玉米種子純度鑒定方法及應用實踐

□文/劉國棟 趙育進 于秀林 賀海員

隨著國家對糧食安全的重視，為了保證農(nóng)業(yè)精量播種的用種安全，國家推出新的農(nóng)作物質(zhì)量標準已在2021年11月份正式頒布并實施，精量播種對純度要求已提升到97%，可見玉米種子純度在生產(chǎn)應用中的重要性。玉米種子在田間生產(chǎn)過程中，由于隔離區(qū)不符合要求，去雜不嚴格，去雄不徹底，在收獲、運輸、晾曬、加工過程中，各環(huán)節(jié)把控不嚴，都有可能造成種子純度不高，嚴重影響玉米種子的產(chǎn)量優(yōu)勢。因此，種子在加工銷售前必須進行純度鑒定，以確保種子使用安全。以下，就玉米種子純度鑒定方法及在實際中的應用，做一分析：

一、玉米種子純度的鑒定方法

玉米種子繁育類型通常被分成四種類型，分別是常規(guī)種、自交系、單交種、雙交及三交種，其純度標準均不一樣。農(nóng)戶用于生產(chǎn)糧食的良種基本都屬于單交種，因此，我們針對單交種的純度檢驗進行分析討論。

按鑒定途徑一般把鑒定方法分為兩種，第一種是室內(nèi)檢驗方法，具體細分為鹽溶蛋白電泳鑒定和SSR 分子標記鑒定方法，第二種是田間種植鑒定，具體分為海南小區(qū)種植鑒定和同季跟蹤驗證鑒定，但兩者鑒定方法除時間和種植區(qū)域不同外，無本質(zhì)區(qū)別。

（一）室內(nèi)鑒定方法投入成本少，判斷鑒定快，因此得到廣大企業(yè)的廣泛應用，室內(nèi)鑒定的兩種方法也各有利弊。

1.鹽溶蛋白電泳鑒定：此方法是2001年農(nóng)業(yè)部推薦性標準，適用于玉米單交種和親本種子純度檢測。雜交種檢測結果與田間種植結果存在一定偏差，因此，需要通過回歸方程來校正數(shù)據(jù)。

2.SSR 分子標記鑒定：主要應用于育種中的遺傳圖譜構建及基因定位，現(xiàn)期，玉米品種審定都需要進行分子標記鑒定來區(qū)分種子的唯一性。

（二）種植鑒定方法投入管理成本及費用成本比較高，但為了及時準確驗證種子田間性狀及純度情況，一般采用海南小區(qū)種植鑒定。

1.結果判定的影響因素：由于種植鑒定是在室外農(nóng)田進行播種并進行跟蹤調(diào)查，播種時整地情況十分重要，播種的深淺和周圍有無陽光遮擋物都會影響鑒定的準確性.因此，必須保證鑒定田播種地塊通風透光一致，播種整地整齊一致，施肥中耕管理一致。

2.判定的時期和標準：玉米種子在一季生長過程中，不同生育時期表現(xiàn)出來的品種特性各不相同，所以，需要在不同生育時期進行調(diào)查判定，但一般品種主要在授粉期各性狀差異顯著。差異的分類主要有根系的特征特性，莖稈及節(jié)間的特征特性，葉片的生長特征類型，花絲及花藥的特殊特性等。

判定時期：主要分為苗期、拔節(jié)期、授粉期、結實期四個判定時期。但性狀表現(xiàn)最明顯的時期是開花授粉期。

判定標準：一般通過株高，株型，雄穗分枝特征，花絲、花藥顏色，果穗外型及籽粒類型等來區(qū)分判定。

二、室內(nèi)鑒定純度在實際應用中的分析

室內(nèi)鑒定主要方法是鹽溶蛋白鑒定方法，其投入成本低，也是注冊3000萬種子公司的基本檢測要求。因為該方法檢測不僅具有穩(wěn)定性及重演性強、分辨率高，且操作簡單、檢測速度快等特點，因此，該方法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到大力的推廣和應用，種子市場也出現(xiàn)了專職的此類檢驗機構，但此方法檢測也存在一定的檢測局限性，同時，該判定標準需要進一步的完善修正。鹽溶蛋白鑒定純度結果的分析：

（一）鹽溶蛋白鑒定判斷自交和雜粒的差異

鹽溶蛋白鑒定是通過對蛋白組合的差異來進行雜交種的分類判定，種子自交判定依據(jù)是沒有在互補帶位置出現(xiàn)父母本共有譜帶，是譜帶的缺失，可以直接判斷出來，其田間表現(xiàn)差異非常明顯，田間產(chǎn)量差異也比較懸殊。譜帶位置不一致則判定其為雜粒，一般存在譜帶多帶現(xiàn)象，但并不能代表其田間表現(xiàn)差異，我們鑒定純度的意義在于保證種子田間生產(chǎn)的安全性，有些蛋白基因存在差異只是影響種子的硬殼顏色等細小田間性狀，并不影響作物的田間生成的整齊性及生育期等生理特征。

（二）結果判定的回歸方程應用

鹽溶蛋白純度鑒定要利用回歸方程，Y=52.9+0.461X（Y 是純度值，X 是電泳值）。因此，種子純度值并不直接等于電泳判定值，它們之間存在一定的相關性。當電泳鑒定結果為93.5%時，其校正純度值為96%，剛好達到種子的純度質(zhì)量標準最低要求。為了使結果準確可靠，檢測樣品量必須符合4n 原則，n=1/（1-96%）。因此，鑒定種子純度不僅與取樣代表性有關，其檢測量也必須達到最低標準要求。一般檢測雜交種的種子純度，其要求純度最低是96%，據(jù)4n原則，檢測種子樣品量必須達到100 粒。因此，檢測親本種子純度，其要求純度標準是98%時，據(jù)4n原則，檢測種子樣品量必須達到200 粒，標準是99%時，檢測種子樣品量必須達到400 粒，且質(zhì)量標準要求為98%以上時，一般不采用回歸方程。

三、小區(qū)種植鑒定在實際應用中的分析

一般海南小區(qū)種植鑒定在生產(chǎn)過程中意義重大，對于自交系品種可以提前準確判定純度，保證田間制種安全。對于雜交種室內(nèi)鑒定無法判斷的或存在問題的批次，進行海南小區(qū)種植鑒定，可以準確判定雜交種的大田生產(chǎn)使用安全。

而同季播種小區(qū)種子鑒定，主要是判定田間性狀與室內(nèi)檢測結果的一致性，主要針對不容易判定結果的譜帶類型，相對海南小區(qū)鑒定成本較低，同時，全程跟蹤種子各時期差異性狀的記錄調(diào)查。

四、鹽溶蛋白鑒定法在應用中存在的問題

大部分種子室內(nèi)檢測結果和田間表現(xiàn)一致，但有些特殊品種其表現(xiàn)存在差異，需要特殊記錄識別和區(qū)分。

（一）鑒定標準與田間表現(xiàn)的差異

我們鑒定的雜交種，必須保證其親本種子的遺傳性狀穩(wěn)定，因為提取的可識別鹽溶蛋白只是品種基因表達的一部分，有些品種室內(nèi)鑒定并不能完全識別田間差異。比如，鑒定的某一品種類型，室內(nèi)鑒定譜帶整齊一致，但田間表現(xiàn)為嚴重的株高穗位兩極分化，此類玉米主要是由于親本遺傳性狀尚不穩(wěn)定，存在一定的生產(chǎn)安全；還有一種類型，室內(nèi)鑒定譜帶存在兩到三種類型，但田間表現(xiàn)卻為整齊一致，此類玉米主要是由于親本自交代數(shù)不夠，導致二代田間性狀分離，也存在一定的生產(chǎn)質(zhì)量安全。

（二）鹽溶蛋白鑒定的操作手法及注意事項

1.磨樣及提?。悍N子樣品磨碎時，一定要防止樣品間的交叉污染?，F(xiàn)期，主要的磨樣工具是電動單籽粒粉碎器，使用時，每個籽粒研磨結束，用毛刷或洗耳球清理設備上籽粒樣品的殘余。用于接樣品的紙必須保證表面光滑，每次接樣后輕彈接樣紙確保上一樣品清理干凈。樣品提取時，提取液放置量一定要一致，保證提取蛋白量一致，對于樣品倒入離心管時有樣品出現(xiàn)散失現(xiàn)象的，一定要放棄該籽粒樣品，因樣品中可能缺失種胚物質(zhì)，對最終判定造成影響。當樣品水分高時，可放于40℃條件下進行烘干1～2小時。

2.配藥及制板：配藥要嚴格按照標準要求進行精量稱取，配好藥液要放于冰箱低溫中冷藏，保證制板的凝膠效果，一般分離膠可放置10 天，濃縮膠可放置5 天。封底縫操作要快，因其氧化劑放置量是正常膠片的兩倍，凝膠速度特別快，低縫封閉完，一定要用濾紙吸附膠面上的水，以保證灌膠時膠面的連續(xù)性。

3.點樣及清洗：重點注意事項是點樣量在樣品槽內(nèi)的高度。量大導致樣品量向兩側(cè)溢出，導致樣品混雜，量少時，灌電極緩沖液時容易形成中空不連續(xù)液面，無法電泳。且每點完一粒樣品，必須在蒸餾水中清選針管2～3次。

4.電泳：主要是電泳槽正負極與連線千萬別顛倒了，否則樣品逆向移動。電泳使用穩(wěn)壓設備，電壓控制在500 伏，電流會在不同時間段發(fā)生變化，一般電泳控制在40分鐘左右，以電泳指示劑移動位置、指示劑接近槽底為宜，千萬不能越過地面，造成部分蛋白涌出膠面，無法識別。

5.洗板：電泳結束后，倒出電極液，迅速放置冷水中進行卸板，這樣操作可以快速完整的分離出膠片，不至于黏連膠板，造成膠片無法剝離或破損。

6.染色：一般染色可放置在常溫下染色一晚上，不耽誤其它操作，又能達到染色分辨效果，如果要求鑒定結果比較著急，可將膠片放于40℃環(huán)境下，染色1～2小時即可達到染色效果。

7.判定：判定依據(jù)相關要求標準進行即可。但由于品種類型不同，判定不同品種需要依靠鑒定不同品種的經(jīng)驗積累，也就是除了回歸方程的利用，還要結合田間種植鑒定，參照田間種植鑒定進行綜合判定。

綜上，種子的純度鑒定，要結合實際應用來選擇合適的方法，室內(nèi)試驗判定要結合田間種植鑒定結果來參考?？傊?，純度鑒定其操作方法要標準統(tǒng)一，判斷依據(jù)要特征顯著，室內(nèi)判定要結合室外田間表現(xiàn)來綜合判斷。