黃病毒科和冠狀病毒科病毒侵染中的外泌體研究進(jìn)展*

任永雯 李鵬 張磊亮

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南 250062）

1 外泌體

外泌體是大小為30～150 nm的膜包裹細(xì)胞外微泡，屬于一種細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）［1］。它 是 由 多 泡 體（multivesicular body，MVB）通過(guò)內(nèi)體途徑分泌的小泡，存在于各種體液中，如血液、精液、腦脊液、羊水、腹水、膽汁和母乳等。它在細(xì)胞間通訊、免疫調(diào)節(jié)和病毒傳播中起重要作用，具有與其他細(xì)胞外囊泡，如微泡、遷移體、凋亡體等不同的特點(diǎn)。但是，在不同的研究領(lǐng)域，囊泡的命名和分類(lèi)存在著混淆和巧合，這有待研究人員用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)給予細(xì)胞外囊泡分類(lèi)。

外泌體起源于多泡體，而這些多泡體從早期的內(nèi)體中萌芽。早期內(nèi)體形成多泡體的發(fā)育過(guò)程分為4個(gè)階段：內(nèi)吞囊泡結(jié)構(gòu)、前多泡體、蒼白的多泡體和致密的多泡體（又稱(chēng)晚期核內(nèi)體）［2］。成熟核內(nèi)體包含的腔內(nèi)小泡（intraluminal vesciles，ILVs）有兩種不同的命運(yùn)：a.與質(zhì)膜融合并將ILVs釋放到細(xì)胞外環(huán)境的囊泡，稱(chēng)為外泌體；b.未與質(zhì)膜融合的MVB將與胞內(nèi)溶酶體結(jié)合，最終被降解［3］。

外泌體能夠同時(shí)攜帶胞內(nèi)和胞外物質(zhì)，這可能與運(yùn)輸需要的內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）機(jī)制 有關(guān)，因此，Alix和TSG101等ESCRT蛋白在外泌體中富集作為外泌體的標(biāo)志物［4-5］。在外泌體中也檢測(cè)到其他蛋白質(zhì)，如脂質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白和小泡蛋白，以及膜運(yùn)輸相關(guān)蛋白，CD9、CD63和CD81等，它們進(jìn)入外泌體也需要ESCRT機(jī)制的分選［6-7］。然而，運(yùn)用ESCRT機(jī)制并不是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)入外泌體的唯一方法，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA亦可以通過(guò)許多其他機(jī)制進(jìn)入外泌體，如神經(jīng)酰胺途徑［8］和四跨膜蛋白復(fù)合物的寡聚化［9］。

2 外泌體在黃病毒科病毒感染過(guò)程中的作用

黃病毒科病毒是單股正鏈包膜RNA病毒，直徑大約50～70 nm［10］，包括許多重要的人類(lèi)病原體如登革病毒（Dengue virus，DENV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）、西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）和 蘭 加 特 病 毒（Langat virus，LGTV）等［11］。大多數(shù)黃病毒科病毒通過(guò)吸血的節(jié)肢動(dòng)物（如蚊子、蜱蟲(chóng)等）傳播，在世界范圍內(nèi)引起各種新發(fā)和再發(fā)傳染病，從而對(duì)全球公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［12-13］。例如，2015年在巴西暴發(fā)過(guò)寨卡病毒疫情［14］，近年來(lái)在某些地區(qū)發(fā)生了日本腦炎病毒和西尼羅病毒的流行［15］。有研究估計(jì)，世界上有40%以上的地區(qū)面臨黃病毒科病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止，除丙肝病毒外，臨床治療黃病毒科病毒感染還沒(méi)有特異性的抗病毒藥物［16］。因此，抗黃病毒科病毒感染的研究仍然極為迫切。

外泌體起源于內(nèi)體，而一些黃病毒科病毒如丙型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒和西尼羅病毒則可以進(jìn)入晚期內(nèi)體［17-18］，這或許是病毒蛋白和RNA被分選進(jìn)入外泌體的原因之一。例如，丙型肝炎病毒基因組RNA可以進(jìn)入外泌體，并且該外泌體具有感染性［19］。攜帶病毒蛋白和RNA的外泌體不僅被賦予了新的生物功能，還能影響宿主免疫應(yīng)答。但是，病毒蛋白和RNA進(jìn)入外泌體的機(jī)制尚不明確。重要的是，外泌體介導(dǎo)了病毒與宿主的相互作用，這將為外泌體成為抗病毒治療的有效靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)。

2.1 登革病毒

DENV是一種重要的由節(jié)肢動(dòng)物傳播的黃病毒科病毒，分為DENV1～4共四個(gè)血清型，主要通過(guò)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，引起從無(wú)癥狀到頭痛、全身肌肉疼痛、休克和典型的登革熱等癥狀［20-21］。DENV與外泌體的密切關(guān)系近年來(lái)才為人所知，來(lái)自感染DENV細(xì)胞的外泌體可以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，從而影響DENV傳播。

Vora等［22］從感染DENV2或3的白紋伊蚊和埃及伊蚊體外細(xì)胞系中分離出的細(xì)胞外囊泡（包括外泌體）中發(fā)現(xiàn)了病毒RNA、E蛋白和完整的DENV基因組，這些EVs具有傳播到蚊子和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DENV2感染上調(diào)了與E蛋白直接相互作用的四跨膜糖蛋白Tsp29Fb的表達(dá)。用外泌體產(chǎn)生和釋放的抑制劑GW4869處理細(xì)胞后，不僅減少了宿主細(xì)胞及細(xì)胞外囊泡中病毒載量，還削弱了Tsp29Fb與E蛋白相互作用，更直接影響了EVs介導(dǎo)的病毒RNA和蛋白質(zhì)向人類(lèi)細(xì)胞的傳遞［22］。鑒于細(xì)胞外囊泡可分為不同類(lèi)型，其在病毒感染過(guò)程中具有重要作用，Reyes-Ruiz等［23］在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了外泌體與DENV的關(guān)系，感染DENV的節(jié)肢動(dòng)物C3/36細(xì)胞分泌的外泌體呈“杯狀”結(jié)構(gòu)，與人類(lèi)細(xì)胞的外泌體類(lèi)似，含有四跨膜蛋白AalCD9和AalCD81，也含有GAPDH等宿主蛋白。他們還發(fā)現(xiàn)，DENV感染的C3/36細(xì)胞分泌的外泌體體積大于來(lái)自未感染細(xì)胞的外泌體，是因?yàn)檫@些外泌體內(nèi)有約55 nm的球形病毒樣顆粒，該外泌體純化后具有感染潛力，可以再次感染C3/36細(xì)胞。這些證據(jù)表明，外泌體是DENV進(jìn)行細(xì)胞間傳播的新途徑。

在外泌體介導(dǎo)的抗病毒方面，宿主細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)參與的抗病毒作用已在DENV感染細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡/外泌體中被發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，感染DENV3的樹(shù)突細(xì)胞分泌的小EVs（＜200 nm）同樣呈“杯狀”，不僅含有四跨膜蛋白（CD9、CD81、CD63）和一些病毒組分，還包含一些miRNA（如miR4327、miR1246、miR1261、miR142等）和39種mRNA（如RPS13、GSTT1、COX7C、GRHPR、TXNL4A、NDUFB7、DDX58、IFIT1和IFITM1等）［24］。這里的EVs與上述外泌體具有類(lèi)似的特點(diǎn)以及內(nèi)容物，但是否為外泌體，作者并未指明。

存在于DENV感染細(xì)胞內(nèi)的miRNA，作為生物標(biāo)志物可以被EVs釋放。其中，miR4327僅可在DENV急性感染或者在出血型DENV3-5532株的病人中檢測(cè)到，而在輕型DENV3-290株感染患者、流感病毒感染患者、DENV感染康復(fù)者和健康者體內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到，使得miR4327有可能成為檢測(cè)DENV嚴(yán)重感染的特異性標(biāo)志物。此外，EVs中的這些mRNA通常可以編碼輔助建立抗病毒反應(yīng)的蛋白質(zhì)或者直接抵抗病毒感染的蛋白質(zhì)，受體細(xì)胞可以利用EVs蛋白免受病毒感染。Zhu等［25］則詳細(xì)驗(yàn)證了干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3（interferoninducible transmemberane protein，IFITM3）在抑制包膜病毒進(jìn)入、調(diào)節(jié)病毒受體表達(dá)等方面的作用。IFITM3被證實(shí)存在于細(xì)胞外泌體中并可被外泌體釋放到細(xì)胞外。當(dāng)宿主細(xì)胞被DENV2感染，IFITM3可以通過(guò)外泌體從感染細(xì)胞傳遞到非感染細(xì)胞，從而抑制DENV的進(jìn)入與感染。另外，干擾素處理后的EVs也可以保護(hù)其他細(xì)胞免受DENV感染［24-25］。另外，CLEC5A（一種針對(duì)黃病毒科病毒和細(xì)菌的模式識(shí)別受體）和CLEC2（活化血小板的蛇毒聚集素受體）是脾酪氨酸激酶（Syk）偶聯(lián)的c型凝集素受體，分別在白細(xì)胞和血小板中大量表達(dá)。DENV通過(guò)激活CLEC2促進(jìn)血小板釋放外泌體和微泡，DENV誘導(dǎo)的外泌體可激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的CLEC5A和TLR2，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外陷阱的形成和促炎細(xì)胞因子的釋放。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，阻斷CLEC5A和TLR2可有效減弱DENV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，該研究將有助于開(kāi)發(fā)新的急性病毒感染的治療方法［26］。

在蚊子細(xì)胞內(nèi)，DENV可以利用外泌體途徑促進(jìn)感染，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過(guò)這種途徑向鄰近細(xì)胞傳遞信號(hào)進(jìn)行抗病毒免疫反應(yīng)以維持細(xì)胞自我穩(wěn)定。蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等物質(zhì)可通過(guò)外泌體被運(yùn)輸?shù)洁徑?xì)胞或遠(yuǎn)區(qū)細(xì)胞以調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理和病理過(guò)程，因此外泌體將有可能作為抗病毒感染以及預(yù)防病毒感染的極佳手段。這些研究為未來(lái)以外泌體為靶點(diǎn)的抗病毒研究發(fā)展提供重要的理論依據(jù)且具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

2.2 寨卡病毒（ZIKV）

ZIKV自從南美洲暴發(fā)以來(lái)，蔓延到了許多地區(qū)，使得數(shù)百萬(wàn)人被感染。雖然大多數(shù)患者無(wú)癥狀或癥狀輕微，但是部分感染可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，引起嚴(yán)重的神經(jīng)并發(fā)癥，如腦膜炎和格林-巴利綜合征［27］。

ZIKV利用外泌體為媒介在神經(jīng)元細(xì)胞間進(jìn)行傳播。與DENV感染細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體類(lèi)似，ZIKV感染促進(jìn)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞釋放的外泌體，其體積大于來(lái)自未感染細(xì)胞的外泌體，并含有ZIKV RNA和E蛋白，對(duì)幼稚皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞具有高度傳染性。有趣的是，外泌體內(nèi)的ZIKV RNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的幼稚皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)不僅具有傳染性，還具有活性和可復(fù)制性。進(jìn)一步研究表明，在ZIKV感染后，神經(jīng)元外泌體產(chǎn)生和釋放的調(diào)控取決于于中性鞘磷脂酶（nSMase）-2/SMPD3是否被激活并表達(dá)。因此，使用抑制劑GW4869或沉默SMPD3可以降低皮層神經(jīng)元外泌體介導(dǎo)的病毒傳播和病毒載量［28］。該研究為理解外泌體在ZIKV感染中的重要性提供了一個(gè)新的觀(guān)點(diǎn)。

外泌體可以介導(dǎo)抗ZIKV感染。干擾素和內(nèi)源性防御素等天然免疫蛋白是機(jī)體抵抗病原體入侵的第一道防線(xiàn)，可以預(yù)防多種病毒感染，如：人類(lèi)免疫缺陷病毒、甲型流感病毒、人類(lèi)乳頭瘤病毒等。IFN-β已被證明可以誘導(dǎo)一些lncRNA，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)和自然殺傷（NK）細(xì)胞的活性。IFNβ誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能進(jìn)入NK細(xì)胞，外泌體貨物linc-EPHA6-1作為hsa-miR-4485（與NKp46的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合，調(diào)節(jié)NKp46的表達(dá)）的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA，上調(diào)NK細(xì)胞受體（NKp46）表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性，抵抗ZIKV感染A549細(xì)胞［29］。另外，最近有研究發(fā)現(xiàn)：外泌體介導(dǎo)的防御素α1B（defensin alpha 1B，DEFA1B）可以抗ZIKV感染。相較于未感染ZIKV的A549細(xì)胞，感染細(xì)胞產(chǎn)生外泌體DEFA1B的mRNA水平明顯升高，并且在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒證明：DEFA1B以劑量依賴(lài)的方式抑制ZIKV復(fù)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DEFA1B能與原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體1（origin recognition complex 1，ORC1）相互作用并阻止ORC1進(jìn)入細(xì)胞核，抑制DNA復(fù)制從而延緩細(xì)胞周期。由于延緩的細(xì)胞周期與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)［30］，而作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的外泌體很容易穿過(guò)血腦屏障和胎盤(pán)屏障［31-32］，那么這種現(xiàn)象可能與ZIKV感染造成的小頭癥有關(guān)。有趣的是，A549細(xì)胞分泌的含有DEFA1B的外泌體能被HEK293T和SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)化，從而將延緩細(xì)胞周期的作用傳遞給受體細(xì)胞［33］。

內(nèi)源性限制因子IFITM3不僅能抑制DENV感染，還能抑制ZIKV進(jìn)入宿主細(xì)胞并抑制病毒復(fù)制［34］；IFITM3外顯子定位于溶酶體或晚期內(nèi)體，EVs傳遞的外源IFITM3通過(guò)內(nèi)溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)并阻斷病毒進(jìn)入。相反，含有IFITM3突變體的EVs不能有效地傳遞到內(nèi)溶酶體，不能抑制病毒復(fù)制或保護(hù)細(xì)胞免受感染。此外，胎盤(pán)中IFN刺激基因（ISG）的組成性表達(dá)，包括IFITM1和IFITM3，被認(rèn)為是保護(hù)發(fā)育中胎兒免受病毒感染的內(nèi)在機(jī)制。然而，與胎盤(pán)相比，發(fā)育中胎兒器官的IFITM水平較低［35］，為ZIKV在胎兒中復(fù)制提供了機(jī)會(huì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，外泌體能有效穿過(guò)胎盤(pán)屏障傳遞IFITM3抑制胎兒體內(nèi)ZIKV的復(fù)制并減輕小鼠母體和胎兒的病毒血癥，并且外泌體IFITM3不會(huì)對(duì)懷孕的小鼠和胎兒造成不良影響或產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)［36］。該研究為以外泌體為載體控制宮內(nèi)感染提供了可能性。

唾液是ZIKV在人與人之間傳播的可能來(lái)源，因?yàn)椴《緯?huì)進(jìn)入唾液。研究人員發(fā)現(xiàn)，生理濃度的混合唾液通過(guò)阻止病毒黏附到靶細(xì)胞而劑量依賴(lài)性地抑制ZIKV感染猴和人細(xì)胞。唾液中的抗ZIKV活性不能通過(guò)煮沸來(lái)消除，這表明抗病毒因子不是一種蛋白質(zhì)；因此他們發(fā)現(xiàn)是唾液中的細(xì)胞外囊泡（包括外泌體）以生理濃度阻止ZIKV與靶細(xì)胞的黏附和感染，從而可以抑制ZIKV感染。需要注意的是，唾液的抗ZIKV活性是保守的，但抑制程度因個(gè)體而異［37］。這項(xiàng)研究為未發(fā)現(xiàn)ZIKV通過(guò)唾液傳播的原因提供了一個(gè)合理的解釋?zhuān)⑶易C明口腔先天免疫防御機(jī)制對(duì)抗某些病毒病原體有重要作用。

根據(jù)以上研究報(bào)道，外泌體作為一種將新穎有效并安全的抗病毒策略，不僅轉(zhuǎn)運(yùn)病毒組分以及抗病毒物質(zhì)（表1），而且影響受體細(xì)胞或組織的生理功能以及免疫應(yīng)答，為穿過(guò)各種生物屏障抵抗病毒感染提供了有效工具。

2.3 丙型肝炎病毒（HCV）

HCV屬于黃病毒科肝炎病毒屬，是慢性肝炎的主要病因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有7 100萬(wàn)人感染HCV，自2012年起，中國(guó)發(fā)病人數(shù)每年約20多萬(wàn)。長(zhǎng)期慢性HCV感染常導(dǎo)致多種肝臟疾病，包括脂肪變性、肝硬化和肝細(xì)胞癌［38］?？茖W(xué)研究表明，來(lái)自HCV感染細(xì)胞的外泌體含有病毒RNA并促進(jìn)新的感染。

與其他黃病毒科病毒類(lèi)似，在HCV感染細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了病毒包膜蛋白以及病毒RNA。HCV感染Huh7.5.1細(xì)胞，病毒蛋白E2除了可以組成感染性HCV顆粒，還被外泌體攜帶在囊泡表面；該類(lèi)外泌體具有降低HCV對(duì)E2特異性抗體的敏感性，協(xié)助HCV逃避中和抗體的作用［39］。而在HCV患者血漿和HCV感染的肝細(xì)胞上清液中分離出的外泌體含有病毒RNA，可以驅(qū)動(dòng)單核細(xì)胞向髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）分化，進(jìn)而促進(jìn)T濾泡調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)節(jié)分化并抑制T濾泡輔助細(xì)胞的功能。這種MDSCs介導(dǎo)的T細(xì)胞失調(diào)使得外周血中T濾泡調(diào)節(jié)細(xì)胞/T濾泡輔助細(xì)胞的比率以及IL-10的產(chǎn)生增加。而經(jīng)過(guò)抗病毒治療的患者血漿分離的外泌體則不含病毒RNA，也無(wú)法誘導(dǎo)髓源性抑制細(xì)胞的分化。另外，HCV感染細(xì)胞分泌的外泌體可以抑制健康髓細(xì)胞miR-124的表達(dá)［40］。這項(xiàng)研究揭示了HCV感染期間免疫失調(diào)的新機(jī)制。

microRNA（miRNA）是外泌體的重要成分之一，不僅能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)，還可以介導(dǎo)宿主抗病毒免疫反應(yīng)。Kim等［41］前期研究發(fā)現(xiàn)，HCV侵染肝細(xì)胞能誘導(dǎo)miR-192表達(dá)，從而上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）。他們發(fā)現(xiàn)，外泌體將miR-192從病毒復(fù)制的肝細(xì)胞傳送到肝星狀細(xì)胞；在肝星狀細(xì)胞中，miRNA通過(guò)上調(diào)TGF-β1來(lái)上調(diào)肝纖維化標(biāo)志物COL1A1和a-SMA等表達(dá)，造成肝星狀細(xì)胞被激活并分化為成纖維細(xì)胞。相應(yīng)的，如果將HCV侵染的肝細(xì)胞用抗miR-192處理，那么將不僅降低外泌體內(nèi)的miR192，還抑制肝星狀細(xì)胞的分化。另有一項(xiàng)研究［42］闡明了外泌體miRNA與利妥昔單抗（rituximab）相關(guān)的HCV活性增強(qiáng)的關(guān)系。利妥昔單抗是人類(lèi)CD20的特異性單克隆抗體，能造成B細(xì)胞耗竭。在HCV感染患者體內(nèi)，miR-155能促進(jìn)B細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)。Liao等［42］用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明：利妥昔單抗可誘導(dǎo)B細(xì)胞耗竭，影響細(xì)胞內(nèi)miR-155的產(chǎn)生及外泌體miR-155的傳遞，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)HCV活性。他們還發(fā)現(xiàn)，與未感染HCV的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者相比，HCV感染合并類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的患者血清樣本中的外泌體和外泌體miR-155水平顯著增強(qiáng)［43］。另外TLR3誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞外泌體的miRNA29家族也能有效地抑制HCV在Huh7細(xì)胞中的復(fù)制［44］。所以，外泌體miRNA可能成為一種潛在的HCV治療靶點(diǎn)［42］。

2.4 日本腦炎病毒（JEV）

JEV是亞太地區(qū)黃病毒腦炎的主要病原體。絕大多數(shù)感染病毒的人沒(méi)有明顯癥狀，但在少數(shù)感染病例中仍會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，特別是在兒童中死亡率很高。大多數(shù)存活下來(lái)的感染者往往遺留永久性的神經(jīng)缺陷，包括癲癇、癱瘓和智力遲鈍［45］。

腦脊液中存在大量外泌體，而腦脊液中循環(huán)miRNA的改變與多種神經(jīng)性疾病相關(guān)。Goswami等［46］研究JEV感染患者腦脊液外泌體miRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)：有10種miRNA上調(diào)，6種miRNA下調(diào)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)JEV感染患者腦脊液外泌體miR-21-5p、miR-150-5p和miR-342-3p的表達(dá)顯著上調(diào)，小鼠模型實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了這一變化，這3種miRNA在感染JEV的急性腦炎患者腦脊液中特異性循環(huán)。有趣的是，在不同細(xì)胞中，miRNA表達(dá)存在差異，例如檢測(cè)從體外感染JEV神經(jīng)元細(xì)胞上清中提取的外泌體，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p和miR-150-5p表達(dá)上調(diào)，而在小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-342-3p表達(dá)上調(diào)。用疫苗株SA14-14-2感染細(xì)胞后，這3種miRNA的水平不再被上調(diào)，這表明病毒復(fù)制可能與外泌體miRNA上調(diào)相關(guān)。對(duì)這些miRNAs假定靶基因的通路分析表明，miR-21-5p、miR-342-3p和miR-150-5p的靶基因參與了TGF-β、NGF、軸突引導(dǎo)和MAPK信號(hào)通路［46］。以上證據(jù)表明：外泌體miRNA不僅參與了JEV的感染，還可能在宿主抵抗病毒感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，miRNA不僅可以作為疾病診斷的指標(biāo)，也可作為抗JEV的靶點(diǎn)。

2.5 蘭加特病毒（LGTV）

LGTV發(fā)現(xiàn)于馬來(lái)西亞蘭加特森林，主要通過(guò)蜱蟲(chóng)叮咬傳播，引起蘭加特腦炎。人類(lèi)對(duì)LGTV從節(jié)肢動(dòng)物傳播到脊椎動(dòng)物宿主的過(guò)程了解甚少。一項(xiàng)研究首次表明，LGTV侵染ISE6蜱細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞能促進(jìn)外泌體的產(chǎn)生和釋放，該外泌體含有大量的LGTV RNA、病毒包膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1），它們具有感染性和復(fù)制性，能從節(jié)肢動(dòng)物傳播到人皮膚角質(zhì)細(xì)胞和血液內(nèi)皮細(xì)胞。重要的是，感染的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體依賴(lài)網(wǎng)格蛋白通過(guò)血腦屏障，促進(jìn)LGTV RNA和蛋白質(zhì)向神經(jīng)元細(xì)胞傳遞。GW4869可抑制外泌體中LGTV的載量和釋放，從而影響LGTV RNA和蛋白質(zhì)在節(jié)肢動(dòng)物和脊椎動(dòng)物宿主細(xì)胞中的傳遞［47］。近期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LGTV存在蜱蟲(chóng)體內(nèi)或在蜱細(xì)胞內(nèi)時(shí)，節(jié)肢動(dòng)物IsSMase（inhibits sphingomyelinase，一種鞘磷脂D，能催化鞘磷脂等底物的裂解）的表達(dá)明顯下降，這表明IsSMase的下降水平與蜱細(xì)胞蘭加特病毒復(fù)制活性下降水平相關(guān)。LGTV感染誘導(dǎo)IsSMase使鞘磷脂增多，與膜相關(guān)的病毒復(fù)制和外泌體的發(fā)生有關(guān)。GW4869能逆轉(zhuǎn)IsSMase的活性和表達(dá)水平并降低病毒載量和鞘磷脂的積累［48］。與其他黃病毒科病毒一樣，LGTV利用節(jié)肢動(dòng)物源性外泌體作為病毒RNA和蛋白質(zhì)從載體傳遞的新途徑，這些外泌體在宿主內(nèi)傳播可能導(dǎo)致神經(jīng)侵襲和神經(jīng)發(fā)生，但宿主相關(guān)蛋白能抑制病毒復(fù)制。

2.6 西尼羅病毒（WNV）

WNV可引起發(fā)熱和神經(jīng)侵入性疾病，如腦炎和脊髓灰質(zhì)炎。它會(huì)引起老年人和免疫功能低下患者的嚴(yán)重疾病，通常會(huì)增加死亡風(fēng)險(xiǎn)［49-50］。病毒感染會(huì)改變細(xì)胞外囊泡的分子組成，研究人員發(fā)現(xiàn)WNV感染產(chǎn)生的外泌體不僅含有不具感染性的病毒粒子和病毒RNA，還會(huì)改變外泌體內(nèi)來(lái)自宿主細(xì)胞的RNA水平，如microRNA、小非編碼RNA（sncRNAs）和mRNA。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：WNV感染過(guò)程中有依賴(lài)干擾素和不依賴(lài)干擾素的過(guò)程參與調(diào)控RNA進(jìn)入EVs；感染細(xì)胞被IFN-α處理后，對(duì)外泌體內(nèi)宿主mRNA和miRNA影響顯著高于sncRNA。深入研究發(fā)現(xiàn)，感染細(xì)胞分泌的外泌體含有的mRNA參與Wnt信號(hào)和I型干擾素信號(hào)途徑；外泌體內(nèi)一些小片段RNA（＜300 nt）使得天然免疫應(yīng)答基因MDA5、TRIM25和ISG15等表達(dá)升高從而產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)［51］。

Table 1 Interplay between exosome and Flaviviridae表1外泌體與黃病毒科病毒相互作用

根據(jù)以上研究報(bào)道，外泌體不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)病毒組分促進(jìn)病毒感染，而且可能作為一種新穎、安全有效的抗病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)抗病毒物質(zhì)（表1），影響受體細(xì)胞或組織的生理功能以及免疫應(yīng)答，還為穿過(guò)各種生物屏障從而抵抗病毒感染提供了有效工具。

3 外泌體與冠狀病毒的相互作用

冠狀病毒，因其表面的冠狀突起而得名，是單正鏈RNA包膜病毒。冠狀病毒科分為冠狀病毒亞科（Coronavirinae）和環(huán)曲病毒亞科（Torovirinae）。其中冠狀病毒亞科又分為α、β、γ和δ 4個(gè)屬。HCoV-OC43和HCoV-229E最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代末，而HCoV-NL63和HCoVHKU1分別發(fā)現(xiàn)于2004年和2005年。α和β冠狀病毒只感染哺乳動(dòng)物，通常引起人類(lèi)的呼吸系統(tǒng)癥狀和其他動(dòng)物的胃腸炎［52-53］。α冠狀病毒（HCoVNL63和HCoV-229E）和β冠狀病毒（HCoV-OC43和HCoV-HKU1）通常只引起輕微的普通感冒癥狀。在2002～2003年，嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）引起了一場(chǎng)SARS流行，死亡率約10%［54］。中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）由單峰駱駝傳播給人類(lèi)，在2012年造成了嚴(yán)重的流行，死亡率為37%［55］。2019年12月下旬開(kāi)始暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原體是新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。

3.1 豬流行性腹瀉病毒

豬流行性腹瀉病毒隸屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種對(duì)新生仔豬具有破壞性的腸道病毒，其基因組長(zhǎng)度約為28 kb，包括一個(gè)5'端非編碼區(qū)、3'端編碼區(qū)以及至少7個(gè)開(kāi)放的閱讀框。通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從感染豬流行性腹瀉病毒或模擬感染的新生仔豬中分離血清外泌體，證明了血清外泌體不存在病毒蛋白。而在血清外泌體中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)補(bǔ)體蛋白，并且檢測(cè)到豬流行性腹瀉病毒感染的血清外泌體中C3、C6和CFB補(bǔ)體的表達(dá)水平明顯低于模擬感染的血清外泌體。進(jìn)一步研究證明，模擬感染的新生仔豬外泌體抑制了豬流行性腹瀉病毒感染；然而，這種抑制作用在外泌體被熱滅活后消失，這表明C3、C6和CFB補(bǔ)體是關(guān)鍵的抗病毒分子［56］。

3.2 嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒

SARS-CoV基因組約有30 000個(gè)核苷酸，含編碼病毒的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白［57］。該病毒主要造成人類(lèi)非典型性肺炎，重癥患者可發(fā)生呼吸衰竭、急性呼吸窘迫綜合征、休克和多臟器功能衰竭等癥狀。雖然2003年SARS疫情已經(jīng)被控制，但是仍然需要開(kāi)發(fā)疫苗以應(yīng)對(duì)將來(lái)再次流行的可能性。由于S蛋白與DC-SIGN家族成員和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合［58-59］，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞，所以將該蛋白質(zhì)作為研制抗SARSCoV疫苗的靶點(diǎn)。研究人員探索了含有SARS冠狀病毒S蛋白的外泌體疫苗，SARS S蛋白的胞漿和跨膜結(jié)構(gòu)域被水泡性口炎病毒的G蛋白結(jié)構(gòu)域所取代，獲得了含S蛋白的外泌體。相對(duì)于野生型S蛋白，嵌合S蛋白在細(xì)胞表面水平表達(dá)更高，并可增強(qiáng)外泌體的釋放。在小鼠體內(nèi)檢測(cè)該疫苗的免疫原性和效力，并與表達(dá)S蛋白的腺病毒載體疫苗進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)含S蛋白的外泌體和腺病毒載體疫苗都能誘導(dǎo)中和抗體。用SARS-S蛋白外泌體疫苗啟動(dòng)和腺病毒載體增強(qiáng)后，中和抗體滴度超過(guò)了SARS患者恢復(fù)期血清中的水平［60］。相對(duì)于滅活病毒疫苗和其他種類(lèi)的疫苗，外泌體疫苗不僅包含病毒蛋白，也包含多種細(xì)胞蛋白，其中一些蛋白質(zhì)已經(jīng)被證明有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，但這些額外的刺激信號(hào)是否有利于誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生還有待于研究。

3.3 新型冠狀病毒

SARS-CoV-2在世界大規(guī)模流行，給各國(guó)人民的健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。該病毒造成急性呼吸窘迫、胃腸道窘迫、神經(jīng)功能損害、嗅覺(jué)和味覺(jué)喪失、血液凝固失調(diào)、肝損傷，急性心臟和腎臟損傷等癥狀。雖然病毒和宿主基因變異是影響疾病嚴(yán)重程度和免疫反應(yīng)結(jié)果的可能因素，但SARSCoV-2易感性和疾病表現(xiàn)變化的潛在機(jī)制目前尚不清楚。

病毒能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞脂質(zhì)體發(fā)生變化，并挾持關(guān)鍵的能量途徑，從而為病毒感染的不同階段提供能量。研究人員利用質(zhì)譜分析了輕度、中度和重度COVID-19患者和健康對(duì)照者的血漿脂質(zhì)體和代謝組，發(fā)現(xiàn)COVID-19的血漿脂質(zhì)體與富含單唾液酸二己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（monosialodihexosyl gangliosides，GM3）的外泌體相似，即鞘磷脂（SMs）和GM3s水平增加，二酰甘油（DAGs）減少。GM3s與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)；隨著病情加重，COVID-19患者外泌體中的GM3越來(lái)越豐富，二者呈正相關(guān)關(guān)系。因此，富含GM3的外泌體可能參與了與COVID-19發(fā)病機(jī)制相關(guān)的病理過(guò)程［61］。

大腦是機(jī)體的“司令官”，但是大腦如何抵抗病毒感染目前尚不完全清楚。下丘腦在先天免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞（hypothalamic neural stem/progenitor cells，htNSC）大量分泌外泌體進(jìn)入腦脊液，而有些外泌體中的microRNA則被釋放［62］。利用慢病毒為載體構(gòu)建SARS-CoV-2假病毒，研究者發(fā)現(xiàn)從小鼠下丘腦神經(jīng)干/祖細(xì)胞以及海馬NSC中分離出的外泌體/微泡（exosomes/microvesicles，Ex/Mv）對(duì)不同組織細(xì)胞具有天然抗病毒效應(yīng)，在無(wú)細(xì)胞環(huán)境中也可以攻擊和降解病毒。令人驚奇的是，SARS-CoV-2假病毒侵染表達(dá)ACE2的NSC細(xì)胞系誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ex/Mv在減少病毒感染方面比基礎(chǔ)Ex/Mv更強(qiáng)，這表明它參與了一種類(lèi)似抗病毒的適應(yīng)性免疫功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NSC Ex/Mv具有大量piRNAs（P element-induced wimpy testis（PIWI）-interacting RNAs），其中一些piRNAs在病毒侵染時(shí)表達(dá)水平上升，可能參與了Ex/Mv的抗病毒作用［63］。綜上所述，NSC Ex/Mv具有抗病毒免疫功能，有望發(fā)展成為對(duì)抗多種病毒的藥物。值得注意的是，NSC可能不是產(chǎn)生抗病毒囊泡的唯一細(xì)胞類(lèi)型，探索和發(fā)現(xiàn)具有此功能的其他類(lèi)型的細(xì)胞，對(duì)于抗病毒將非常有價(jià)值。研究者發(fā)現(xiàn)，唾液細(xì)胞外囊泡（包括外泌體）可以抑制ZIKV傳播，但是不能抑制SARS-CoV-2傳播［37］。

大多數(shù)SARS-CoV-2候選疫苗選擇S蛋白進(jìn)行免疫。研究者開(kāi)發(fā)了一種新的SARS-CoV-2疫苗策略，使用外泌體傳遞多種SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA［64］。研究人員首先對(duì)293F細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體進(jìn)行了純化，并裝載了設(shè)計(jì)用來(lái)表達(dá)人工融合蛋白LSNME，它包含S蛋白的受體結(jié)合域、以及N、M和E蛋白的mRNA。將疫苗LSNME/SW1注射到13周齡雄性C57BL/6J小鼠體內(nèi)，免疫小鼠產(chǎn)生了CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)SARS-CoV-2的N蛋白和S蛋白均顯示出劑量依賴(lài)的抗體反應(yīng)，并且達(dá)到了預(yù)期的持久反應(yīng)［64］。這種新型外泌體疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，不僅含有病毒蛋白，還具有已經(jīng)證明可以促進(jìn)免疫應(yīng)答的細(xì)胞蛋白，有利于誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，對(duì)于SARS-CoV-2疫苗的研究具有重要意義。

冠狀病毒感染產(chǎn)生的外泌體同樣可含有病毒蛋白，以及外泌體內(nèi)宿主細(xì)胞蛋白或RNA可能參與了宿主抵抗病毒的免疫過(guò)程（表2）。雖然還不知道以外泌體為靶點(diǎn)或載體的治療方法以及外泌體疫苗對(duì)人類(lèi)的效果，這些研究為目前正在全世界大流行的SARS-CoV-2的預(yù)防和抗病毒治療提供了一種可能性，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

Table 2 Interplay between exosome and Coronaviridae表2外泌體與冠狀病毒科病毒的相互作用

4 總結(jié)與展望

本綜述探討了外泌體在黃病毒科病毒傳播和宿主免疫應(yīng)答過(guò)程中的作用。一方面，黃病毒科病毒相關(guān)的外泌體促進(jìn)病毒感染。黃病毒科病毒可以利用外泌體越過(guò)內(nèi)皮屏障或逃脫免疫監(jiān)視，增強(qiáng)病毒的傳播能力，還能在個(gè)體的不同細(xì)胞內(nèi)或跨不同屬傳播，增加可被感染的細(xì)胞類(lèi)型。另一方面，外泌體可作為免疫系統(tǒng)的誘餌。含有病毒成分和宿主細(xì)胞物質(zhì)的外泌體能夠激活免疫反應(yīng)，以抑制病毒的傳播。

本綜述還探討了外泌體與冠狀病毒的關(guān)系。外泌體可能有助于冠狀病毒的傳播：一方面，病毒受體蛋白如ACE2等可能會(huì)被分選進(jìn)入外泌體，使受體細(xì)胞容易受到病毒感染；另一方面，病毒可能被引導(dǎo)進(jìn)入外泌體途徑，其成分被包裝到外泌體中進(jìn)行分泌，利用外泌體逃逸免疫監(jiān)視從而促進(jìn)傳播。外泌體具有抗SARS-CoV-2功能：外泌體不僅可以誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)抗病毒，還可以包裹病毒蛋白作為疫苗誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生?；谕饷隗w可以建立多種SARS-CoV-2感染治療策略，如抑制外泌體生物發(fā)生和攝取、外泌體治療、基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)和基于外泌體的疫苗。

總之，對(duì)外泌體的研究已經(jīng)成為研究病毒感染的新視角。外泌體作為物質(zhì)交換和信息交流的媒介，在病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用中起著重要的作用。了解與RNA病毒感染相關(guān)外泌體的分子機(jī)制，豐富對(duì)于病毒進(jìn)入、復(fù)制、傳播和感染的認(rèn)識(shí)，還將有助于開(kāi)發(fā)更好的策略來(lái)預(yù)防和診治黃病毒科病毒和冠狀病毒引起的疾病。