白三葉草一種葉斑病病原菌的分離鑒定

商 娜，任愛芝，劉 冰，趙培寶

（1聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252000；2聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 聊城 252000）

0 引言

白三葉草（Trifolium repens）屬豆科（Fabaceae）車軸草屬（Trifolium），是一種可用作豆科牧草或地被綠化的多年生草本植物。白三葉作為一種優(yōu)質(zhì)牧草，具有營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]、適口性好、抗逆性強(qiáng)[3-4]等特點(diǎn)，且根部富有大量根瘤菌，固氮能力強(qiáng)，固氮量高[5]，越來越多的應(yīng)用于畜牧業(yè)中。白三葉草的莖匍匐蔓生，根系發(fā)達(dá)，成坪速度快，返青早，青綠期長(zhǎng)，花朵飽滿，觀賞期長(zhǎng)[6]，耐踩踏，管理成本低，對(duì)銅、鎘、鉛等重金屬污染土壤[7-8]和柴油、二噁英等有機(jī)物污染土壤[9-11]有良好的修復(fù)能力，可在國(guó)內(nèi)外園林綠化、水土保持[12]、土壤修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。

白三葉草應(yīng)用逐漸廣泛，種植面積不斷擴(kuò)大，真菌病害和病毒病害也日益嚴(yán)重[13]。白三葉草染病，嚴(yán)重時(shí)可造成草坪成片枯死，草地稀疏、禿斑，不僅嚴(yán)重影響草坪的觀賞性，還大大降低了牧草的產(chǎn)量和品質(zhì)。尹亞麗[14]、楊紅[15]、勇作山[16]、楊照坤[17]等調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，白三葉草常見的病害有銹病、葉斑病、白絹病、白粉病、褐斑病、黑斑病、菌核病和病毒病等。

2019年在山東省聊城市調(diào)查白三葉草病害時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)葉斑病較為普遍。本研究以具有葉斑病的白三葉葉片為材料，分離病原菌并進(jìn)行致病性測(cè)定，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段進(jìn)行病原菌種類鑒定，以期為白三葉草葉斑病的診斷及防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年5月—2020年1月在聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

2019年5月31日在聊城市東昌府區(qū)白三葉草草坪采集新鮮病葉，記錄病葉發(fā)病情況并拍照，放于4℃冰箱保存。

1.3 病原菌的分離

用組織分離法分離葉斑病病原菌。選取有典型病癥的白三葉草葉片，沖洗干凈后晾干。在超凈工作臺(tái)中，于病健交界處剪取2～4 mm見方的病組織。先用75%酒精浸泡10 s，再用3%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，最后用無菌水漂洗3次，待水分揮發(fā)干后放置于含有1‰乳酸的PDA平板上，每個(gè)處理放3個(gè)培養(yǎng)皿，每皿4片。28℃恒溫恒濕培養(yǎng)3～4天，待長(zhǎng)出菌落后，選擇代表性菌落再次分離，進(jìn)一步純化得到菌落大小、顏色、形狀、菌絲形狀、菌絲生長(zhǎng)快慢等一致的純菌種，分離得到純化的病原菌SY1。把純化的病原菌SY1接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，放置于4℃冰箱冷藏備用。

1.4 病原菌的致病性測(cè)定

采用無菌水清洗后的健康白三葉草進(jìn)行接種試驗(yàn)，用針刺法對(duì)白三葉草葉片造成微傷口，將培養(yǎng)7天的病原菌SY1用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，將菌餅的菌絲面貼置于傷口上。在培養(yǎng)皿中放入含有少量水的無菌濾紙，把接種后的白三葉葉柄用濕潤(rùn)脫脂棉包裹后放于培養(yǎng)皿中，于25℃條件下恒溫保濕培養(yǎng)，設(shè)3次重復(fù)。待接種的白三葉葉片發(fā)病后，觀察其癥狀，并按照柯赫氏法則，對(duì)病原菌重新分離純化，檢測(cè)分離的病原菌是否和接種的病原菌SY1一致。

1.5 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

首先活化菌株SY1，將保存的病原菌菌株SY1用接種針挑取小塊帶菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，用6 mm直徑打孔器在菌落邊緣長(zhǎng)勢(shì)一致處打孔得到菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫恒濕培養(yǎng)，觀察其菌落顏色、形態(tài)、生長(zhǎng)速度等；用移液槍將PDA培養(yǎng)基滴在載玻片上，放于提前裝好2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，并向?yàn)V紙上加3 mL無菌水保持濕度。待PDA培養(yǎng)基凝固后進(jìn)行病原菌接種，放置于28℃培養(yǎng)箱中5天，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，并對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)鑒定[18]。

1.6 病原菌分子生物學(xué)鑒定

刮取純化后的菌株SY1菌絲，液氮研磨，75℃烘干3 h。使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20℃保存?zhèn)溆?。使用真菌通用引?ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，DNA模板2.0 μL、上下游引物 （10 μmol/L）各1.0μL，2 × Power Taq PCR MasterMix 5.0 μL，dd H2O 16.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站的BLAST進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉草葉斑病的癥狀

發(fā)病初期，葉片表面出現(xiàn)小的淡紅色斑點(diǎn)，隨著時(shí)間的推移，斑點(diǎn)逐漸變成不規(guī)則的暗紅色。斑點(diǎn)的邊緣變成了黃色。最后，患病葉子的正反兩面變成暗紅色（圖1）。

圖1 山東省聊城市白三葉草葉斑病癥狀

2.2 病原菌致病性測(cè)定

將直徑5 mm的純化后的病原菌SY1菌餅接種于白三葉草葉片上。3天后，白三葉草葉片接觸菌餅的部位開始出現(xiàn)病斑，隨著時(shí)間的推移，病斑不斷擴(kuò)大，對(duì)照組無發(fā)病現(xiàn)象。5天后移除菌餅，可明顯看到不規(guī)則病斑（圖2）。對(duì)接種后發(fā)病葉片重新組織分離，得到與接種菌培養(yǎng)和形態(tài)特征相同的病原菌，證明原接種菌株SY1為白三葉草的致病菌。

圖2 病原菌菌落、菌絲和分生孢子形態(tài)特征

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離到的病原菌SY1接種于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24 h后，長(zhǎng)出白色菌絲，向四周輻射狀延伸，逐漸形成圓形菌落。菌落初為乳白色，3～4天后變?yōu)闇\灰褐色，背面由灰變?yōu)楹谏?。菌絲茂盛、疏松、呈絮狀。菌落邊緣齊整，7天后長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿（Φ=9 cm）。顯微鏡檢測(cè)表明菌絲體有隔，分生孢子梗單生、分枝或不分枝。分生孢子單生或鏈生，鏈長(zhǎng)1～6個(gè)孢子。分生孢子闊倒棒狀、卵形、近橢圓形，有1～5個(gè)橫膈膜，0～3個(gè)縱/斜膈膜，分割處略縊縮或不縊縮，孢身大小為（18.81～26.64）μm×（7.98～11.02）μm。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

在對(duì)病原菌SY1進(jìn)行形態(tài)特征鑒定的基礎(chǔ)上，開展了分子系統(tǒng)學(xué)鑒定。以所提菌株DNA為模板進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)得到大小約600 bp的片段（圖3）。

圖3 病原菌rDNA-ITS擴(kuò)增片段電泳

將電泳條帶膠回收，送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。將菌株SY1的rDNA-ITS序列提交至NCBI，經(jīng)BLAST分析顯示，白三葉草病害的病原菌SY1與鏈格孢屬（Alternaria spp.）有很多種相似，相似性均達(dá)到99%以上，與喬木鏈格孢（A.arborescens）（序列號(hào)KC464334.1）的相似性為100%。從NCBI中下載相關(guān)菌株序列，使用軟件MEGA-X采用鄰接法（bootstrap檢驗(yàn)1000次）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)合形態(tài)特征確定白三葉草葉斑病病原菌SY1為喬木鏈格孢。

圖4 基于rDNA-ITS序列采用鄰接法構(gòu)建病原菌與其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

對(duì)聊城市東昌府區(qū)白三葉葉斑病的癥狀觀察，以及對(duì)病葉分離病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，引起白三葉葉斑病的病原菌為喬木鏈格孢（A.arborescens），為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道喬木鏈格孢引起白三葉葉斑病。

鏈格孢屬病原菌可侵染多達(dá)200種以上作物，可引起小麥黑胚病[19]、油菜黑斑病[20]、向日葵黑斑病[21]、番茄早疫病[22]、馬鈴薯早疫病[22]、萬壽菊黑斑病[23]等。除引起病害外，鏈格孢極易引起霉變，導(dǎo)致蔬菜、瓜果等腐敗變質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。有些鏈格孢具有產(chǎn)毒能力，產(chǎn)生的植物毒素積累在農(nóng)產(chǎn)品中，嚴(yán)重威脅食品安全。國(guó)內(nèi)的庫爾勒香梨、中華獼猴桃、河北鴨梨、柑橘、大櫻桃等瓜果，美國(guó)加利福尼亞的開心果，阿根廷的藍(lán)莓也受到鏈格孢的嚴(yán)重危害[24]。本研究從白三葉草葉片中分離得到病原菌喬木鏈格孢，為喬木鏈格孢在國(guó)內(nèi)引起白三葉草病害的首次報(bào)道。近年來，喬木鏈格孢在國(guó)內(nèi)外引起多種病害，如梨黑斑病[25]、葡萄葉斑病[26]、柑橘褐斑病[27]、蘋果斑點(diǎn)落葉病[28-29]等，由喬木鏈格孢引起的病害逐漸受到關(guān)注。

傳統(tǒng)的鏈格孢屬真菌鑒定主要基于其形態(tài)學(xué)特征，但由于其菌落形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)易受到環(huán)境的影響，容易造成鑒定結(jié)果的不準(zhǔn)確[30]。本文綜合真菌形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定方法對(duì)白三葉葉斑病病原菌進(jìn)行鑒定，并通過基因?qū)Ρ葮?gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，相對(duì)更準(zhǔn)確地鑒定了病原菌，為該病害的綜合防治提供了理論依據(jù)，但該病原菌的寄主范圍、致病機(jī)理等目前尚不明確，需要進(jìn)一步研究。