德宏州辣椒病毒病發(fā)生情況調(diào)查及其毒源種類

銀馨 岳元保 丁家盛 王根權(quán) 張培花 李翱 李學(xué)梅 段雪甜

摘要：對(duì)德宏州州內(nèi)辣椒種植地區(qū)病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在全州各縣市辣椒種植地均有病毒病的發(fā)生，發(fā)病癥狀主要以花葉、皺縮、落葉、落果、葉脈褐變、頂枯、畸形為主，單獨(dú)或混合發(fā)生，發(fā)病率在5%～30%，嚴(yán)重的達(dá)50%以上。對(duì)采自德宏州5個(gè)縣市的111份辣椒樣品進(jìn)行了DAS-ELISA、Dot-ELISA檢測(cè)以及PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，在檢測(cè)的111份樣品中，有55份辣椒樣品感染了所檢測(cè)病毒，病毒檢出率為49.55%，病毒種類有13種，其中以番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spotted virus，TZSV）占29.10%，其次是番茄花葉病毒（Tomato masaic virus）占23.64%，煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）占9.09%，泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl Thailand virus，TYLCV）、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星、中國(guó)勝紅薊黃脈病毒和PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）各占5.45%。

關(guān)鍵詞：辣椒病毒病;發(fā)病情況;ELISA檢測(cè);PCR檢測(cè)

辣椒是茄科辣椒屬的一年生草本植物，是世界上一種重要的蔬菜作物和調(diào)味品[1]。辣椒富含粗蛋白、粗脂肪、辣椒素、辣椒堿、維生素、鈣和磷等物質(zhì)，其中辣椒中維生素C含量居各種蔬菜作物之首。此外，辣椒的果實(shí)、根、莖枝均可入藥。辣椒素有“紅色藥材”之稱，能溫中散寒，健胃消食;外用能治凍瘡，風(fēng)濕痛，腰肌痛[2-3]。

辣椒病毒病是辣椒生產(chǎn)過(guò)程中的災(zāi)難性病害之一，常導(dǎo)致辣椒落葉、落花、落果，可減產(chǎn)30%～70%，甚至絕收。目前在全球范圍內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)40種以上的病毒能侵染辣椒。而且，辣椒病毒病的發(fā)生和危害呈逐年加重的趨勢(shì)[4-6]。為了明確云南省德宏州當(dāng)前辣椒病毒病的毒株種類，以期全面掌握德宏州內(nèi)的辣椒病毒病病源種類以及危害程度。于2015年底～2017年初，在德宏州的芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣、梁河縣5個(gè)縣市辣椒種植田塊進(jìn)行辣椒病毒病發(fā)病情況的調(diào)查。并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，利用DAS-ELISA和Dot-ELISA技術(shù)對(duì)德宏州5個(gè)縣市的采集的辣椒病毒病樣品進(jìn)行了常見(jiàn)病毒的血清學(xué)檢測(cè)，同時(shí)利用PCR技術(shù)對(duì)20種辣椒病毒病進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年12月～2017年2月，在德宏州的芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣、梁河縣5個(gè)縣市辣椒種植田塊調(diào)查辣椒病毒病發(fā)病情況，采集典型病毒病癥狀的辣椒葉片、嫩梢和果實(shí)樣品，并對(duì)所采集的辣椒樣品進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)和癥狀記載。將所采集的辣椒樣品分別裝入標(biāo)記自封袋中，放入-20℃的冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒病原檢測(cè)

1.2.1 番茄斑萎病毒屬病毒檢測(cè)

采集感病的辣椒典型番茄斑萎病毒病害樣品分別用tospoviruses抗血清進(jìn)行DAS-ELISA和dot-ELISA檢測(cè)，用于DAS-ELISA檢測(cè)的抗血清有INSV、IYSV和GRSV/TCSV復(fù)合抗血清購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。用于dot-ELISA的TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備，按1/3000進(jìn)行稀釋，TSWV單克隆抗體由浙江大學(xué)周雪平教授提供，按1/3000進(jìn)行稀釋。

1.2.2 菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測(cè)

采用CTAB法提取典型雙生病毒病害癥狀病株葉片總DNA。利用菜豆金色花葉病毒屬病毒簡(jiǎn)并引物PA/PB進(jìn)行PCR檢測(cè)，該引物擴(kuò)增的目的條帶為該屬病毒基因共同區(qū)及外殼蛋白保守區(qū)約500 bp的基因片段。與此同時(shí)，利用beta衛(wèi)星通用引物β01/β02和alpha衛(wèi)星通用引物UNA101/UNA102對(duì)雙生病毒典型病株進(jìn)行PCR檢測(cè)，這兩對(duì)引物的目的條帶分別為其衛(wèi)星全長(zhǎng)。PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 μmol/L dNTPs 2 μL、20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL，上海申能博彩生物科技有限公司）0.5 μL、植物總DNA 125 ng，加雙蒸水定容至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸50/90 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。紫外燈下割取目的片段，利用Axygen DNA凝膠回收試劑盒分離純化，回收產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy（Promega，Madison，WI）載體上，通過(guò)熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑選陽(yáng)性克隆，委托上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒病毒病的發(fā)生情況

根據(jù)2015～2017年田間調(diào)查結(jié)果，德宏州辣椒病毒病在德宏州芒市風(fēng)平鎮(zhèn)、瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)等辣椒主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，常見(jiàn)的發(fā)病類型有4種：（1）花葉型：病癥是葉、果出現(xiàn)不規(guī)則退綠、斑駁，嚴(yán)重時(shí)植株矮化，葉、果皺縮，果實(shí)難以轉(zhuǎn)紅或局部轉(zhuǎn)紅，僵化。（2）黃化型：病葉變黃，嚴(yán)重時(shí)形成上黃下綠，植株矮化并伴有明顯落葉。（3）壞死型：表現(xiàn)為葉片上呈現(xiàn)不規(guī)則的紅褐色和深褐色病斑、葉脈褐變壞死甚至頂枯。（4）畸形型：表現(xiàn)為葉片增厚、變小或呈蕨葉狀，植株節(jié)間縮短、矮化呈叢簇狀，病果畸形、凹凸不平，容易落果。主要以花葉和矮縮畸形混合發(fā)生比較普遍，壞死發(fā)生不成片，一般零星發(fā)生。

2.2 辣椒樣品的病毒種類分析

2015年12月～2017年2月在德宏州芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣、梁河縣5個(gè)縣市共采集了111份辣椒樣品。實(shí)驗(yàn)室病毒病檢測(cè)結(jié)果顯示，有55份辣椒樣品檢出病毒，病毒檢出率為49.55%。實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)的病毒種類共有20種，實(shí)驗(yàn)檢出病毒種類13種，其中以番茄斑萎病毒屬的番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（TZSV）為主，占29.09%，其次是番茄花葉病毒，占23.64%，煙草曲莖病毒占9.09%，泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星、中國(guó)勝紅薊黃脈病毒和PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）各占5.45%，煙草曲葉病毒、WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒）和番茄黃化曲葉病毒各占3.64%，朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒和棉花曲葉病毒Beta衛(wèi)星各占1.82%（見(jiàn)圖1）。

瑞麗共檢測(cè)到7種病毒（表1，下同）。其中，番茄花葉病毒和TZSV（番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒）檢出數(shù)均為11個(gè)樣品，占瑞麗市檢出總樣品的比率均為36.67%，是瑞麗辣椒上的優(yōu)勢(shì)毒源;其次煙草曲莖病毒、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星和中國(guó)勝紅薊黃脈病毒檢出數(shù)占瑞麗檢出總樣品的比率均為6.67%;朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒和PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）檢出數(shù)占瑞麗檢出總樣品的比率均為3.33%。隴川共檢測(cè)到9種病毒。主要以TZSV（番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒）為主，檢出數(shù)占隴川檢出總樣品的比率達(dá)21.43%;其次WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒）、番茄花葉病毒和番茄黃化曲葉病毒檢出數(shù)占隴川檢出總樣品的比率均為14.29%;泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒、煙草曲莖病毒、棉花曲葉病毒Beta衛(wèi)星、煙草曲莖病毒DNA1衛(wèi)星和中國(guó)勝紅薊黃脈病毒檢出數(shù)占隴川檢出總樣品的比率均為7.14%。盈江共檢測(cè)出4種病毒。主要以泰國(guó)番茄黃化曲葉病毒和煙草曲葉病毒為主，檢出數(shù)占盈江檢出總樣品的比率均為33.33%;其次是中國(guó)番茄黃化曲葉病毒和TZSV（番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒），檢出數(shù)占盈江檢出總樣品的比率均為16.67%。芒市共檢測(cè)出3種病毒，以煙草曲莖病毒為主，檢出數(shù)占芒市檢出總樣品的比率為50.00%，其次是TZSV（番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒）WSMoV（西瓜銀色斑駁病毒），檢出數(shù)占芒市檢出總樣品的比率均為25.00%。梁河檢測(cè)到1種病毒為PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒），檢出數(shù)占梁河檢出總樣品的比率為100.00%。

3 結(jié)論與討論

對(duì)德宏州州內(nèi)辣椒種植地區(qū)進(jìn)行了病毒病發(fā)生情況的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在全州各縣市辣椒種植地均有病毒病的發(fā)生，發(fā)病癥狀主要以花葉、皺縮、落葉、落果、葉脈褐變、頂枯、畸形為主，單獨(dú)或混合發(fā)生，發(fā)病率在5%～30%，嚴(yán)重的達(dá)50%以上。芒市風(fēng)平鎮(zhèn)、盈江縣舊城鎮(zhèn)露地番茄黃化曲葉癥狀比較明顯，以點(diǎn)片發(fā)生為主。瑞麗市勐卯鎮(zhèn)、隴川縣景罕鎮(zhèn)大多數(shù)為大棚栽培，栽培管理比較好，辣椒病毒病發(fā)病較輕，發(fā)病率大部分在5%以下。這表明栽培管理措施是控制病毒病發(fā)生的關(guān)鍵因素。

本次共采集了111份辣椒樣品進(jìn)行病毒病檢測(cè)，其中有55份辣椒樣品帶毒，病毒檢出率為49.55%，病毒種類有13種，結(jié)果表明德宏州的辣椒病毒種類較多，并且各縣市的病毒種類和優(yōu)勢(shì)毒源存在較大差異，TZSV（番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒）是，芒市、瑞麗市、隴川縣、盈江縣辣椒上的優(yōu)勢(shì)毒源，PaMMV（辣椒輕型斑駁病毒）是梁河縣辣椒上的優(yōu)勢(shì)毒源。

已有研究表明，辣椒上的病毒種類很多[5]，由于本試驗(yàn)采集樣品數(shù)量和檢測(cè)的病毒種類有限，因此引起本地區(qū)辣椒病毒病的毒源可能還有其他種類，這還需進(jìn)一步的檢測(cè)鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉易偉，胡文忠，姜愛(ài)麗，等.辣椒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其加工品的研發(fā)進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2014，35（15）：377-381.

[2] 溫變英.辣椒的營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2007（8）：38-39.

[3] 劉春艷.辣椒的食用價(jià)值[J].辣椒雜志，2006（4）：39.

[4] 汪沛，湯琳菲，雷艷，等.辣椒病毒病研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（7）：151-154.

[5] 林燕春.辣椒病毒病發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（9）：2142-2144.

[6] 劉峰.辣椒病毒病發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（6）：100-102.