A型肉毒毒素對大鼠唾液腺及22RV1荷瘤鼠瘤體攝取68Ga-PSMA-11的影響

傅文會，曾成潤，張心怡，徐婷婷，趙艷紅，張 偉，鄧永瓊，蔣曉麗，趙 巖，陳 躍*

[1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 核醫(yī)學(xué)與分子影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省院士(專家)工作站，2.皮膚科，3.醫(yī)學(xué)整形美容中心，四川 瀘州 646000]

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 20只清潔(clean, CL)級健康雄性SD大鼠[西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2018-17]，7～8周齡，體質(zhì)量200～250 g；10只無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級健康雄性BALB/C-nu裸鼠[北京華阜康生物科技公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0008]，4周齡，體質(zhì)量17～19 g。本實(shí)驗(yàn)遵從《四川省實(shí)驗(yàn)動物管理辦法》，并獲西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器68Ga-PSMA-11(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科)，A型肉毒毒素(botulinum toxin type A, BTX-A)(蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，22RV1人前列腺癌細(xì)胞株(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；Siemens Inveon型micro PET/CT和CAPINTEC CRC-25R型放射性核素活度計(jì)。

1.3 模型制備

1.3.1 SD大鼠 將20只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組大鼠和對照組大鼠，每組各10只。采用6%硫化鈉乙醇溶液于耳前及頸部脫毛，行頸部橫切口，充分暴露雙側(cè)唾液腺。以4 ml生理鹽水(normal saline, NS)復(fù)溶BTX-A(100 U)，配成2.5 U/0.1 ml BTX-A溶液。對實(shí)驗(yàn)組大鼠每側(cè)唾液腺多點(diǎn)、均勻注射2.5 U/0.1 ml BTX-A溶液，對照組大鼠以相同方法注射0.1 ml NS。注射完畢后縫合、消毒、覆蓋輸液貼，并置于CL級環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.2 荷瘤鼠 選擇處于對數(shù)生長期的22RV1人前列腺癌細(xì)胞，制成濃度約5×106個/ml單細(xì)胞懸液。于BALB/C-nu裸鼠右腋下注射0.2 ml細(xì)胞液，待瘤體生長至長徑約1.0 cm時(shí)，取10只生命狀況及瘤體生長良好、瘤體大小相似的22RV1荷瘤裸鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組裸鼠和對照組裸鼠，每組各5只；于凈化工作臺上對其行頸部橫切口，充分暴露雙側(cè)唾液腺。以10 ml NS復(fù)溶BTX-A(100 U)，配置成0.5 U/0.05 ml BTX-A溶液；對實(shí)驗(yàn)組裸鼠每側(cè)唾液腺多點(diǎn)、均勻注射0.5 U/0.05 ml BTX-A溶液，對照組裸鼠以相同方法注射0.05 ml NS。注射完畢后縫合傷口、消毒、覆蓋輸液貼，并置于實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立通氣籠盒中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.468Ga-PSMA-11 micro PET/CT

1.4.1 SD大鼠 注射后1、2、3、4、5、6、7、8、12及16周，分別經(jīng)尾靜脈予2組大鼠注射68Ga-PSMA-11 15～20 MBq(0.4～0.5 mCi)，注射30 min后將其麻醉并仰臥位保定于寬約70 mm的掃描床上，使唾液腺處于視野中央，采集顱頂至腋窩水平PET/CT圖像。參數(shù)：PET，時(shí)間窗3.438 ns，能量350～650 keV，矩陣128×128，采集10 min；CT，管電壓80 kV，管電流500 μA，放大倍數(shù)1.0，掃描10 min。

1.4.2 22RV1荷瘤鼠 注射后1、2、3、4、5及6天，分別經(jīng)尾靜脈予2組荷瘤鼠注射68Ga-PSMA-11 3.0～3.7 MBq(0.08～0.10 mCi)，注射30 min后將其麻醉并俯臥位保定于寬約38 mm掃描床上，將瘤體置于視野中央，采集全身PET/CT圖像，參數(shù)同上。

1.5 圖像分析 采用2D濾波反投影法重建圖像，以ASI Pro分析軟件處理圖像。由2位具有至少 3年工作經(jīng)驗(yàn)的核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師評價(jià)大鼠唾液腺及荷瘤鼠瘤體放射性分布情況：①以大鼠唾液腺為靶區(qū)繪制包圍唾液腺的感興趣體積(volume of interest, VOI)，以大腦為非靶區(qū)繪制5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm VOI，分別測量其最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(maximum standard uptake value, SUVmax)，計(jì)算靶/非靶比值(target/non-target, T/NT)，即唾液腺SUVmax與大腦SUVmax比值；②以荷瘤鼠瘤體為靶區(qū)，繪制包圍瘤體的VOI，以瘤體對側(cè)相應(yīng)部位為非靶區(qū)，繪制5.0 mm×5.0 mm×5.0 mm VOI，測量相應(yīng)部位SUVmax，計(jì)算T/NT，即瘤體SUVmax與本底SUVmax比值。

基于上述文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)與分析，筆者認(rèn)為可從MOOC理念引入與圖書館MOOC實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)介紹、MOOC環(huán)境下圖書館及圖書館員的“2+2”型角色定位、MOOC環(huán)境下的圖書館服務(wù)創(chuàng)新、MOOC環(huán)境下的信息素養(yǎng)教育、MOOC環(huán)境下的版權(quán)服務(wù)、MOOC平臺技術(shù)支持與優(yōu)化等6個方面，對國內(nèi)圖書館與MOOC相關(guān)問題的研究內(nèi)容進(jìn)行梳理。

1.6 SD大鼠唾液腺病理學(xué)檢查 顯像完畢后處死大鼠，分離其雙側(cè)唾液腺，并迅速置于組織固定液中8 h；之后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、再次脫水及透明、封片等處理，并于光鏡下觀察腺小葉、小葉間導(dǎo)管及血管、腺泡結(jié)構(gòu)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PET/CT顯像

2.1.1 SD大鼠 PET/CT均清晰顯示大鼠唾液腺，且鼻黏膜呈稍高顯像劑攝取，余本底攝取均較低；實(shí)驗(yàn)組大鼠雙側(cè)唾液腺攝取程度先逐漸下降，后逐漸增加(圖1)；對照組大鼠雙側(cè)唾液腺攝取程度未見明顯變化(圖1)。第1～3及16周組間唾液腺T/NT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，第4～12周實(shí)驗(yàn)組大鼠唾液腺T/NT均顯著低于對照組大鼠(P均<0.05)。見圖2。

圖1 SD大鼠68Ga-PSMA-11 micro PET/CT圖 (L：左；R：右；箭示唾液腺)

圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠與對照組大鼠SD大鼠不同時(shí)期唾液腺T/NT比較 (*：與對照組大鼠比較P<0.05)

2.1.2 22RV1荷瘤鼠 PET/CT清晰顯示實(shí)驗(yàn)組裸鼠及對照組裸鼠荷瘤鼠瘤體，2組瘤體顯像劑攝取程度均先逐漸增加，于第3～4天達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢(圖3)；腎臟及膀胱均可見大量放射性濃聚。不同時(shí)間段組間T/NT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，圖4)。

圖3 22RV1荷瘤鼠68Ga-PSMA-11 micro PET/CT圖 A.實(shí)驗(yàn)組裸鼠； B.對照組裸鼠 (L：左；R：右；紅箭示瘤體；藍(lán)箭示腎臟；黃箭示膀胱)

圖4 實(shí)驗(yàn)組裸鼠與對照組裸鼠22RV1荷瘤鼠不同時(shí)期腫瘤T/NT比較

2.2 病理學(xué)檢查 光鏡下見實(shí)驗(yàn)組大鼠及對照組大鼠唾液腺腺體結(jié)構(gòu)清楚，小葉間導(dǎo)管與血管結(jié)構(gòu)清晰，纖維結(jié)締組織間隔均勻分布，腺泡細(xì)胞排列緊密、胞漿豐富、細(xì)胞核深染、無皺縮，見圖5。

圖5 SD大鼠唾液腺病理圖(HE，×200) A.實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)； B.實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)； C.對照組大鼠左側(cè)； D.對照組大鼠右側(cè)

3 討論

PSMA放射性配體在唾液腺呈高分布，可致PSMA-RLT療效下降。177Lu-PSMA-617為PSMA-RLT代表性藥物。動物唾液腺體積小，而177Lu-PSMA-617單光子成像分辨率低，無法清晰顯示其放射性分布變化；且177Lu半衰期較長，不適用于短時(shí)間重復(fù)顯像。68Ga為正電子，其半衰期短，可用于短時(shí)間內(nèi)重復(fù)進(jìn)行的PET/CT顯像，且圖像質(zhì)量較高。本研究對大鼠唾液腺注射BTX-A后行68Ga-PSMA-11 micro PET/CT顯像，觀察其唾液腺PSMA放射性配體分布的變化，這些變化反映肉毒毒素對唾液腺攝取68Ga-PSMA-11的影響，從而間接評估肉毒毒素對唾液腺攝取177Lu-PSMA的影響。

BTX-A為抗膽堿能藥物，具有暫時(shí)性化學(xué)去神經(jīng)作用。ZEIDAN等[7]對小鼠唾液腺注射BTX與NS后行唾液腺外照射，并于不同時(shí)間點(diǎn)測定其唾液流率，結(jié)果顯示BTX組唾液流率下降程度低于NS組，表明BTX具有唾液腺外照射防護(hù)作用。BAUM等[8]報(bào)道，對1例前列腺癌患者腮腺注射BTX-A后，腮腺68Ga-PSMA分布較基線下降64%，推測該方法有望成為PSMA-RLT中保護(hù)唾液腺的有效措施。本研究實(shí)驗(yàn)組大鼠接受BTX-A注射后雙側(cè)唾液腺攝取程度先逐漸下降后逐漸增加，且注射后4～12周實(shí)驗(yàn)組大鼠唾液腺T/NT均顯著低于對照組大鼠，提示肉毒毒素可降低唾液腺攝取PSMA放射性配體，即68Ga-PSMA-11，且唾液腺功能隨時(shí)間而逐漸恢復(fù)，其放射性分布亦逐漸增加；目前對其具體機(jī)制尚不清楚，可能與失神經(jīng)支配后唾液腺萎縮導(dǎo)致PSMA表達(dá)下降有關(guān)[9-10]。注射BTX-A或NS后第16周，病理學(xué)結(jié)果顯示，2組SD大鼠唾液腺組織結(jié)構(gòu)均正常，提示上述改變?yōu)楣δ苄?，且為一過性。

2-(膦?；谆?戊二酸[2-(phosphonomethyl) pentanedioic acid, 2-PMPA]可與PSMA靶點(diǎn)競爭性結(jié)合而減少PSMA放射性配體分布。VORNOV等[11]發(fā)現(xiàn)2-PMPA降低唾液腺放射性攝取效果不佳，減少腫瘤放射性攝取高達(dá)50%；并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了JHU-2545，動物實(shí)驗(yàn)顯示JHU-2545優(yōu)先到達(dá)非惡性組織如唾液腺，且在顯著減少唾液腺放射性攝取的同時(shí)并未減少腫瘤攝取，但對其有效性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間段2組22RV1荷瘤鼠瘤體T/NT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明BTX-A并未影響其瘤體放射性攝取；此外，2組荷瘤鼠瘤體顯像劑攝取程度均先逐漸增加，至第3～4天達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢，可能原因在于第3～4天腫瘤生長呈最活躍狀態(tài)，故其放射性分布達(dá)到高峰，此后腫瘤逐漸壞死，放射性分布亦下降。

本研究的主要局限性：①未能直接觀察BTX-A對SD大鼠及22RV1荷瘤鼠唾液腺攝取177Lu-PSMA的影響；②大鼠、裸鼠唾液腺體積過小，局部注射困難，開放切口造模時(shí)創(chuàng)傷性大；③肉毒毒素主要通過與受體蛋白特異性結(jié)合而發(fā)揮作用，故其降低唾液腺PSMA放射性配體攝取很可能存在飽和效應(yīng)，而本研究未能觀察不同劑量BTX-A對唾液腺放射性攝取的影響。

綜上所述，BTX-A可有效減少大鼠唾液腺PSMA放射性配體聚集并避免影響荷瘤鼠瘤體特異性濃聚，提示其或有助于在PSMA-RLT過程中保護(hù)唾液腺，有待后續(xù)進(jìn)一步觀察。