。

高靈敏度和特異性的分子分型技術(shù)是對(duì)病原體進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的有效手段，可用于表征分離株的遺傳相似性。ERIC-PCR (Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR) 分型法基于腸桿菌基因間重復(fù)共有序列，是一種快速、高效、高通量、低成本的分子分型技術(shù)[12]。該方法通過擴(kuò)增重復(fù)共有序列，可以得到多條帶電泳圖，根據(jù)電泳圖的差異將同種細(xì)菌分為不同基因型。ERIC-PCR被應(yīng)用于多種水產(chǎn)病原菌的流行病學(xué)調(diào)查與溯源，如嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)[13]，遲緩愛德華氏菌[3]，副溶血弧菌 (V.parahaemolyticus)[14]和維氏氣單胞菌 (A.veronii)[15]等，而關(guān)于大菱鲆弧菌分子分型的相關(guān)研究較少。細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感程度直接影響藥物的治療效果，但細(xì)菌耐藥性復(fù)雜且受季節(jié)、養(yǎng)殖環(huán)境和宿主等條件影響。耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病越來越難以防控，甚至陷入多重耐藥的惡性循環(huán)。對(duì)細(xì)菌病原的精準(zhǔn)分型是診斷細(xì)菌感染并及時(shí)采取控制措施的關(guān)鍵。ERIC-PCR作為一種簡(jiǎn)便、辨識(shí)度強(qiáng)且重復(fù)性高的分子生物學(xué)分型手段，其與細(xì)菌耐藥性的相關(guān)性值得探討。

遼寧省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站于2020年6—10月從患病瀕死大菱鲆體內(nèi)采集到394株菌株，送至上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫鑒定，其中大菱鲆弧菌檢出率最高。本研究采用微量稀釋法測(cè)定大菱鲆弧菌對(duì)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部許可使用的8種抗菌藥物的耐藥性，檢測(cè)其耐藥基因攜帶情況，基于ERICPCR對(duì)其分型研究，分析耐藥譜、耐藥基因譜和ERIC-PCR譜三者之間的相關(guān)性，旨在掌握大菱鲆弧菌的遺傳學(xué)特征和流行特征，并指導(dǎo)科學(xué)用藥。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

394株分離株由遼寧省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站每月定點(diǎn)從患病大菱鲆中分離并保存，送至上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫鑒定。用于分析的18株大菱鲆弧菌分別命名為Vs1—Vs18。藥敏質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。

1.2 主要試劑

TCBS (硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖)、MH(水解酪蛋白) 培養(yǎng)基購于索萊寶公司；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR裂解液、PremixTaq?酶購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 (DP302) 購自天根生化科技(北京) 有限公司；核酸染料購于上海天能科技有限公司；引物合成由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成；恩諾沙星 (Enrofloxacin, ENR)、硫酸新霉素 (Neomycin, NEO)、甲砜霉素 (Thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考 (Florfenicol, FFC)、鹽酸多西環(huán)素(Doxycycline, DO)、氟甲喹 (Flumequine, FLU)、磺胺間甲氧嘧啶鈉 (Sulfamonomethoxine, SMM) 和磺胺甲惡唑甲氧芐啶復(fù)合物 (Sulfamethoxazole+Trimethoprim, SMZ+TMP) 均購于源葉生物公司。

1.3 分離株16S rRNA鑒定

挑取單菌落或用移液器移取細(xì)菌懸液加至細(xì)菌裂解液中，80 ℃金屬浴15 min，取2 μL作為DNA擴(kuò)增模板。擴(kuò)增體系為：PremixTaq?酶25 μL，上下游引物各 1 μL，模板 2 μL，滅菌雙蒸水 21 μL。以16S rRNA通用引物27F和1492R (表1) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[8]。產(chǎn)物測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成，在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

表1 PCR引物Table 1 Primers used for PCR

1.4 RNA聚合酶σ70因子rpoD擴(kuò)增、測(cè)序及進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)天根細(xì)菌DNA提取試劑盒使用說明提取大菱鲆弧菌的DNA，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增與檢測(cè)。PCR擴(kuò)增18株大菱鲆弧菌的rpoD基因進(jìn)行種水平的鑒定。rpoD基因引物參考Tarazona等[16]設(shè)計(jì)，序列見表1。PCR條件及序列比對(duì)與16S rRNA一致。

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建產(chǎn)物序列與其他弧菌rpoD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹方法為Neighborjoining法，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.5 最小抑菌濃度測(cè)定和藥物敏感性分析

基于CLSI微量肉湯稀釋法[21]檢測(cè)大菱鲆弧菌藥物敏感性。主要有8種抗菌藥物，分別為恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲惡唑甲氧芐啶復(fù)合物。判別標(biāo)準(zhǔn)：與陽性對(duì)照孔比較，孔底渾濁，為陽性；孔底澄明，為陰性。以在微孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。

不同抗生素敏感性不同，判別標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI[21]標(biāo)準(zhǔn)文件和魏文娟等[20]：恩諾沙星 [(敏感 (S)：MIC≤0.5 μg·mL?1，中敏 (I)：MIC=1～2 μg·mL?1，耐藥 (R)：MIC≥4 μg·mL?1)]；硫酸新霉素、甲砜霉素和氟苯尼考 (S: MIC≤2 μg·mL?1, I: MIC=4 μg·mL?1, R: MIC≥8 μg·mL?1)；鹽酸多西環(huán)素 (S:MIC≤4 μg·mL?1, I: MIC=8 μg·mL?1, R: MIC≥16 μg·mL?1)；氟甲喹 (S: MIC≤8 μg·mL?1, I: MIC=16 μg·mL?1, R: MIC≥32 μg·mL?1)；磺胺間甲氧嘧啶鈉(S: MIC≤256 μg·mL?1, R: MIC≥512 μg·mL?1)；磺胺甲惡唑/甲氧芐啶 (S: MIC≤38/2 μg·mL?1, R: MIC≥76/4 μg·mL?1)。

1.6 耐藥基因檢測(cè)

采用PCR法鑒定17種耐藥基因，耐藥基因名稱及引物見表1。PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～60 s (根據(jù)靶基因序列長(zhǎng)度確定延伸時(shí)間)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。

1.7 ERIC-PCR條帶聚類分析

參照張海強(qiáng)等[14]方法對(duì)大菱鲆弧菌進(jìn)行ERICPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為F: ATGTAAGCTCCTGGGG ATTCAC，R: AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃ 退火 1 min；72 ℃ 延伸 5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，條件為120 V，5 min，使用天能全自動(dòng)凝膠圖形分析系統(tǒng)結(jié)合電泳圖分析條帶，有條帶記作“1”，無條帶記作“0”。使用NTsys_2.10e軟件分析Jaccard系數(shù)和遺傳距離矩陣確定菌株間的相似性，使用非加權(quán)組平均法 (Unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)對(duì)ERIC產(chǎn)物進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 分離株16S rRNA測(cè)序鑒定結(jié)果

394株分離細(xì)菌的16S rRNA測(cè)序鑒定結(jié)果見表2。將16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，初步確定弧菌屬232株，假單胞菌屬46株，假交替單胞菌屬35株，分別占總分離株的58.88%、11.68%和8.88%?；【?，大菱鲆弧菌分離率最高，占總弧菌的50.43%，占總分離株的29.70%；其次為溶藻弧菌，占總分離株8.89%。結(jié)果表明大菱鲆弧菌是患病大菱鲆分離株中的優(yōu)勢(shì)株，應(yīng)當(dāng)引起重視。

表2 基于16S rRNA測(cè)序的394株分離株鑒定結(jié)果Table 2 Identification result of 394 strains based on 16S rRNA sequencing

2.2 大菱鲆弧菌rpoD序列分析

從117株大菱鲆弧菌中隨機(jī)挑選18株進(jìn)行rpoD基因測(cè)序和比對(duì)。PCR擴(kuò)增rpoD基因得到780 bp的片段 (圖1)，選取大菱鲆弧菌和其他常見弧菌的rpoD序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示該18株均與大菱鲆弧菌聚為一支，且能區(qū)分于其他弧菌 (圖2)。

圖1 18株大菱鲆弧菌rpoD基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product of rpoD in 18 strains of V.scophthalmi

圖2 基于弧菌rpoD序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from rpoD sequence of Vibrio

2.3 大菱鲆弧菌藥物敏感性分析

18株分離株耐藥性結(jié)果 (表3) 表明，分離株對(duì)硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹尚未產(chǎn)生耐藥性，對(duì)恩諾沙星 (6/18)、甲砜霉素 (9/18)、氟苯尼考 (9/18)、磺胺間甲氧嘧啶鈉 (6/18) 和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶 (4/18) 有不同比例的耐藥性。其中多重耐藥率為66.67% (12/18)。

表3 18株大菱鲆弧菌的藥物敏感性Table 3 Drug sensitivity of 18 V.scophthalmi strains

2.4 大菱鲆弧菌耐藥基因檢測(cè)

PCR擴(kuò)增分離株5類17個(gè)耐藥基因，耐藥基因攜帶率見表4。18株均不攜帶被測(cè)氨基糖苷類和四環(huán)素類耐藥基因；攜帶酰胺醇類耐藥基因floR(61.11%) 和cmlA(66.67%)，不攜帶catA；攜帶磺胺類耐藥基因sul2 (55.56%)，不攜帶sul1和sul3；攜帶喹諾酮類耐藥基因qnrA(50%) 和qnrS(5.56%)，不攜帶qnrB、oqxAB和aac(6')-lb-cr。

表4 大菱鲆弧菌耐藥基因攜帶情況Table 4 Drug resistance genes status of V.scophthalmi

2.5 大菱鲆弧菌ERIC-PCR圖譜分析

ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2～10條，介于100～10 000 bp。用NTsys_2.10e軟件進(jìn)行聚類分析，相似度介于0.66～1.0，在相似度0.75處可以分為4個(gè)基因型。I型和III型較多，分別占44.4%和44.4%，II型和IV型各只有1株 (圖3)。

圖3 大菱鲆弧菌分離株ERIC-PCR指紋圖譜與UPGMA樹狀圖Fig.3 Genetic diversity diagram based on ERIC-PCR and UPGMA dendrogram of V.scophthalmi strains

2.6 大菱鲆弧菌耐藥基因、耐藥表型和ERIC基因型相關(guān)性分析

18株大菱鲆弧菌耐藥基因與耐藥表型符合率見表5。氨基糖苷類和四環(huán)素類抗生素耐藥基因檢出率與耐藥表型菌株符合率為100%，均未檢測(cè)到。酰胺醇類耐藥基因與耐藥表型符合率較高，為88.89%，磺胺類符合率次之 (50%)，喹諾酮類符合率最低 (33.33%)，表明酰胺醇類耐藥基因與耐藥表型有一定的相關(guān)性。表6結(jié)合大菱鲆弧菌分離株的耐藥譜、耐藥基因譜和ERIC基因型，未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

表5 大菱鲆弧菌分離株耐藥基因與耐藥表型符合率Table 5 Coincidence rate of drug resistance genes and phenotype of V.scophthalmi strains

表6 大菱鲆弧菌分離株耐藥譜、耐藥基因譜和ERIC基因型Table 6 Drug resistance spectrum, resistance gene spectrum and ERIC genotype of V.scophthalmi strains

3 討論

3.1 大菱鲆分離株與大菱鲆弧菌分子生物學(xué)鑒定分析

16S rRNA存在于所有細(xì)菌染色體基因中，既具有保守區(qū)又有高變區(qū)，是研究細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和菌種鑒定最常用的分子標(biāo)志物[22]，也是鑒定水產(chǎn)病原菌的主要分子手段。本研究表明，大菱鲆弧菌是優(yōu)勢(shì)菌，占總弧菌的50.43%和總分離株的29.70%，主要集中在8—10月。這與鄭懷東等[10]2016年檢測(cè)葫蘆島地區(qū)大菱鲆致病弧菌的結(jié)果相似。王鶴等[11]2018年從山東煙臺(tái)市7—10月患病大菱鲆體內(nèi)也分離到大菱鲆弧菌，其中優(yōu)勢(shì)菌是遲緩愛德華氏菌。值得注意的是，遲緩愛德華菌是大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的“頭號(hào)殺手”，是引起大菱鲆腹水病的主要病原之一。2016年，華東理工大學(xué)研發(fā)的遲鈍愛德華氏菌的“大菱鲆遲鈍愛德華氏菌活疫苗” (EIBAV1株) 獲得獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)并正式投產(chǎn)，目前已在遼寧、山東、河北等大菱鲆養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)開展了規(guī)?；瘧?yīng)用[23]。而此次遼寧地區(qū)分離的394株菌株中遲緩愛德華氏菌檢出率為0，說明大菱鲆遲緩愛德華氏菌病已得到很好的防控。2019年，大菱鲆鰻弧菌基因工程活疫苗 (MVAV6203株) 獲批國家Ⅰ類新獸藥證書[2]。隨著大菱鲆細(xì)菌病疫苗的不斷研發(fā)，大菱鲆弧菌可能成為日后大菱鲆細(xì)菌性疾病的重點(diǎn)防控對(duì)象。

Pascual等[24]研究發(fā)現(xiàn)，弧菌種間16S rRNA基因序列同源性較高，rpoD可以用來區(qū)分哈維弧菌、坎氏弧菌 (V.campbellii)、輪蟲弧菌 (V.rotiferianus)、副溶血弧菌、溶藻弧菌和V.natriegens6株弧菌。Tarazona等[16]以16S rRNA、gyrB、ftsZ、mreB、rpoD和recA等6種基因作為分子標(biāo)記區(qū)分大菱鲆弧菌與魚腸弧菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rpoD是區(qū)分這兩株弧菌的最佳選擇。因此，本研究擴(kuò)增大菱鲆弧菌的rpoD基因并與其他水產(chǎn)常見致病弧菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，均與大菱鲆弧菌VS-05聚為一簇，并可以很好地區(qū)分大菱鲆弧菌與其他弧菌。這可能是研發(fā)大菱鲆弧菌快速檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)基因靶點(diǎn)。

3.2 大菱鲆弧菌耐藥性分析

海水養(yǎng)殖總量逐年增長(zhǎng)但病害多發(fā)，使用抗菌藥仍是控制水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病最快速有效的方案。然而，養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，直接后果是在水產(chǎn)環(huán)境和養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出抗性菌株甚至多重抗性菌株[25]。因此我國對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥及其他投入品的監(jiān)管越來越重視。2020年10月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年1、2號(hào)》，其中批準(zhǔn)生產(chǎn)和使用的抗菌藥僅有12種，分別是甲砜霉素粉、氟苯尼考粉、氟苯尼考注射液、氟甲喹粉、恩諾沙星粉、鹽酸多西環(huán)素粉、維生素C磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑、硫酸新霉素粉、磺胺間甲氧嘧啶鈉粉、復(fù)方磺胺嘧啶粉、復(fù)方磺胺二甲嘧啶粉和復(fù)方磺胺甲噁唑粉。本研究選取其中8種抗菌藥物用作藥敏試驗(yàn)。

本研究選取的18株大菱鲆弧菌對(duì)硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹尚未產(chǎn)生耐藥性，對(duì)氟苯尼考和甲砜霉素的耐藥率為50%，對(duì)其他3種藥物的耐藥率均高于20%，多重耐藥率高達(dá)66.7%(12/18)。細(xì)菌的耐藥性受地區(qū)和季節(jié)影響而呈現(xiàn)復(fù)雜性。王嵐等[8]報(bào)道了2002—2010年山東地區(qū)分離的10株大菱鲆弧菌均對(duì)氟苯尼考敏感，對(duì)四環(huán)素類和喹諾酮類有較低比例的耐藥性，對(duì)復(fù)方新諾明有90%的耐藥性。崔惠敬等[4]關(guān)于大菱鲆弧菌藥敏的研究結(jié)果顯示，該菌對(duì)新霉素、復(fù)方新諾明和多西環(huán)素敏感，對(duì)環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥。鄭懷東等[10]2016年4—10月從遼寧葫蘆島地區(qū)分離到的130株大菱鲆弧菌中挑選28株作藥敏試驗(yàn)分析，結(jié)果顯示大菱鲆弧菌對(duì)氟苯尼考 (7.1%)、諾氟沙星 (3.6%) 和鹽酸多西環(huán)素 (17.9%) 有較低的耐藥率，其中諾氟沙星已屬于禁用漁藥。王鶴等[11]分析9株山東地區(qū)2018年第三季度大菱鲆弧菌的耐藥性，對(duì)磺胺類藥物有接近100%的耐藥率，對(duì)氟苯尼考、甲砜霉素和硫酸新霉素100%耐藥，對(duì)恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素均不耐藥。鹽酸多西環(huán)素是第二代四環(huán)素類抗生素，因其血漿半衰期、脂溶性和抗菌活性等性質(zhì)優(yōu)于其他四環(huán)素類抗生素，被廣泛用于全球水產(chǎn)養(yǎng)殖[26]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大菱鲆弧菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素的耐藥性普遍維持在很低的水平。這表明鹽酸多西環(huán)素對(duì)大菱鲆弧菌有較好的抑制效果，可以作為遼寧地區(qū)防控由大菱鲆弧菌引起疾病的首選。此外，為科學(xué)用藥避免長(zhǎng)期使用同種抗菌藥物，硫酸新霉素和氟甲喹可作為備選藥物，其中硫酸新霉素對(duì)弧菌引起的腸炎有較好的治療效果[27]。

3.3 大菱鲆弧菌耐藥基因與耐藥表型分析

從遺傳學(xué)的角度上看，細(xì)菌耐藥性分為自身基因突變的固有耐藥性和捕獲耐藥基因的獲得性耐藥兩種[28]，前者是菌體自身結(jié)構(gòu)導(dǎo)致對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的天然耐藥，后者則是通過耐藥基因獲得耐藥菌株的耐藥性[25]。本研究檢測(cè)了水產(chǎn)5類抗生素共17種耐藥基因，未檢測(cè)到氨基糖苷類和四環(huán)素類耐藥基因，與耐藥表型一致。氨基糖苷類和四環(huán)素類耐藥基因檢出率為0，也說明了這兩類藥物對(duì)大菱鲆弧菌有較好的治療潛力。耐藥基因檢測(cè)率最高的是酰胺醇類耐藥基因cmlA和floR，而且酰胺醇類耐藥基因與耐藥表型符合率為88.89%。cmlA和floR等基因與細(xì)菌主動(dòng)外排泵系統(tǒng)有關(guān)，細(xì)菌通過主動(dòng)外排泵系統(tǒng)將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出，從而使得菌體內(nèi)部藥物濃度降低而對(duì)酰胺醇類藥物產(chǎn)生耐藥性[29]。值得注意的是，無論是酰胺醇類耐藥表型還是耐藥基因都非單獨(dú)檢測(cè)到，多數(shù)都伴隨著其他耐藥表型與其他耐藥基因。這可能與細(xì)菌的外排作用有關(guān)，細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)是細(xì)菌多重耐藥的重要機(jī)制之一[30]。高曉華等[31]發(fā)現(xiàn)上海凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei) 源副溶血弧菌磺胺類耐藥表型與耐藥基因符合率為20%～40%，這與本研究的檢測(cè)結(jié)果類似，其原因可能是不同源細(xì)菌耐藥基因拷貝數(shù)較低無法被檢測(cè)到。本研究喹諾酮類符合率最低，可能是因?yàn)猷Z酮類耐藥機(jī)制復(fù)雜以及檢測(cè)的喹諾酮耐藥基因較少。細(xì)菌通過靶基因突變、主動(dòng)外排系統(tǒng)、改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性以及獲得耐藥質(zhì)粒對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性[32]。耐藥表型的研究固然重要，但是潛在的耐藥基因預(yù)示耐藥性產(chǎn)生的趨勢(shì)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，水產(chǎn)品攜帶的耐藥基因可能隨著食物鏈傳播到人體，威脅人類健康[33]。檢測(cè)耐藥基因不僅從分子水平闡明細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生機(jī)制，也能作為協(xié)同抑菌或減少細(xì)菌耐藥性綠色漁藥篩選的靶標(biāo)。

3.4 ERIC-PCR譜型分析

ERIC-PCR與脈沖場(chǎng)凝膠電泳PFGE分型類似，但成本更低且快速[34]，被運(yùn)用于區(qū)分水產(chǎn)養(yǎng)殖不同來源的菌株。Zhang等[13]和張永政等[15]分別對(duì)鯽 (Carassius auratus) 嗜水氣單胞菌和羅非魚(Oreochromis niloticus) 維氏氣單胞菌進(jìn)行了毒力基因檢測(cè)和ERIC-PCR分型研究，結(jié)果表明ERICPCR有較好的分型效果，且毒力基因與ERICPCR分型有一定的相關(guān)性。本研究首次將ERICPCR分型用于大菱鲆弧菌，18株菌被分作4個(gè)亞型，以ERIC-I型和ERIC-III型為主，有較好的分型效果，但是分型結(jié)果與耐藥表型或者耐藥基因譜無明顯的相關(guān)性。細(xì)菌多樣的遺傳背景和表型比其分類學(xué)歸屬更能反映其生態(tài)特性[35]，ERIC-PCR分型可能更適用于不同地區(qū)分離株的區(qū)分，將來可以與其他地區(qū)甚至其他國家的大菱鲆弧菌ERICPCR譜作進(jìn)一步比較，為大菱鲆弧菌的流行病學(xué)溯源和預(yù)防提供參考。ERIC-PCR分型結(jié)果與細(xì)菌致病力的相關(guān)性也是一個(gè)值得關(guān)注的研究方向。