育苗溫室辣根素消毒處理效果研究

趙立群，田 文，田雅楠，曹玲玲，徐秀蘭

（1北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系，北京 100093；3北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北京蔬菜種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京 100097）

0 引言

種苗生產(chǎn)集約化是蔬菜生產(chǎn)現(xiàn)代化的第一要素。中國(guó)每年育苗移栽蔬菜的種苗需求量約為6800億～7300億株，目前全國(guó)的集約化育苗量?jī)H有1000億株，發(fā)展?jié)摿皠?shì)頭仍十分迅猛[1]。北方地區(qū)一般利用日光溫室進(jìn)行蔬菜集約化育苗生產(chǎn)，可以在設(shè)施內(nèi)進(jìn)行有效的環(huán)境調(diào)控，保證幼苗生長(zhǎng)所需環(huán)境條件[2]。規(guī)模化集約化育苗場(chǎng)年育苗量一般在500萬株以上，包括番茄、黃瓜、辣椒、茄子、西瓜、花椰菜、芹菜等多個(gè)品種[3-5]。由于蔬菜品種眾多，育苗數(shù)量較大且空間密集，各類病害可能隨種苗調(diào)運(yùn)加速傳播，育苗場(chǎng)對(duì)環(huán)境消毒和病害防治尤為重視，以免對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[6-7]。與常規(guī)蔬菜栽培生產(chǎn)溫室的消毒不同，育苗溫室無需進(jìn)行土壤消毒[8-9]，而需著重對(duì)棚室內(nèi)環(huán)境，包括棚膜內(nèi)表面和育苗床架等進(jìn)行消毒，目前尚未有利用辣根素對(duì)育苗溫室消毒處理的報(bào)道。

溫室消毒一般利用育苗淡季的7—9月間開展，高錳酸鉀+甲醛等藥劑熏蒸處理和廣譜性殺菌劑噴霧處理是最常見的2種育苗溫室消毒方式[7,10]。近年來，隨著提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和質(zhì)量安全的需求日益增加，減少使用高毒化學(xué)農(nóng)藥已成共識(shí)，生物源農(nóng)藥作為替代產(chǎn)品被越來越多地研究和應(yīng)用。其中，辣根素是從辣根Armoracia rusticana(Lam.)Gaertn.,B.Mey.etScherb.等十字花科植物中提取出來的一類次生代謝產(chǎn)物，主要化學(xué)成分為異硫氰酸烯丙酯，其對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)害蟲、病原微生物、根結(jié)線蟲、雜草等有害生物都呈現(xiàn)出良好的生物活性[11]。已有研究表明，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，辣根素對(duì)26種常見的植物病原真菌、卵菌及細(xì)菌具有不同程度的熏蒸抑制活性[12]，應(yīng)用于設(shè)施土壤消毒可以有效殺滅土壤中的微生物[13]，并減少草莓白粉病[14]、西瓜枯萎病的發(fā)病率[15]，辣根素與苦參堿復(fù)配悶棚處理可對(duì)線蟲病害進(jìn)行防控[16]。

本試驗(yàn)選取位于北京大興區(qū)、通州區(qū)的3家中大型育苗場(chǎng)的日光溫室，采用辣根素藥劑噴霧后悶棚處理方式進(jìn)行棚室消毒，對(duì)比處理前后溫室環(huán)境、棚膜及育苗床架上微生物的數(shù)量及種類，并通過ITS測(cè)序明確病害種類，分析辣根素藥劑施用對(duì)育苗溫室的消毒效果，為生產(chǎn)實(shí)踐提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

選擇位于北京通州和大興的3個(gè)育苗場(chǎng)的日光溫室（編號(hào)分別為溫室一、溫室二、溫室三），均進(jìn)行多種果菜和葉菜類蔬菜作物的集約化育苗生產(chǎn)，育苗場(chǎng)年育苗量都在800萬株以上。3個(gè)育苗溫室面積及上個(gè)生產(chǎn)年度育苗作物分別如表1所列。

表1 實(shí)驗(yàn)育苗溫室面積及生產(chǎn)情況列表

1.2 溫室消毒處理

試驗(yàn)于各育苗溫室上茬生產(chǎn)結(jié)束后（2019年6月25日—28日）進(jìn)行，溫室內(nèi)無作物。溫室消毒處理使用藥劑為：辣根素水乳劑（芥菜型，有效成分20%，云南聯(lián)創(chuàng)利民生物工程有限公司生產(chǎn)），兌水稀釋7.5倍使用，采用背負(fù)式常溫?zé)熿F機(jī)噴施，用量為450 L/hm2，施藥后密閉悶棚48 h后放風(fēng)再次取樣。

1.3 溫室空氣微生物檢測(cè)

采用自然沉降法進(jìn)行溫室空氣中的微生物種類及數(shù)量檢測(cè)[17]。溫室消毒前和消毒后分別在固定位置放置營(yíng)養(yǎng)肉汁酵母液瓊脂培養(yǎng)基(NBY)和乳酸馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(aPDA)平皿，每個(gè)溫室放置地點(diǎn)為兩端和中央（圖1），共6個(gè)位置（圖1中●位置），每個(gè)位置放置2種培養(yǎng)基各1個(gè)平板，開蓋自然沉降10 min后，用封口膜將培養(yǎng)皿密封。將培養(yǎng)皿編號(hào)后帶回實(shí)驗(yàn)室，28℃培養(yǎng)觀察菌落并計(jì)數(shù)。

圖1 溫室采樣取樣點(diǎn)示意圖

1.4 溫室設(shè)施表面微生物檢測(cè)

通過無菌擦拭棒擦拭溫室設(shè)施內(nèi)表面收集表面真菌、細(xì)菌，再進(jìn)行培養(yǎng)。具體操作如下：消毒處理前后分別在育苗溫室3處固定位置（圖1中▲位置）的棚膜及育苗床架使用無菌擦拭棒(3M SPONGE-STICK)進(jìn)行擦拭取樣，每次擦拭面積約60 cm2，擦拭棒放回樣品袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步操作。在樣品袋中加入30 mL PBS緩沖液，用均質(zhì)器震蕩30 s，將緩沖液轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，10000 r/min離心10 min，倒去上清液加入1 mL無菌水均勻懸浮沉淀，取適量懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋梯度菌懸液吸取100 μL均勻涂布到aPDA培養(yǎng)基及NBY培養(yǎng)基。每天觀察培養(yǎng)基真菌、細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并計(jì)數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)量推算出溫室設(shè)施表面的帶菌量（個(gè)/cm2），計(jì)算見公式(1)。

1.5 真菌、細(xì)菌種類鑒定

將分離到的不同種類的真菌轉(zhuǎn)移到aPDA培養(yǎng)基，細(xì)菌轉(zhuǎn)到NBY培養(yǎng)基上純化。真菌通過顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)，結(jié)合真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征，參考相關(guān)工具書和文獻(xiàn)鑒定到屬[18-19]，并通過真菌、細(xì)菌ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序分析進(jìn)一步鑒定到種[20]。詳細(xì)操作為：取真菌菌絲于1.5 mL離心管中，編號(hào)，放入液氮中充分冷卻后取出充分研磨，之后采用核酸提取試劑盒（博邁德）提取DNA。以上述提取總DNA為模板，用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21]。細(xì)菌ITS擴(kuò)增引物為8F/1492R[20]。PCR擴(kuò)增體系為2 × Easy Taq pcr Supermix 25 μL，引物2 μL，ddH2O 19 μL，檢測(cè)樣品2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃（真菌ITS）或50℃（細(xì)菌ITS）退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，終止溫度為4℃。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)片段大小后，PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司）。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，鑒定到屬或種。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)主要取得數(shù)據(jù)包括：消毒處理前后溫室空氣中真菌、細(xì)菌數(shù)量通過沉降平板檢測(cè)數(shù)據(jù)；溫室設(shè)施棚膜、育苗床表面通過擦拭采集培養(yǎng)獲得的真菌、細(xì)菌數(shù)量數(shù)據(jù)。溫室設(shè)施表面菌量數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換后比較分析。采用Minitab軟件（版本：18）對(duì)總體消毒效果進(jìn)行消毒處理、溫室地點(diǎn)的雙因素方差分析，對(duì)單個(gè)溫室的消毒處理效果進(jìn)行單因素方差分析(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒處理及不同溫室的消毒效果總體分析

綜合比較分析溫室之間與消毒處理對(duì)溫室環(huán)境微生物的影響發(fā)現(xiàn)：不同溫室間空氣中菌量即沉降平板菌量，不論真菌和細(xì)菌均存在顯著性差異，而設(shè)施表面菌量無顯著差異；消毒處理前后，溫室空氣中真菌數(shù)量及溫室設(shè)施表面細(xì)菌數(shù)量存在顯著差異，而溫室空氣中細(xì)菌數(shù)量及溫室設(shè)施表面真菌數(shù)量無顯著差異（表2）。

表2 消毒處理及不同溫室對(duì)菌落數(shù)影響的雙因素方差分析結(jié)果（P值）

2.2 消毒處理前后溫室空氣中真菌、細(xì)菌數(shù)量比較

鑒于2.1中分析得出不同溫室之間環(huán)境本身存在一定差異，分別對(duì)每個(gè)溫室消毒處理前后空氣的真菌、細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：所有溫室的沉降平板真菌菌落數(shù)量在消毒處理后均顯著下降（圖2）。同時(shí)，除溫室一消毒處理前后細(xì)菌數(shù)量差異不顯著外，另2個(gè)溫室的沉降平板的細(xì)菌菌落數(shù)在消毒處理后也顯著降低（圖3）。

圖2 消毒處理前后沉降平板真菌菌落數(shù)比較分析

圖3 消毒處理前后沉降平板細(xì)菌菌落數(shù)比較分析

2.3 消毒處理對(duì)溫室表面細(xì)菌消毒效果

根據(jù)2.1中分析消毒處理后對(duì)溫室表面的真菌數(shù)量影響不顯著，因此單獨(dú)針對(duì)每個(gè)溫室的棚膜表面和育苗床表面細(xì)菌數(shù)量做了差異性比較與分析。結(jié)果表明：3個(gè)溫室中棚膜表面、育苗床表面細(xì)菌數(shù)量在消毒處理后均有所下降。尤其溫室二和溫室三中的育苗床表面細(xì)菌帶菌數(shù)量在處理后與處理前相比顯著降低，菌落總數(shù)約降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到90%以上的殺菌效果（表3）。

表3 消毒處理對(duì)溫室設(shè)施表面細(xì)菌消毒效果

2.4 溫室環(huán)境沉降真菌、細(xì)菌種類鑒定分析

通過ITS測(cè)序鑒定出的沉降平板真菌種類主要有5 種 ：Alternaria、Rhizopus、Aspergillus、Penicillium、Curvularia，其中溫室一檢測(cè)到上述全部真菌，溫室二檢測(cè)到上述前4種真菌，溫室三檢測(cè)到上述前3種真菌。在檢測(cè)到的真菌中，Alternaria中有2個(gè)種為植物致病菌，分別是 Alternaria tenuissima、Alternaria.Alternata，通過消毒處理前后的分析比較發(fā)現(xiàn)，主要真菌尤其是植物致病菌的數(shù)量在處理后都明顯下降（表4）。此外處理前后的主要菌群有明顯變化，如溫室二處理前主要是致病菌鏈格孢Alternaria分離比率最高，占40.84%，而處理后鏈格孢比率下降，曲霉Aspergillus比例上升至63.46%。

表4 沉降平板真菌種類消毒處理前后對(duì)比

沉降平板分離純化細(xì)菌，通過ITS測(cè)序鑒定細(xì)菌類別較多，共18種（表5），但未發(fā)現(xiàn)重要植物病原細(xì)菌。

表5 沉降平板細(xì)菌種類鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，辣根素噴霧對(duì)3個(gè)育苗溫室都有較好的消毒效果，雖然3個(gè)育苗場(chǎng)地理位置相近、生產(chǎn)作物相似，但溫室內(nèi)空氣帶菌量差異顯著，可能由于空棚期進(jìn)行空氣采樣容易受到溫室周圍環(huán)境、溫室通風(fēng)情況等影響；而苗床和棚膜等設(shè)施表面帶菌量無顯著差異，則可能由于設(shè)施表面的附著菌相對(duì)固定且較空氣中數(shù)量少，主要與作物種類、發(fā)病情況、生產(chǎn)和用藥習(xí)慣等相關(guān)。

已有研究表明，一定濃度的辣根素對(duì)真菌[12-13,22]、細(xì)菌[12]都具有顯著的抑制作用，而本研究也表明，所有溫室的沉降平板真菌菌落數(shù)量在消毒處理后均顯著下降，其中2個(gè)溫室的沉降平板的細(xì)菌菌落數(shù)也在消毒處理后顯著降低。同時(shí)，消毒處理后，所有溫室棚膜表面和育苗床表面的細(xì)菌總菌量也有所下降。尤其溫室二和溫室三中的育苗床表面帶菌量在處理后顯著降低，菌落總數(shù)甚至降低了將近1個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到90%以上的殺菌效果，顯示出辣根素熏蒸對(duì)溫室環(huán)境空氣、尤其是內(nèi)部及設(shè)備表面附著菌的殺菌效果非常顯著。

本實(shí)驗(yàn)通過ITS測(cè)序鑒定出沉降平板真菌5種、細(xì)菌18種，其中含植物致病真菌鏈格孢屬2種。鏈格孢屬真菌是引起蔬菜發(fā)病的主要病原菌，可侵染約100種蔬菜，嚴(yán)重威脅著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[23]。本研究鑒定出的細(xì)極鏈格孢菌A.tenuissima、鏈格孢A.alternate2個(gè)植物致病菌種，分別可引發(fā)西蘭花黑斑病、白菜黑斑病[24]，番茄早疫病[25]及白菜黑斑病、甘藍(lán)黑斑病、青花菜黑斑病、番茄早疫病、茄子葉斑病、辣椒葉斑病[23]、甜椒黑斑病、甜椒早疫病[26]、番茄莖枯病[27]等多種病害。以番茄早疫病為例，其在集約化育苗生產(chǎn)中為常見病害，即使秧苗肉眼所見不發(fā)病，帶菌檢出率也可高達(dá)86.67%[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明蔬菜生產(chǎn)從苗期開始即容易接觸和攜帶病原菌，專業(yè)集約化育苗場(chǎng)更應(yīng)從源頭重視環(huán)境消毒和病蟲害防治，或可建立對(duì)出圃幼苗進(jìn)行常見病害抽檢，以培育無病健壯幼苗，減少苗期病害隨種苗調(diào)運(yùn)傳播，危害田間生產(chǎn)。

辣根素是自然界的天然產(chǎn)物，易降解且對(duì)環(huán)境污染的可能性極小，推進(jìn)以其為代表的植物源藥劑使用具有積極意義。本項(xiàng)研究采用辣根素進(jìn)行育苗溫室消毒處理結(jié)果表明，處理后溫室環(huán)境空氣中的真菌及細(xì)菌數(shù)量均有顯著降低，溫室設(shè)施棚膜及育苗床表面細(xì)菌量均有所下降，部分溫室育苗床表面菌落數(shù)降低達(dá)到1個(gè)數(shù)量級(jí)，效果十分顯著。同時(shí)，消毒處理還顯著降低了5類測(cè)序鑒定出的真菌，尤其是2類植物致病真菌的數(shù)量和分離比率?？傊?，本實(shí)驗(yàn)表明，辣根素作為育苗溫室消毒藥劑對(duì)溫室環(huán)境及設(shè)施表面具有較好的消毒效果，可在生產(chǎn)中進(jìn)一步推廣應(yīng)用，下一步將對(duì)辣根素作為溫室熏蒸藥劑對(duì)于植物病原細(xì)菌的殺滅效果進(jìn)行研究驗(yàn)證。