E3泛素連接酶接頭蛋白Keap1的研究進展*

倪曉琦 陳錫威 金曉鋒*

（1）寧波大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，寧波 315211；2）寧波大學醫(yī)學院，浙江省病理生理學技術研究重點實驗室，寧波 315211）

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)

蛋白質是人體細胞、組織的重要成分，也是機體重要的功能分子。正常生理條件下，蛋白質需要通過及時地表達并被準確地修飾來維持正常功能，而后在細胞內被降解，以維持機體穩(wěn)態(tài)。蛋白質降解過程不僅與細胞周期、信號傳導、DNA轉錄和翻譯等生理過程有關，還能下調對機體有危害的調節(jié)因子，降解多余、功能失調和受損的細胞成分，循環(huán)利用資源和能量，具有十分重要的生理意義。人體細胞中存在多種蛋白質降解途徑，研究最多的是溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體（ubiquitinproteasome system，UPS）途徑，其中溶酶體途徑主要降解細胞內吞的胞外蛋白質，UPS則主要降解胞內泛素標記的蛋白質。

UPS由泛素修飾蛋白質底物的特定酶和水解標記底物的26S蛋白酶體組成。泛素與底物的結合是通過由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素綴合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素-蛋白質連接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）組成的多步級聯(lián)反應來實現(xiàn)的。簡言之，E1利用ATP水解產生的能量，在泛素C端和E1酶活性催化位點的Cys殘基之間生成硫酯鍵，這種激活的泛素然后被轉移到E2，在E2和泛素之間形成硫酯鍵，最后，帶電荷的E2與數(shù)百個E3合作將激活后的泛素轉移到目標底物，最后使目標底物被泛素化修飾［1］。其中，E3包含兩個不同的功能：催化異肽鍵的形成和招募底物。兩個主要的E3連接酶家族已被描述：HECT結構域家族（因其與E6相關蛋白羧基末端的同源性而命名）和RING家族（其包含了泛素連接酶活性所必需的內在環(huán)指結構域或相關環(huán)指蛋白亞單位）［2］。

而Cullins家族是迄今為止最大的E3連接酶復合體家族，它是一個進化上保守的蛋白質家族，在芽殖酵母和分裂酵母中包含3個相關基因，在蠕蟲、果蠅和人類中包含6個相關基因。Cullins蛋白作為分子支架，可通過一個保守的C端結構域與環(huán)指蛋白Rbx1結合，而Rbx1蛋白則可招募一種帶泛素的E2蛋白，即獲得了E2的催化功能；而后通過一個獨特的N端結構域，單個Cullins通過銜接蛋白與E3泛素連接酶結合以招募特定的底物。Cullin3（Cul3）作為Cullins家族的成員之一，可與具有BTB結構域broad complex-tramtrack-bric-abrac的蛋白質直接結合，形成大量的BTB-Cul3-Rbx1泛 素 連 接 酶［3］。Kelch樣ECH關 聯(lián) 蛋 白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1），作為Cul3-Rbx1 E3泛素連接酶復合物的底物銜接蛋白，目前已有許多研究證明了其突變與癌癥發(fā)生之間的關聯(lián)。本文將從Keap1蛋白的結構與功能、Keap1基因的突變情況、Keap1導致疾病發(fā)生發(fā)展的具體分子機制等方面作一綜述。

2 Keap1蛋白的結構與功能

Keap1是一個分子質量為70 ku的蛋白質，包括624個氨基酸，位于19號染色體p13.2位，主要存在于細胞質中，正常情況下錨定于胞漿的肌動蛋白細胞骨架上。它是一種BTB-Kelch蛋白，是Cul3依賴的泛素連接酶復合物的底物銜接蛋白。Keap1主要結構域包括NTR結構域（N-terminal region，1～60位氨基酸殘基）、與Cul3相互作用的BTB結構 域（61～179位 氨 基 酸 殘 基）、IVR結 構 域（intervening region，180～314位氨基酸殘基）、含有6個Kelch重復結構域的DGR結構域（double glycine repeat，315～359、361～410、412～457、459～504、506～551、553～598位氨基酸殘基）和CTR結構域（C-terminal region，599～624位氨基酸殘基）［4］（圖1a）。

BTB結構域是一段進化上保守的基序，功能多樣，包括介導Keap1同源二聚和與Cul3連接酶復合物結合的作用。且BTB結構域中的一個半胱氨酸殘基C151被發(fā)現(xiàn)是Keap1在親電刺激下降低E3活性所必需的［5］。

IVR結構域富含一些半胱氨酸殘基，可用來調節(jié)Keap1活性。此結構域上的C273和C288對于Keap1維持泛素E3連接酶活性和降解Nrf2是必不可少的。此外，IVR結構域將BTB結構域與C端Kelch/DGR結構域連接起來。同時，Keap1通過IVR結構域與Cul3的N端區(qū)域結合。

Keap1的Kelch/DGR域是一個六葉片β螺旋槳結構，其中I-VI螺旋槳的每個葉片由4個β-股（A～D）組成。β螺旋槳的中心核投射出不同長度的環(huán)，組成這些β股。根據(jù)慣例，連接β股A和B（A-B）或β股C和D（C-D）的短環(huán)定義了β螺旋槳的底部，而連接β股D和A（D-A）或β股B和C（B-C）的較長環(huán)定義了β螺旋槳的頂部［6］，該結構域具有識別與結合底物蛋白的功能。

3 Keap1的泛素化底物

Keap1通過泛素作用于其下游底物，例如核轉錄因子紅系2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）被Keap1泛素化并靶向蛋白酶體降解；IκB激酶亞單位β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta，IKKβ）也可以被Keap1泛素化并由26S蛋白酶體降解。此外，選擇性自噬接頭蛋白p62（sequestosome1，SQSTM1/p62）、性 別 決 定 區(qū) 域Y框9（sex determining region Y-box 9，SOX9）、凋亡調節(jié)劑（apoptosis regulator）Bcl-2、絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋 白 磷 酸 酶（serine/threonine-protein phosphatase）PGAM5、線粒體Rho GTPase 2（mitochondrial Rho GTPase 2，Miro2）、STE20樣 絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋 白 激 酶（STE20-like serine/threonine-protein kinase，SLK）和有絲分裂紡錘體裝配檢查點蛋白MAD2A（mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2A，MAD2L1），以及可能的非常規(guī)肌球蛋白Ixb（unconventional myosin-IXb，Myo9b）同樣也被Keap1泛素化修飾并降解。值得注意的是，另外存在一些能被Keap1泛素化但不被降解的底物，如DNA復制許可因子（DNA replication licensing factor）MCM3、BRCA2定位協(xié)作因子（partner and localizer of BRCA2，PALB2）、內質網(wǎng)膜傳感器NFE2L1（nuclear factor-erythroid 2-related factor 1，Nrf1）等。總之，Keap1作為E3泛素連接酶的接頭蛋白，對比Cul3家族的另一種E3接頭蛋白SPOP而言，其下游泛素化底物仍有很大的研究空間。截至目前被文獻報道的所有Keap1泛素化底物見表1。

Fig.1 Structure，function of Keap1 and Keap1-mediated mechanism pathways圖1 Keap1結構、功能及相關分子機制

Table 1 Ubiquitylation substrates of Keap1表1 Keap1的泛素化底物

4 Keap1的降解型底物

Keap1作為Cul3-Rbx1 E3泛素連接酶復合物的一部分，介導了包括Nrf2、Ikkβ、p62、SOX9、Bcl-2、PGAM5、Miro2、SLK、MAD2L1和Myo9b的降解。Keap1同這些底物一起組成了一個十分復雜的細胞生物學網(wǎng)絡，參與了眾多細胞過程。尤其在癌癥中，Keap1既是抑癌蛋白也是促癌蛋白，因此，了解Keap1和這些底物所參與的信號級聯(lián)反應非常重要。下文側重于通過負調節(jié)4種底物Nrf2、Ikkβ、p62和SOX9來闡述Keap1在癌癥或疾病中的作用，并提及了這4種底物互相之間的橫向聯(lián)系，提示了Keap1網(wǎng)絡的復雜性。

4.1 Keap1與Nrf2

Keap1最初發(fā)現(xiàn)的底物就是Nrf2，也是人們研究最多的底物。Keap1-Nrf2系統(tǒng)是細胞防御和生存相互影響的重要節(jié)點，Keap1充當氧化還原損傷的富含半胱氨酸硫醇的傳感器，而Nrf2是一個轉錄因子，作為效應器來協(xié)同激活細胞中包括抗氧化酶、排毒酶、炎癥相關蛋白、藥物轉運蛋白和代謝酶等保護基因，在氧化應激和代謝過程中發(fā)揮重要作用［23］。相反，Keap1-Nrf2的失調導致Nrf2異常激活也會引起病理變化，尤其在癌癥中［23-26］。

Nrf2由Nfe2l2基因編碼，屬于堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉 錄 因 子 和cap-ncollar（CNC）家族。Nrf2的分子質量約為68 ku，由人體內的589個氨基酸組成，可以分為7個保守的功能結構域：Neh1～7。Neh1結構域包含介導與DNA結合和形成二聚體的CNC和bZIP結構域；Neh2結構域包含分別與Keap1具有高親和力和低親和力的ETGE和DLG基序，該結構域介導Nrf2的降解并抑制Nrf2的轉錄活性［15］；Neh3結構域位于Nrf2的C端，是必不可少的功能區(qū)域，可以與染色質域解旋酶DNA結合蛋白6（chromodomainhelicase-DNA-binding protein 6，CHD6）結合并激活抗氧化響應元件（antioxidant response element，ARE）［27］；Neh4和Neh5結 構 域 可 以 與 激 活 物cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）結合，以幫助Nrf2轉運入細胞核［28］；具有大量絲氨酸殘基的Neh6結構域抑制Nrf2轉錄，而與Keap1無關［29］；Neh7結構域識別類視黃醇X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRα）［30］。另外，Nrf2的第40個氨基酸是磷酸化位點，該位點的磷酸化導致Nrf2從Keap1上解離［31］。

正常生理條件下，Keap1的BTB結構域與Cul3 E3泛素連接酶復合物結合，兩個Keap1分子通過BTB區(qū)形成同型二聚體，然后Keap1二聚體可以通過DGR結構域，結合Nrf2的ETGE和DLG基序，并以1∶1的比例直接相互作用。Nrf2的Neh6域中DSGIS和DSAPGS氨基酸基序與Keap1結合，然后將泛素連接酶復合物上的泛素轉移到Nrf2的ETGE和DLG基序之間的7個賴氨酸殘基（K40、K50、K52、K53、K56、K64和K68）上。Keap1可能與泛素伴侶去泛素化蛋白（deubiquitinating protein，VCP）VCPIP和兩個蛋白酶體泛素受體26S蛋白酶體非ATPase調節(jié)亞基2（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2，PSMD2）和26S蛋 白 酶 體 非ATPase調 節(jié) 亞基4（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4，PSMD4）的相互作用以誘導泛素化的Nrf2傳遞至蛋白酶體，并被快速降解［32］。在氧化應激條件下，線粒體會產生大量的高活性分子，例如活性氧。當活性氧含量超過細胞清除能力時，氧化還原系統(tǒng)發(fā)生失衡，對脂質、蛋白質和DNA造成氧化損傷，并最終導致細胞凋亡，組織或器官損傷。因此，Nrf2途徑被顯著激活，其具體機制如下：a.Keap1的IVR區(qū)中C273和C288巰基被氧化形成二硫鍵，導致空間構象變化。然后，具有強結合能力的高親和力ETGE基序仍然能夠緊密結合Keap1，而弱的、低親和力的DLG基序則與Keap1分離。隨著Nrf2的空間定位變化，它不能被泛素蛋白酶體降解［33］。b.Keap1的BTB結構域中的C151被修飾并產生位阻效應，導致Keap1和Cul3解離［34］。這破壞了Keap1-Cul3 E3泛素連接酶復合物的活性，并抑制了泛素介導的Nrf2降解。當Keap1-Keap1-Nrf2的量達到飽和時，Keap1同型二聚體無法在細胞中再生，并且新生成的Nrf2由于其自身的保護而不再與Keap1結合。Nrf2遷移到細胞核并與小Maf蛋白（small Maf protein，sMaf）結合。然后，Nrf2-sMaf與ARE結合并增加抗氧化劑蛋白和II期解毒酶的轉錄激活。而細胞核中過多不必要的Nrf2則被糖原合酶激酶3b（glycogen synthase kinase 3b，GSK-3β）磷酸化，從而使其能夠被包含β轉導素重復序列包含蛋白（β-transducin repeatcontaining protein，β-TrCP）識 別，被β-TrCPCUL1 E3泛素連接酶復合物泛素化并通過蛋白酶體降解。但這種基于β-TrCP的Nrf2降解方式獨立于Keap1，且被認為是次要的［29］。細胞核中的Nrf2也能通過Keap1的短暫穿梭入核被泛素化而被抑制［35］。當氧化還原平衡恢復后，Nrf2從細胞核轉移到細胞質，在細胞質中被泛素化降解［36］（圖1b）。

Keap1-Nrf2系統(tǒng)吸引了基礎和臨床癌癥研究領域科學家的廣泛興趣，除了在細胞生理學和應激反應中起關鍵作用外，其在癌細胞中也得到廣泛利用，并且在賦予癌細胞生長優(yōu)勢、支持癌癥代謝和促進惡性轉化方面起著關鍵作用。這與已知的Nrf2保護作用相反，暗示了Keap1-Nrf2系統(tǒng)在癌癥中的雙重作用。為了研究Keap1在腫瘤發(fā)展中的直接作用，Wakabayashi等［37］創(chuàng)建了Keap1基因敲除小鼠。這種遺傳結構具有致死性，并且在出生后3周內無法生存。然而，在死亡之前，這些小鼠表現(xiàn)出高水平的Nrf2信號傳導，并顯示肝臟內排毒酶的上調。有報道說，Keap1可以作為腫瘤轉移的抑制劑，它靶向非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）細 胞 中 的Nrf2-S100P途徑［38］。最近有報道說，Keap1缺失會過度激活Nrf2，并 在 小 鼠 中 促 進KRAs（kainate-type glutamate receptors）驅動的肺腺癌并導致對谷氨酰胺分解的依賴性［39］。Keap1缺失還能協(xié)同PI3K途徑共同驅動免疫微環(huán)境改變的NSCLC［40］。此外，在人類各種癌癥中發(fā)現(xiàn)了Keap1的體細胞突變。發(fā)現(xiàn)Keap1的N端和BTB結構域上的某些突變可破壞Keap1-Cul3-Rbx1泛素復合物的形成，而Kelch結構域上的其他突變則可減少Keap1與Nrf2的相互作用，從而使其穩(wěn)定［41-43］。在肝癌和膽囊癌中發(fā)現(xiàn)Keap1的體細胞突變，這些突變使Nrf2的表達不受限制，從而導致II期解毒酶和抗氧化劑蛋白的誘導，從而證明對癌細胞具有化學抗藥性［44］。最近一項研究將癌癥中40%的Keap1突變歸為ANCHOR突變體，這些突變體比野生型Keap1和泛素化Nrf2結合更多的Nrf2，但它們不能促進Nrf2降解。在活細胞中，Keap1 R320Q和R470C ANCHOR突變體與Nrf2、p62和多聚泛素共定位在快速融合和溶解的結構化球形液滴中。透射電子顯微鏡結合共聚焦熒光成像顯示無膜相分離的生物分子冷凝物。Cloer等［32］提出了一個模型，其中ANCHOR突變形成并形成p62依賴相分離的球形簇，其包含被未修飾和磷酸化的p62、多聚泛素和Nrf2包圍的Keap1陽性核心。該模型可能代表某種受損的蛋白酶體降解和自噬之間的過渡狀態(tài)。總之，這些事件表明Keap1發(fā)揮抑癌作用，因為它的缺乏會導致腫瘤發(fā)生，Keap1表達或功能的降低則會促進腫瘤的進展。有趣的是，最近研究表明Keap1在癌癥中發(fā)揮雙重作用。在肝特異性Keap1基因敲除小鼠模型中，Keap1缺失引起的Nrf2激活可防止肝纖維化的癌癥的發(fā)生。這提示了Keap1在非酒精性慢性肝癌中的促癌作用［45］。

最近有研究關注于Keap1與Nrf2之間蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）上，提出Keap1不僅能抑制Nrf2，它也受Nrf2抑制。過量Keap1的存在是對細胞內環(huán)境有害的。Nrf2缺乏的細胞中，由于Keap1靶向Miro2的降解，導致線粒體穩(wěn)態(tài)顯著失調［13］。此外，可抑制Keap1的Nrf2蛋白不足會導致Rho GTPase激活蛋白1（Rho GTPase-activating protein 1，RhoGAP1）過量，從而調節(jié)Cdc42（cell division cycle 42）活性。這損害了足小體的組裝并破壞了肌動蛋白的重排，從而阻止了血管生成［46］。但Nrf2能充當?shù)鞍踪|束縛Keap1，允許足小體組裝核血管生成，而不受Nrf2轉錄活性的調控［47］。最近人們還似乎將Keap1-Nrf2系統(tǒng)與衰老聯(lián)系起來［48］。已經有研究表明，Nrf2會在衰老或者早衰模型中增加［49］。Keap1在衰老中的作用仍有待發(fā)現(xiàn)。

4.2 Keap1和IKKβ

IKKβ由IKBKB基因編碼，是一種絲氨/蘇氨酸激酶，分子質量為86 ku。IKKβ主要位于細胞質中，也可以在細胞核中少量存在。IKKβ包含756個氨基酸，由4個結構域組成：N端激酶結構域（kinase domain，KD）、二聚結構域（scaffold/dimerization domain，SDD）、泛 素 樣 結 構 域（ubiquitin-like domain，ULD）、C端NEMO結合結構域（NEMO binding domain，NBD）［50］。

細胞質中的IKKβ在核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）級聯(lián)反應中起著關鍵控制者的作用。多種促炎刺激可以激活IKKβ，然后將IKKβ磷酸化，從而導致核因子κB抑制劑（inhibor of nuclear factor-kappa-B，IκB）泛素化并隨后通過26S蛋白酶體途徑降解。IκB的去除導致NF-κB的核易位并誘導與免疫反應、細胞增殖、血管生成、細胞存活，腫瘤侵襲、轉移和上皮間充質轉化有關的基因轉錄［51］。此外，IKKβ還通過磷酸化介導的抑癌基因抑制作用顯示了其非NF-κB的致瘤性［52］。細胞核中的IKKβ則是紫外線誘導的NF-κB活化中IκB泛素化和降解的銜接蛋白［53］。

有研究發(fā)現(xiàn)，Keap1通過充當IKKβ E3連接酶來下調NF-κB信號通路，進而抑制癌癥［9］。生理情況下，Keap1 DLG結構域與IKKβ KD結構域的ETGE基序結合，并介導IKKβ上的第555位賴氨酸的K48型多聚泛素化及隨后的26S蛋白酶體降解。IKKβ的酪氨酸尤其是Tyr525主導了Keap1對Nrf2的特異性識別［54］。Keap1對IKKβ的失調同樣也在癌癥中出現(xiàn)。Keap1是抑癌的，在肝癌中的S404X和D479G突變體以及肺癌和乳腺癌中的G333C、G364C、R413L和G430C突變體被證明減弱Keap1和IKKβ的結合親和力及之后的泛素化和降解，導致NF-κB通路激活而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有趣的是，C23Y突變體會干擾Keap1-Cul3-Rbx1泛素復合物的形成，但和野生型Keap1介導的IKKβ泛素化之間沒有差異?？傊?，這些事件說明，一些Keap1突變體也作為腫瘤的啟動子。另外，一項對肺癌突變的全面表征研究表明，Cul3-Keap1-Rbx1復合物任一成分的遺傳改變都足以破壞復合物的完整性，導致IKKβ降解的失調及隨后NF-κB的異常激活，進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展［55］（圖1c）。

IKKβ和Nrf2是Keap1的主要底物?？紤]到Keap1-Nrf2-ARE和IKKβ-NF-κB通路在炎癥和癌癥的病理過程中起相反的作用，因此NF-κB信號傳導和Nrf2-ARE通路的干擾對于維持平衡至關重要。目前已經報道了關于NF-κB信號傳導和Nrf2-ARE途徑之間串擾的一些初步發(fā)現(xiàn)。NF-κB信號傳導可以通過p65（NF-κB的亞單位）和Keap1的相互作用來抑制Nrf2-ARE途徑［56］。在另一項研究中，p65通過從Nrf2剝奪CBP和促進組蛋白脫乙酰基酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）募集到ARE參與了抗氧化基因表達的下調［57］。最近一項對Keap1-IKKβ之間PPI的研究表明，Keap1是Keap1-Nrf2-ARE和IKKβ-NF-κB之間串擾的新節(jié)點，該發(fā)現(xiàn)也為細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的調節(jié)機制提供了有價值的見解［54］。

4.3 Keap1與p62

p62，也稱為SQSTM1，是一種泛素結合自噬受體，分子質量為62 ku。p62主要位于細胞質中并且可以在細胞質和細胞核之間穿梭，在自噬體以及溶酶體中也存在。p62具有多個結構域，包括N端Phox1和Bem1p結構域（Phox1 and Bem1p，PB1），其介導p62的異二聚或均聚而作為蛋白質結合模塊；LC3相互作用域（LC3-interacting region，LIR），介導與ATG8家族蛋白的相互作用；泛素相關結構域（ubiquitin-associated，UBA），能與多聚泛素化底物的K63型多泛素鏈特異性結合；Keap1相互作用區(qū)（Keap1-interacting region，KIR），介導了與Keap1的結合；ZZ型鋅指（ZZ-type zinc finger，ZZ），介導了與受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase1，RIPK1）的相互作用。此外，p62還具有腫瘤壞死因子受體相關因子6結合基序（tumor necrosis receptor-associated factor 6（TRAF6）-binding，TB）。p62被認為是一個多功能信號樞紐，它參與了營養(yǎng)敏感中雷帕霉素復合物1（rapamycin complex1，mTORC1）機械性靶點的激活［58］、炎癥和凋亡過程中NF-κB的激活［59］，抗氧化反應中Keap1-Nrf2通路的激活［18］，以及在選擇性自噬中提到的受體作用［60］。最近研究發(fā)現(xiàn)，p62在引起液-液相分離中也有重要作用［61-63］。

有研究發(fā)現(xiàn)，Keap1充當p62的E3泛素連接酶，將p62靶向泛素化和自噬降解，而保護疾病中細胞的死亡［17］。Keap1同源二聚體與p62二聚體上的兩個高親和力KIR基序結合，導致其UBA結構域上的K420殘基被泛素化修飾，進而p62所具有的與泛素化蛋白質聚集體螯合成p62包涵體的能力得到進一步增強。隨后包涵體與自噬體膜上LC3（自噬相關蛋白8的同源蛋白）結合的能力也被加強，使p62和被泛素化的蛋白質一起通過溶酶體途徑被降解（圖1d）。在退行性疾病包括骨佩吉特病、肌萎縮側索硬化、額顳葉癡呆，以及包涵體肌病中［64-65］，存在p62-UBA結構域內的主要遺傳性錯譯或者缺失突變，但是p62突變如何參與疾病的發(fā)病機制目前尚不清楚，可能與泛素結合活性降低有關。而研究發(fā)現(xiàn)，這些不同組織的共同致病機理是p62聚集體和泛素化內含物積累導致的。p62 S349的磷酸化可以被UBA結構域中的點突變破壞，該突變會減弱其泛素結合功能［66］。然后，p62上的S349的磷酸化增加了p62對Keap1的親和力［67］。也可以想象p62中的UBA結構域相關疾病突變影響S349磷酸化，從而廢除了Keap1-Cul3介導的UBA結構域泛素化。最近研究發(fā)現(xiàn)，在Keap1相互作用區(qū)域內也存在著與骨佩吉特病和肌萎縮側索硬化相關的p62錯義突變［68-69］，這些突變導致p62與Keap1相互作用的喪失和Nrf2信號的減弱，這些突變還可能影響p62的UBA域的泛素化修飾。

P62與Keap1-Nrf2通路之間存在串擾，p62可以激活Nrf2，并轉運至細胞核并激活抗氧化基因，來響應氧化應激。P62的調控作用可以通過3條途徑：a.磷酸化的p62 KIR域可能識別Keap1的DGR域，形成p62-Keap1復合物，該復合物可通過UPS途徑清除［70］；b.p62通過組裝p62-Keap1復合物和LC3形成LC3-p62-Keap1復合物來控制Keap1轉化，通過選擇性自噬消除p62［71］；c.Nrf2啟動靶基因p62的表達［72］。最近Tan等［62］在二乙基亞硝胺誘導的肝癌發(fā)生模型中，發(fā)現(xiàn)凋亡調節(jié)因子1（modulator of apoptosis 1，MOAP-1）缺陷小鼠表現(xiàn)出較高的腫瘤負擔且伴隨著p62自噬小體和Nrf2信號傳導的水平過高［62］。他們提出MOAP-1介導p62自噬小體的解離釋放Keap1并抑制Nrf2信號轉導。在誘導刺激p62自噬小體形成的細胞應激之后，MOAP-1被募集到p62自噬小體中，并降低了其水平，而與自噬途徑無關。MOAP-1與p62的PB1-ZZ域相互作用，并干擾其自身低聚和液-液相分離，從而拆卸了p62分子。最近也有研究表明，p62激活的Nrf2途徑是神經退行性疾病的重要標志。p62-Keap1-Nrf2陽性反饋回路和Nrf2通路參與消除阿爾茨海默病誘導的活性氧（ROS）和蛋白質聚集［31］。神經退行性疾病中也很容易觀察到p62自噬小體，神經元中的p62自噬小體如何調控及維持p62-Keap1-Nrf2正反饋環(huán)路的體內平衡可能是治療神經退行性疾病的潛在目標。

4.4 Keap1和SOX9

SOX9是結構相關的性別決定區(qū)Y盒轉錄因子家族的一個成員，在發(fā)育過程中對實現(xiàn)不同的功能至關重要。SOX9由3個結構域組成：DIM結構域、HMG結構域、反式結構域。DIM結構域位與N端，介導自身的二聚化；HMG結構域在DIM之后，由兩個核定位信號和夾在中間的一個核出口信號組成，介導與DNA的結合和核定位；反式結構域包括保守域2（conserved domain-2，K2），脯氨酸、谷氨酰胺和富含丙氨酸的域（proline，glutamine，and alanine rich domain，PQA）以及一個反式激活域（transactivation domain，TA）［73］。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，Keap1是SOX9的E3連接酶，靶向泛素化和蛋白酶體降解，抑制癌癥的發(fā)生［22］。正常情況下，Keap1可以結合分別位于SOX9 N端和K2結構域上的DLK基序，后者是Keap1的主要結合位點。當K2域上的DLK基序缺失將阻止Keap1介導的SOX9第249位賴氨酸上的多聚泛素化（泛素是K6、K11、K27和K33的混合連接型）及進一步的蛋白酶體途徑降解。此外，SOX9的磷酸化促進了其與Keap1的相互作用，例如CKI激動劑或DNA損傷藥物可通過促進Keap1的磷酸化，進而促進其對SOX9降解來抑制SOX9介導的腫瘤發(fā)生。然而，肺癌中的R204P、G333S、W497L、G603W和E611D Keap1突變體被證明減弱Keap1和SOX9的結合親和力及之后的泛素化和降解，從而促進肺癌的發(fā)生。有趣的是，Keap1 R470C突變體在免疫共沉淀實驗中表現(xiàn)出增強的SOX9結合，而在促進SOX9多聚泛素化和降解方面表現(xiàn)出與Keap1野生型類似的行為?？傊?，肺癌中Keap1體細胞突變導致SOX9蛋白水平升高，導致了肺癌的預后差以及惡性進展（圖1e）。

SOX9是Nrf2的靶基因，SOX9的穩(wěn)定性也能受到Keap1介導的轉錄水平的調節(jié)。Schmidlin等［74］研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露（誘導p62將Keap1隔離而激活Nrf2）和Keap1功能缺失突變導致的Nrf2激活，上調了SOX9，進而增加了非小細胞肺癌的轉移潛力。最近Nabeshima等［75］發(fā)現(xiàn)Keap1缺失促進了K-ras/p53突變驅動的膽管癌的進展，雖然膽管癌中SOX9高表達，但其高表達的背后是受到轉錄水平還是翻譯后修飾調控的仍不為所知。總之，SOX9與Nrf2之間的串擾，體現(xiàn)了癌癥發(fā)生過程的復雜調節(jié)。然而SOX9不僅是癌基因，在宮頸癌［76］、黑色素瘤［77］和膀胱癌［78］中是抑癌的，在此等人類癌癥中Keap1介導的SOX9失調可能起相反作用。Keap1是抑癌還是促癌取似乎決于癌癥的特異性。

5 Keap1與疾病的關系

5.1 通過Keap1-Nrf2通路影響疾病發(fā)生

5.1.1 腎臟疾病

由于氧化應激是腎臟疾病的主要致病和加重因素，Keap1-Nrf2系統(tǒng)被認為是腎臟保護的治療靶點。據(jù)報道，在大鼠慢性腎?。–KD）模型中，Keap1抑制劑CDDO-9,11-dihydro-trifluoroethyl amide（CDDO-dhTFEA，也稱為dh404）在高劑量的情況下，即Keap1少量存在時，能通過激活NFκB介導的炎癥反應，加重腎臟纖維化，印證了上文Keap1對NF-κB的抑制作用。而低劑量的CDDO-dhTFEA，即Keap1大量存在時，Nrf2被異常激活，但沒有NF-κB響應，則能改善腎臟纖維化。因此激活Nrf2對腎病的治療有重要意義。然而，必須考慮到Keap1抑制劑可能會影響Nrf2以外的Keap1靶點活性。最后，來自正在進行的研究項目數(shù)據(jù)表明，Keap1抑制劑可以改善3期CKD和T2DM（2型糖尿?。┗颊叩哪I小球濾過率，而無安全隱患。因此，Keap1-Nrf2系統(tǒng)是腎臟疾病最有希望的治療靶點之一，雖然Keap1抑制劑在不同腎病中發(fā)揮作用不一，但毋庸置疑它有望是腎臟關鍵療法的一部分，并且在腎病中Keap1存在Nrf2異常激活的機制還有待進一步研究［79］。

Keap1-Nrf2通路在腎毒病中也發(fā)揮重要作用。已知慶大霉素（GM）可有效治療嚴重的甚至危及生命的感染。然而，注射GM后腎功能會受損，氧化/抗氧化失衡，所以GM的腎毒副作用限制了其臨床應用。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，地奧司明（DS）是一種具有廣泛生物活性的黃酮類化合物，具有十分重要的生物學意義。GM顯著降低了腎細胞Nrf2、谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCLC）、血紅素氧化酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶3（SOD-3）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的表達，但上調了Keap1的表達。相反，DS給藥可顯著減輕GM誘導的腎功能障礙，恢復腎臟氧化/抗氧化狀態(tài)。此外，DS和GM聯(lián)合處理顯著增強Nrf2、GCLC、HO-1、SOD3、AKT和p-AKT的表達，同時Keap1下調。組織病理學檢查也顯示，DS顯著減少GM誘導的組織損傷。不言而喻，通過抑制Keap1，激活Nrf2系統(tǒng)能起到保護腎臟的作用。綜上所知，DS能通過靶向Keap1-Nrf2-ARE、AKT和PPAR信號通路，有望成為GM腎毒性的保護劑［80］。

5.1.2 肝臟疾病

研究表明，氧化應激在肝臟疾病的病理機制中起著重要作用，故氧化應激關鍵轉錄因子Nrf2的正常表達與否十分關鍵。在體外培養(yǎng)的肝細胞中，HBV病毒一方面能夠誘導細胞發(fā)生氧化應激反應，另一方面能夠通過激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2下游的抗氧化基因大量表達，從而發(fā)揮抗氧化應激的細胞保護作用。在非酒精性脂肪性肝炎的小鼠動物模型中，姜黃素治療能使小鼠肝臟損傷的程度明顯緩解，其機制可能就是姜黃素通過激活Nrf2而使其下游抗氧化酶表達量升高，繼而抑制氧化應激。同理，在小鼠肝纖維化動物模型中，甘草次酸通過上調Nrf2的表達，繼而使Nrf2下游的抗氧化酶基因表達增加，發(fā)揮保護作用，而在Nrf2缺乏小鼠中肝臟的纖維化及炎性反應程度卻進一步加重，說明Nrf2在改善肝臟纖維化方面起一定作用。在肝臟缺血再灌注損傷的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，相比野生型小鼠，Nrf2缺乏小鼠在15 d-PGJ2（15-脫氧-12,14-前列腺素J2）治療后，肝損傷的程度雖不能得到緩解，但該藥物可以通過激活Nrf2-ARE通路而有效降低肝臟缺血再灌注損傷的程度。以上研究表明，氧化應激廣泛存在于多種肝臟疾病中，且通過Nrf2再激活抗氧化系統(tǒng)能夠對肝細胞起到保護作用［81］。

5.1.3 炎癥

炎癥可以定義為對有害的內源性和外源性刺激的保護性免疫反應。然而，長期或自身免疫性炎癥反應會導致機體各種有害狀態(tài)。炎癥相關分子被鑒定為Nrf2的內源性誘導因子。例如，15 d-PGJ2是COX-2（環(huán)氧合酶2）途徑的最終產物之一，主要由巨噬細胞產生，并具有強大的抗炎作用。15d-PGJ2通過與Keap1相互作用，強烈激活Nrf2并抑制炎癥性轉錄因子如NF-κB。然后，一方面，Nrf2通過ROS介導抑制炎癥。ROS在炎癥性疾病的進展中起重要作用，但過量的ROS會對脂質、蛋白質和DNA造成損傷，導致細胞和組織損傷。受損的細胞釋放DAMP（損傷相關分子模式），如熱休克蛋白和高遷移率族蛋白B1，它們激活參與先天免疫反應的巨噬細胞，活化的巨噬細胞再釋放出各種炎癥介質和細胞因子，誘導一系列炎癥反應，因此，Nrf2的抗氧化功能有助于消除過多的ROS和隨后的炎癥反應。另一方面，Nrf2除了通過消除ROS發(fā)揮抗炎作用，還可通過ROS非依賴機制抑制炎癥。Nrf2以ROS介導的方式直接抑制巨噬細胞中IL-6、IL-1b這些促炎細胞因子基因的轉錄，Nrf2結合到這些促炎細胞因子基因的調節(jié)域內，并抑制RNA聚合酶II向這些位點的募集。且重要的是，促炎性細胞因子基因的抑制發(fā)生在早期階段，這表明Nrf2能迅速解決炎癥。綜上表明，Keap1抑制Nrf2激活能抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。在處理炎癥時，幾類化合物可主動破壞Keap1-Nrf2相互作用并激活Nrf2，如三萜類化合物是齊墩果酸的衍生物，這些小分子通過與Keap1的C151共價結合來阻止Nrf2降解，類似于異硫氰酸鹽，天然三萜類化合物由于具有抗炎作用而被用于中醫(yī)，并且以多種形式存在，如油酸和熊烷［82］。

5.1.4 少肌癥

骨骼肌健康對于預防各種與年齡有關的疾病很重要。骨骼肌質量的喪失，即肌肉減少癥，是老年人身體殘疾、生活質量差和慢性疾病的基礎，而Keap1-Nrf2系統(tǒng)在此疾病中有關鍵作用。已經有研究證明，Keap1抑制在骨骼肌中對耐力的有益作用，考慮到Keap1和Nrf2之間的關系非常嚴格，我們認為Keap1抑制的有益作用主要歸因于Nrf2的激活。為了確定骨骼肌Nrf2對運動能力的貢獻，在骨骼肌中對Nrf2的負調節(jié)劑Keap1進行特異性抑制，并檢查Nrf2途徑激活的細胞自主和非細胞自主效應。

Keap1被破壞引起骨骼肌特異性Nrf2活化，能增強脂肪酸（FAs）的動員和氧化、增加骨骼肌質量和運動能力。Keap1抑制能增強FAs的β氧化作用，增加線粒體活性而不是數(shù)量來發(fā)揮細胞自主效應。為了確定Nrf2的遺傳激活是否能重現(xiàn)這種效果，發(fā)現(xiàn)在Keap1敲降（Keap1-KD）小鼠骨骼肌中Keap1蛋白和mRNA的表達降低。而Nqo1是Nrf2的典型靶基因之一，被確定在Keap1-KD骨骼肌中被上調，這表明Nrf2途徑在Keap1-KD骨骼肌中被激活；而Nrf2缺乏的小鼠確實表現(xiàn)出運動耐力受損。綜上可知，由于全身性Keap1抑制而引起的Nrf2途徑活化增加了運動能力。

還有，眾所周知，運動過程中的肌肉收縮會產生ROS。盡管尚不清楚控制ROS產生的確切機制，但線粒體被認為是ROS的主要來源，尤其是通過電子傳遞鏈復合物I和III。雖然長時間或高強度運動會產生過量的ROS，導致骨骼肌氧化損傷，但最近的研究表明，運動誘導的ROS在生理上起著重要作用，并是骨骼肌適應的重要介體。肌肉收縮和運動增加Nrf2蛋白水平和活性，而Nrf2的激活能抑制運動誘導的轉錄反應，因此我們認為Nrf2的最佳激活平衡了維持生理信號所需的有益ROS水平和限制了有害ROS水平，保護組織免受氧化損傷。這些結果表明了Nrf2可以進行多峰代謝調節(jié)，從而增加運動耐力。我們建議適當?shù)腘rf2激活可用于抗衰弱干預。

總之，骨骼肌中的Nrf2激活增加了慢速氧化性肌纖維類型并改善了運動耐力，而負責耐力運動的慢速氧化肌纖維功能對于預防老年人的肌肉減少癥和體弱尤為關鍵；并且那些具有Nrf2途徑激活的骨骼肌表現(xiàn)出運動耐力的增強和脂肪酸β氧化過程的增加。其機制就是骨骼肌中的Nrf2激活通過體液和/或神經元信號傳導促進與脂肪組織的通訊，并促進脂肪酸作為能源的利用，從而導致線粒體活性增加和運動過程中有效的能量產生，從而改善運動耐力。正如有些報道表明，Nrf2的全身激活可增強運動能力，并最終有助于預防與年齡相關的肌肉減少癥和虛弱，但骨骼肌Nrf2的激活可減少骨骼肌質量，表明Nrf2在參與骨骼肌生理學中的復雜性，即Nrf2在每個組織和器官中對全身運動能力的貢獻不同，這可作為未來解決此類疾病的一個重要方向［83］。

5.1.5 眼科疾病

正如上述所說，研究已證實Nrf2對肝臟、腎臟和心臟細胞具有保護作用，同時已用于癌癥的臨床治療。而現(xiàn)在越來越多的實驗研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化應激藥物對多種眼球細胞具有良好的保護作用，印證了氧化應激與多種眼科疾病的病理過程相關。Nrf2是細胞抗氧化反應的中樞調節(jié)者，在細胞的防御保護中發(fā)揮了重要作用。以下討論，Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)，公認的抗氧化應激的重要通路，也是目前眼科研究的熱點之一。

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD），主要在55歲以上人群發(fā)病，是引起失明的最常見原因，它的發(fā)病是由多種因素長期作用的結果，其中氧化應激對視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細胞的損害作用是導致AMD發(fā)生發(fā)展的主要病理機制。RPE細胞的損傷歸因于細胞內抗氧化防御系統(tǒng)的衰弱或ROS水平的增加。動物實驗表明，Nrf2基因敲除小鼠表現(xiàn)出與人類AMD相似的病理改變，如氧化損傷、過度自噬和炎癥反應等，說明Nrf2信號通路的缺失將增加視網(wǎng)膜年齡相關性疾病的易感性；而當敲除Nrf2的負性調控因子Keap1時，卻能部分恢復大齡鼠RPE細胞Nrf2信號通路活性，說明細胞中Keap1抑制導致的轉錄因子Nrf2及其下游信號分子的激活可有效提高RPE細胞抗氧化損傷能力。綜上所述，Nrf2介導的信號通路能保護年齡相關性的視網(wǎng)膜損傷如AMD，并有可能作為治療AMD的靶點，同時，RPE細胞中Nrf2的表達對AMD進展有無影響也值得進一步研究。

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的嚴重并發(fā)證之一，不僅是糖尿病性微血管病變中最重要的表現(xiàn)，也是一種具有特異性改變的眼底病變。它是導致發(fā)達國家成人致盲的常見原因，但其導致視力障礙和喪失的機制尚未完全闡明，因而引起人們越來越多的關注。我們猜測，高血糖能夠誘導細胞內ROS生成增加，而ROS又能啟動血糖異常代謝途徑，各種代謝產物又不斷將氧化應激放大，導致更多的自由基生成，激發(fā)了更大的氧化應激，最終引起視網(wǎng)膜毛細血管內皮細胞及周細胞凋亡，血-視網(wǎng)膜屏障破壞以及視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在Nrf2缺乏的糖尿病小鼠中，過氧化物表達、引起DR的重要炎癥因子——腫瘤壞死因子-α都明顯高于Nrf2存在的糖尿病小鼠；而視網(wǎng)膜中抗氧化蛋白GSH水平卻明顯低于野生型糖尿病小鼠?？傊C實了Nrf2信號通路在延緩DR發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

視神經（optic nerve）損傷，又稱之為外傷性視神經炎病變（traumatic optic neuropathy），是顱腦損傷中常見和嚴重的并發(fā)癥之一，約占顱腦外傷的2%～5%。眾多實驗已證明，Nrf2介導的信號通路能保護氧化應激所致的神經退行性病變。體內及體外研究均發(fā)現(xiàn)，長效梔子素衍生物能通過激活Nrf2信號通路減少氧化應激損傷所致的視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞死亡，抗氧化劑R-α硫辛酸通過激活Nrf2信號通路上調下游因子HO-1的表達，從而保護氧化應激導致的視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞損傷?？傊?，上調Nrf2信號通路能減輕視網(wǎng)膜神經節(jié)細胞的損傷。

還有葡萄膜炎、早產兒視網(wǎng)膜病變等多種眼科疾病都表明了Keap1-Nrf2系統(tǒng)在其中抗氧化應激的作用，但其在多種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展機制中究竟扮演了什么角色，還有待于進一步研究。目前的動物實驗已顯示，多種Nrf2激動劑對多種眼細胞具有保護作用，因此Keap1-Nrf2-ARE通路可作為治療眼科疾病的一個新的靶點，預期對臨床眼科疾病的治療發(fā)揮重要作用［84］。

5.1.6 神經退行性疾病

事實表明，Keap1-Nrf2系統(tǒng)在神經退行性疾病中也發(fā)揮重要作用。Keap1抑制、Nrf2激活對氧化應激所致神經退行性變的保護作用已經得到了很好的研究：Nrf2轉錄因子通過誘導多種細胞防御和解毒酶的表達，在神經退行性疾病中起保護作用。Nrf2是調控細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，而中樞神經系統(tǒng)對氧化應激敏感。所以異常的Nrf2水平將導致氧化應激的發(fā)生，而氧化應激又可導致異常蛋白質聚集、小膠質細胞活化和線粒體功能障礙等病理特征，這些病理過程將產生ROS，進而脂質、蛋白質和DNA損傷。這些病理生理事件包括各種各樣的神經退行性疾病，包括阿爾茨海默?。ˋD）、亨廷頓氏?。℉D）、帕金森?。≒D）、缺血和中風。a.帕金森?。≒D）。Keap1-Nrf2系統(tǒng)和癌基因DJ-1調控PD疾病的發(fā)生。DJ-1是一種氧化應激傳感器基因，也是一種轉錄調節(jié)因子。在正常氧化應激條件下，DJ-1的表達增加，Nrf2依賴基因的表達正常，后通過應激誘導的細胞死亡幫助減少氧化應激的發(fā)生；而在DJ-1基因缺陷的患者中，Nrf2依賴基因的表達減少，氧化應激增加。當細胞內氧化還原狀態(tài)不平衡時，即DJ-1過度的氧化也會使其功能喪失，從而導致PD的氧化應激。這表明，功能失調的Nrf2水平與家族性PD的發(fā)病機制有關。DJ-1阻止Keap1與Nrf2相互作用，從而防止Nrf2的泛素化而保護神經元免于氧化應激和細胞死亡；在沒有DJ-1的情況下，Nrf2是不穩(wěn)定的，轉錄反應在基礎條件和誘導條件下都會變遲鈍從而導致PD的發(fā)生發(fā)展。而多巴胺類似物6-羥基多巴胺（6-HAD）具有高度神經毒性，被發(fā)現(xiàn)能夠激活Nrf2，進而激活細胞防御機制，以防止氧化應激。因此，6-HAD可作為Nrf2激活劑以成為PD的治療靶點，從而改善PD的病情。b.亨廷頓氏?。℉D）。研究表明，在HD的初級階段，Nrf2激動劑通過Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)過表達重要的細胞保護基因，激活星形膠質細胞和小膠質細胞，這可能會保護由ROS引起的腦損傷。星形膠質細胞中Keap1-Nrf2通路的激活加速了神經元對非興奮性毒性谷氨酸的抵抗。因此，Nrf2的激活和過表達是治療HD的一個令人鼓舞的治療靶點。還有，在氧化應激下，p62能通過直接競爭使Nrf2與Keap1解離，隨后激活Nrf2并介導Keap1的自噬降解，從而在腦缺血損傷期間清除ROS，對預防氧化損傷和減輕內質網(wǎng)應激起著重要作用，所以抑制Keap1表達，促進Nrf2激活也是一個重要的防治HD的切入點［85］。c.阿爾茨海默病。同樣地，Keap1-Nrf2系統(tǒng)也調控AD的發(fā)生。在AD患者的大腦中Nrf2顯著減少，這可能解釋了神經元對神經退行性疾病損傷易感性增加的原因。另一項研究顯示，DJ-1能穩(wěn)定功能失調的Nrf2，它通過阻止Keap1與Nrf2的聯(lián)系，導致Keap1受蛋白酶體降解而Nrf2穩(wěn)定表達。有研究利用果蠅模型，確定了Nrf2負性調節(jié)因子Keap1抑制是挽救AD相關Nrf2缺陷和隨后預防神經元變性的有效靶點。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)了一種新的化合物——1，4-二苯基-1，2，3-三唑化合物，它直接阻斷了Nrf2和Keap1之間的結合，從而可以減弱AD在小鼠神經元中的毒性作用。因此，直接的Keap1-Nrf2干擾因子對神經退行性疾病中觀察到的Nrf2活性缺陷具有針對性，在此基礎上進一步開發(fā)此類化合物可以作為潛在的新藥，來預防神經衰弱和其他神經退行性疾病［86］。還有某些藥物或慢病毒也可導致Nrf2表達增加，使Nrf2增加抗氧化基因的表達，改善活性氧積累的肽類，即其也可以作為AD的治療靶點，從而改善AD的病情。最后，有研究提供了第一個體內證據(jù)，即對Nrf2負性調節(jié)因子Keap1的特異性抑制，通過與Nrf2激活相關，可以防止AD引起的神經元毒性?？偟膩碚f，我們特別強調Keap1是AD中Nrf2活化的有效靶點，并支持進一步研究Keap1直接抑制劑預防體內神經退行性變［86］。

5.1.7 心血管疾病

Keap1-Nrf2系統(tǒng)在心血管疾病中也起到了非常重要的作用。在心肌肥大的早期，Keap1釋放Nrf2后易位至細胞核內，啟動許多抗氧化基因，例如SOD、CAT和GPx等的轉錄，對心臟中的病理性氧化應激進行廣泛的細胞防御：這表明早期Keap1-Nrf2系統(tǒng)發(fā)揮積極作用。然而，到晚期階段，前期Nrf2的過度激活導致Nrf2表達下調，無法維持心肌細胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)，因此，心臟持續(xù)的氧化應激將誘導心臟重塑，并最終導致心力衰竭，這表明晚期Keap1-Nrf2系統(tǒng)發(fā)揮消極作用。還有研究表明，4-羥基壬烯酸可以通過形成加合物直接誘導Keap1的構象變化；或通過增加線粒體ROS的產生間接誘導Keap1的構象變化激活Nrf2，在活化抗氧化酶的基礎上，刺激GSH生物合成，進一步保護心臟，但4-羥基壬烯酸誘導Nrf2核聚集的機制仍有待闡明［87］。

5.1.8 缺血/再灌注損傷

缺血性心臟?。↖HD）是全球范圍內死亡和殘疾的主要原因，據(jù)估計每年全球約有740萬人死亡。盡管通常以經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈搭橋術為代表的心肌再灌注治療已成為IHD治療的主流方法，但缺血再灌注（IR）損傷仍然是一個尚未解決的問題，主要影響再灌注治療的有效性。因此，如何有效地預防心肌IR損傷已引起研究人員越來越多的興趣。盡管尚未完全闡明心肌IR損傷的機制，但氧化應激和炎癥已被證明是造成心肌IR損傷的原因，所以Nrf2是關鍵的轉錄因子。在生理狀態(tài)下，Nrf2通過與作為Nrf2生理抑制劑的Keap1結合而主要存在于細胞質中。然而，在氧化應激條件下，Nrf2通過與Keap1分離而轉移到細胞核中，隨后激活了抗氧化基因如HO-1的轉錄，可保護細胞免受氧化應激和炎癥誘導的損傷。還有，經子苷誘導的預處理可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制氧化應激來減輕心肌IR損傷。此外，Nrf2的激活能抑制NLRP3炎癥小體介導的經由ROS在腦IR上的損傷。因此，Nrf2被認為是心肌IR損傷的治療靶標。

據(jù)報道，Sweroside（一種從擬南芥（Swertia pseudochinensisHara）中提取的secrididoid葡萄糖苷）具有抗氧化和抗炎活性從而減輕IR帶來的機體損傷。它可能與Keap1相互作用來發(fā)揮作用。已確定經Sweroside處理后，Keap1的表達水平顯著降低了51%；而Nrf2在細胞質中的表達降低了50%，但在細胞核中的表達水平幾乎提高了兩倍，這支持了Sweroside抑制Keap1表達并促進Nrf2核易位的假說。越來越多的證據(jù)表明，一些小分子可通過中斷Keap1-Nrf2的PPI導致Nrf2活性升高?？紤]到在分子對接模型中預測了Keap1和Sweroside之間的相互作用，推斷Sweroside通過競爭性結合Keap1，進而促進Nrf2從Keap1-Nrf2復合物中逃逸而被激活。此外，證實了Sweroside對HO-1和ROS的作用可以通過抑制Nrf2得以挽救，這進一步證明了其抗氧化作用是Nrf2依賴性的。綜上，可以此為方向尋找能特異性靶向Keap1抑制而激活Nrf2的藥物來防治IR［88］。

5.2 Keap1與癌癥

文獻表明，Keap1是一種腫瘤抑制因子，也是一種重要腫瘤蛋白。Keap1招募底物并靶向泛素化和蛋白酶體或自噬降解，從而保持底物的低水平。而癌癥中Keap1介導的泛素化降解功能失調，這往往是由于癌癥中存在的Keap1體細胞突變導致的。例如在肺癌中Keap1體細胞突變導致Nrf2或IKKβ或SOX9蛋白水平升高，并通過不同的級聯(lián)反應而導致肺癌的發(fā)生和惡性進展。此外，Keap1點突變在胃癌（11.1%）、肝癌（2.8%）、結腸直腸癌（7.8%）、前列腺癌（1.3%）、膽囊癌（30.7%）、卵巢癌（37%）、膠質瘤（1.7%）、頭頸癌（42%）和透明腎細胞癌（4.7%）等多種人類癌癥中被發(fā)現(xiàn)［89］，但大多數(shù)這些突變的功能性后果和機制仍然未知。也有研究確定了Keap1突變的3種不同的功能類別：a.最有可能代表乘客事件的沉默突變；b.亞型突變；c.功能性死亡蛋白質［90］。提示了Keap1突變功能的多樣性。為此，我們將癌癥中的Keap1突變進行了歸納（表2），并在下文詳細介紹了Keap1突變導致肺癌發(fā)生發(fā)展的詳細機制。

Table 2 Somatic mutations of Keap1 in various human cancers表2各類人類癌癥中Keap1的體細胞突變

有研究證實，Keap1能夠抑制NSCLC的轉移，其作用機制是通過調節(jié)Nrf2/S100P信號通路而發(fā)揮作用。它可以作為NSCLC中預測腫瘤進展和監(jiān)測治療效果的分子標志物。這些研究證明，Keap1是一種抑癌基因，由于它的缺失導致腫瘤的發(fā)生。在多種癌癥中報道了Keap1基因存在突變體。最初是在人肺腺癌細胞系中鑒定出了Keap1基因的突變體，在Keap1的Kelch/DGR結構域中，甘氨酸被半胱氨酸所取代。此后，肺癌組織中也發(fā)現(xiàn)Keap1基因的Kelch或IVR結構域中存在多個突變體。在肝癌和膽囊癌中也檢測到Keap1的突變能夠導致Nrf2的過度表達，促進Ⅱ期解毒酶和抗氧化蛋白的激活。越來越多的研究證明，Keap1在多種癌癥中發(fā)生突變，并且Keap1不同的表達狀態(tài)對腫瘤的作用也不相同。例如，在乳腺癌基因組研究中Keap1 N端結構域的突變（C23Y）消除其對Nrf2的抑制作用，有利于癌細胞存活和治療耐藥。除了這些突變體之外，Keap1基因突變也已在卵巢癌、子宮內膜癌和肺乳頭狀腺癌細胞中被發(fā)現(xiàn)［104］。以下詳細介紹一下Keap1與肺癌的關系。

Keap1缺失促進KRAS驅動的肺癌并導致對谷氨酰胺分解的依賴。大約20%的KRAS突變型肺腺癌（LUAD）腫瘤攜帶編碼Keap1基因功能缺失突變。Keap1的高頻率突變提示，氧化應激反應在肺腫瘤發(fā)生中起重要作用。實驗顯示，在KRAS驅動的LUAD小鼠模型中使用CRISPR-Cas9基因敲除Keap1的方法，發(fā)現(xiàn)Keap1缺失對肺癌進展的影響：在小鼠中，Keap1的缺失會使Nrf2過度活躍，并促進KRAS驅動的LUAD。通過基于CRISPRCas9的基因篩選和代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)Keap1缺失或Nrf2突變型癌癥依賴于谷氨酰胺分解的增加，這一特性可通過谷氨酰胺酶的藥理抑制進行治療［39］。

受體酪氨酸激酶（RTK）-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在肺癌和其他癌癥的發(fā)展中起著重要作用，并且該通路的多個節(jié)點經常發(fā)生突變或拷貝數(shù)改變。靶向RTK-MAPK通路的抑制劑被認為能導致肺癌和其他癌癥的臨床反應。靶向RTKMAPK途徑的抑制劑治療，可增加Keap1完整細胞中的ROS，而Keap1的丟失則消除了這種增加效應。此外，Keap1的缺失還能增加Nrf2的活性，而后通過增加谷胱甘肽的合成減少ROS的產生，改變細胞代謝，使細胞在缺乏MAPK信號的情況下增殖?？偨Y來說：在多種靶向RTK-MAPK途徑的抑制劑存在下，Keap1-Nrf2通路的改變可能會促進細胞生存，RTK-MAPK途徑抑制劑通過阻斷MAPK信號并誘導ROS減少，使Nrf2穩(wěn)定至低水平，但Keap1缺失或Nrf2過表達足以在MAPK信號缺失的情況下恢復細胞增殖。然而，此前有研究表明，Nrf2對ROS的解毒和對氧化還原狀態(tài)的調節(jié)有助于腫瘤的發(fā)生。最近也發(fā)現(xiàn)Nrf2是一種致癌基因，除了它在調節(jié)氧化還原狀態(tài)中的作用外，Nrf2還可以調節(jié)許多代謝酶的表達，將葡萄糖和谷氨酰胺重新定向到支持增殖的合成代謝途徑中，以及控制絲氨酸和甘氨酸生物合成以支持谷胱甘肽和核苷酸的生產。因此在Keap1缺失時，增加Nrf2的表達可以通過降低ROS和調節(jié)代謝途徑來增強對RTK-MAPK途徑抑制的抵抗力。Nrf2負性調節(jié)因子Keap1的缺失，調節(jié)肺癌BRAF、NRAS、KRAS、EGFR和ALK基因突變。在大約30%的肺鱗狀細胞癌和大約20%的肺腺癌中，Keap1-Nrf2通路中某些元素發(fā)生了基因改變。該途徑的改變可與RTK-Ras途徑的改變同時發(fā)生，盡管在肺癌的癌基因陰性亞群中，Keap1-Nrf2的改變更為豐富［105］。

6 調控和影響Keap1的因素

6.1 甲基化修飾對Keap1轉錄水平的影響

首先，Keap1功能在轉錄水平受到調控。Keap1受到甲基化的啟動子的直接調控。已有實驗證實，在非小細胞肺癌、結腸癌、前列腺癌中，Keap1基因的啟動子區(qū)CpG島高甲基化而低表達，且Keap1啟動子區(qū)域內CpG島高甲基化在乳腺癌、前列腺癌及結腸癌等腫瘤中直接或間接促進了化療耐藥，從而證實Keap1-Nrf2-ARE信號通路與多重耐藥機制相關聯(lián)［9］（圖1f）。

6.2 幾種微小RNA對Keap1翻譯水平的影響

其次，Keap1功能在在翻譯水平受到調控。有研 究 發(fā) 現(xiàn)，幾 種 微 小RNA（microRNAs，miRNAs）調節(jié)Keap1在人類疾病中的表達。miRNAs是一種識別特定mRNAs 3'非翻譯區(qū)域（3'untranslated regions，3'UTR）的小非編碼分子，通過翻譯阻斷或強制降解來負調控mRNA的豐度。首先，檢索TargetScan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Keap1 mRNA的3'UTR上有miR-223結合位點。通過實驗發(fā)現(xiàn)，miR-223模擬轉染HepG2細胞的內源性miR-223表達上調，并觀察到Keap1蛋白質水平的降低；而在miR-223抑制劑轉染的HepG2細胞中觀察到miR-223表達的顯著降低和Keap1蛋白質水平的增加。這些結果表明，miR-223的表達負調控HepG2細胞中Keap1的蛋白質水平?？傊?，Keap1受miR-223靶向調控，而且Keap1的負調控因子miR-223在T2DM肝損傷中是一個有吸引力的治療靶點［106］。另一項研究表明，果糖誘導miR-200a低表達而上調Keap1，從而阻斷Nrf2抗氧化途徑，增強ROS驅動的TXNIP，激活NLRP3內酰胺酶，干擾脂質代謝相關蛋白，引起細胞氧化應激、損傷和脂質沉積。而Polydatin增強miR-200a表達以控制Keap1-Nrf2通路是治療果糖相關性肝損傷和脂質沉積的一種治療策略［107］。此外，在食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中miR-432-3p通過抑制Keap1 mRNA的翻譯而正向調節(jié)Nrf2的活性［108］（圖1f）。

6.3 Keap1蛋白翻譯后水平修飾的調控

最后，Keap1蛋白受翻譯后修飾水平的調控。功能研究表明，在多種癌癥細胞模型內，TRIM25正調控Keap1含量，即其通過直接靶向Keap1進行泛素化和降解，激活Nrf2信號并降低ROS水平，從而促進腫瘤細胞存活［109］（圖1f）。以下還有幾種經典的對Keap1的翻譯后修飾。

6.3.1 氧化修飾（oxidation）

活細胞在氧化和還原之間保持平衡，這種氧化還原平衡的擾動被認為是導致多種疾病的原因。調節(jié)氧化還原狀態(tài)的最新嘗試集中在親電試劑（EPs）上，它們可激活有效的細胞防御系統(tǒng)抵抗氧化應激。這種方法的一個例子是鼠尾草酸（CA）和鼠尾草酚（CS），這是在迷迭香（Rosmarinus officinalis）中發(fā)現(xiàn)的化合物。重要的是，CA和CS本身不是親電的，而是響應氧化而變成親電的，然后激活Keap1/Nrf2/ARE轉錄途徑來合成內源性抗氧化劑“2期”酶［110］。

正常狀態(tài)下，細胞質中的Nrf2與Keap1結合并處于活性相對抑制狀態(tài)。而在外界氧化應激刺激下（如ROS或RNS），解偶聯(lián)后的Nrf2進入細胞核，與ARE相結合，啟動下游的抗氧化酶，這些酶包括超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、醌氧化還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）等?，F(xiàn)在，有越來越多的天然抗氧化劑被發(fā)現(xiàn)，其具有抵抗細胞內氧化過度的情況，如白藜蘆醇、姜黃素、原花青素、槲皮素、茶多酚等［111］。在COPD患者中，長期受到煙草中自由基和化學物質刺激時，會引起Keap1構象的改變或者由高度活性的氧化物直接促使Nrf2被磷酸化，導致Nrf2與Keap1解離而活化，活化的Nrf2進入細胞核，與ARE結合，啟動ARE下游的抗氧化蛋白或促抗氧化蛋白合成酶等基因轉錄和表達以抵抗內外界的有害刺激。

除了通過氧化調節(jié)Keap1，在某些化學和氧化應激條件下，Keap1本身可以通過修飾其中心連接域而使自身多聚泛素化。此外，在壓力應激條件下，Nrf2的DLG基序可以從Keap1上斷開，允許多泛素結合蛋白p62的結合，進入自噬介導的溶酶體途徑降解。

6.3.2 糖基化修飾（glycosylation）

O-連接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）是一種動態(tài)翻譯后修飾（PTM），能可逆性修飾數(shù)千種核、細胞質和線粒體蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基。在哺乳動物中，O-GlcNAc由O-GlcNAc轉移酶（OGT）添加，并由O-GlcNAc酶（OGA）去除。異常的O-GlcN酰化與各種人類疾病，特別是癌癥有關。例如，許多癌蛋白（如Myc、Akt）和腫瘤抑制物（如p53、AMPK）被O-GlcNAc酰化，從而影響致癌信號和治療反應。

OGT抑制的許多轉錄效應受氧化還原應激耐受的主要調節(jié)因子Nrf2的激活。此外，我們發(fā)現(xiàn)在多個腫瘤表達數(shù)據(jù)中，低OGT活性的特征與Nrf2激活密切相關，即OGT抑制激活Nrf2依賴的轉錄程序。在這些信息的指導下，我們確定Keap1、Nrf2的主要負調節(jié)因子，是OGT的直接底物。

為了闡明O-GlcNAc?；瘜eap1的功能效應，經過對純化的Keap1進行基于質譜（MS）的蛋白質組學分析，確定了11個候選O-GlcN?；稽c：4個假定的O-GlcNAc位點（S102、S103、S104和S166）位于BTB結構域的α螺旋內；另外6個潛在的O-GlcNAc位 點（T388、S390、S391、T400、S404和S410）位于第二個Kelch基序的β鏈中，而最終候選位點（S533）位于第五個Kelch基序中。我們通過Nrf2活性的轉錄和ROS讀數(shù)判斷，Keap1在S104處的O-GlcNAc?；瞧浣閷rf2泛素化和蛋白酶體破壞的能力所必需的，并且不可糖基化的S104A突變體Keap1賦予Nrf2依賴性抵抗erastin誘導的細胞死亡，但S104糖基化不是Keap1二聚所必需的。文獻表明，OGT在非應激條件下與Keap1相互作用并組成糖基化，后抑制OGT降低Keap1 O-GlcNAc?；Ｔ谠S多人類腫瘤中，Nrf2通路被不適當?shù)丶せ睿x予腫瘤生長優(yōu)勢和治療抗性?？赡芡ㄟ^Keap1糖基化的藥理作用抑制Nrf2信號，從而使癌細胞對化療或放療敏感。有趣的是，O-GlcNAc水平和Nrf2活性隨葡萄糖波動而變化，即葡萄糖饑餓會復制OGT抑制，導致Keap1去糖基化，減少Keap1-Cul3相互作用，并誘導Nrf2通路，所以通過小分子OGA拮抗劑對Keap1去糖基化的藥理學抑制，可以阻止癌細胞中葡萄糖饑餓誘導的Nrf2。表明Keap1 O-GlcNAc酰化將營養(yǎng)感應與下游脅迫抗性聯(lián)系起來，因此，通過Keap1 OGlcNAc?；刂芅rf2信號可能具有病理生理意義，尤其是在灌注不良、低血糖/缺氧的實體瘤中。

Keap1通過其BTB結構域和部分中間區(qū)結構域與Cul3結合，而Keap1 Kelch基序與底物相互作用。其上S104的O-GlcNAc?；赏ㄟ^增強Keap1-Cul3結合、優(yōu)化Keap1構象或兩者促進與Cul3的生產性相互作用及其底物的有效泛素化。一些研究表明，IKKβ也是一個靶點。因此，在未來的研究中確定IKKβ或其他Keap1底物是否也在對OGT抑制的反應中積累將是有趣的。此外，雖然Keap1 Kelch結構域上的候選O-GlcNAc位點對Nrf2調節(jié)沒有顯著影響，但它們可能有助于其他Keap1-Cul3底物的結合，或者可能調節(jié)Keap1以響應其他信號。未來的工作將集中于S104之后Keap1 O-GlcNAc位點的潛在功能后果和下游效應［112-113］。

6.3.3 烷基化（alkylation）

在基礎條件下，胞質蛋白Keap1與Nrf2導致其啟動子區(qū)域包含ARE的細胞保護性基因的表達水平較低。文獻表明人Keap1的27個半胱氨酸巰基中的一個或多個烷基化會導致細胞質中Nrf2的泛素化和蛋白酶體介導的降解降低，Nrf2核積累，再通過ARE上調細胞保護性基因的表達從而增強抗氧化能力而保護細胞，并預防諸如癌癥的退化性疾病。因此，鑒定這些半胱氨酸殘基對特定親電試劑最具反應性有助于闡明這種癌癥預防機制，也稱為化學預防。

酶的誘導，例如醌還原酶、葡糖醛酸轉移酶、谷胱甘肽S-轉移酶和磺基轉移酶可以保護細胞免受致癌物的毒性和腫瘤作用。細胞核中Nrf2濃度的增加，會上調ARE并誘導這些化學預防酶的表達。經查閱文獻得知，某些親電子化合物能使Keap1烷基化，表明這些化合物具有上調ARE并誘導酶的能力［114］。如碳正離子、醌、醌甲基化物、醌亞胺、環(huán)氧化物和Michael受體之類的親電子試劑均能與Keap1反應，并可能是癌癥化學預防劑，但應預期這些化合物中反應性最強的物質會引起毒性（尤其是高劑量時）。因此，只有弱親電試劑（例如Michael受體黃腐酚）能在很寬的劑量范圍內顯示出化學預防癌癥的活性，而不會顯示出毒性。因此，可以預期在生物系統(tǒng)中不與水或其他弱親核試劑反應的情況下就可以使用這種癌癥化學預防劑。所以，可以將Keap1烷基化的天然產物（如黃腐酚）用于預防癌癥，它們可能通過誘導ARE調節(jié)的保護酶而起化學保護劑的作用。而在Keap1的各種半胱氨酸殘基中，C151對親電試劑的反應性最強。且具有共軛二乙炔碳的泛醇可以共價修飾Keap1中的C151殘基，從而使Keap1失活，導致Nrf2-ARE途徑的激活［115-116］。

內源性代謝物衣康酸（itaconate）最近已成為巨噬細胞功能的調節(jié)因子，但其確切的作用機制仍不清楚。在小鼠和人巨噬細胞中，脂多糖（LPS）激活Nrf2所需的就是衣康酸。此外，衣康酸是一種抗炎代謝產物，可通過半胱氨酸殘基的烷基化直接修飾蛋白質。如其烷基化了Keap1蛋白上的Cys殘基151、257、288、273和297，使Nrf2能夠增加具有抗氧化和抗炎能力的下游基因表達，即衣康酸的抗炎作用需要Nrf2的激活。一種新的細胞可滲透的衣康酸衍生物，4-辛基衣康酸酯（4-octyl itaconate）的使用，可保護體內脂多糖誘導的致死性并減少細胞因子的產生。

衣康酸是對LPS的反應，部分通過I型干擾素（IFN）產生，并通過Nrf2激活和一種關鍵的促炎性調節(jié)劑琥珀酸脫氫酶（SDH）抑制作用來促進抗炎程序。通過下調IFN應答，進一步限制了炎性基因的表達及其自身的產生。這有助于解釋為什么缺乏Nrf2的小鼠對敗血性休克更加敏感，即使在某些情況下也可以保護這些小鼠免于發(fā)炎。我們確定衣康酸是一種炎癥調節(jié)劑，可以通過新近鑒定的翻譯后修飾直接修飾蛋白質，從而揭示了使用衣康酸治療炎性疾病的治療機會。此外，最近從衣康酸與維生素B12形成了一個有趣的聯(lián)系，這有必要在炎癥和免疫方面進行進一步的研究。進一步了解衣康酸酯作為I型IFN的抗炎代謝產物和調節(jié)劑的作用可能會為炎癥疾病的發(fā)病機理提供新的見解［117］。

7 展 望

Keap1作為E3泛素連接酶接頭蛋白，其介導的泛素化通常走向蛋白質降解并影響某些信號事件。我們也對其中4種降解型底物進行了詳細的闡述，然而泛素化是個復雜的翻譯后修飾過程，降解型泛素化修飾并不是其唯一通路。因此為了解Keap1究竟是通過降解型泛素化修飾還是非降解型來影響下游底物，其泛素化底物似乎可成為一個切入點。眾所周知，Keap1通常結合擁有E（T/S）GE基 序 的 底 物 蛋 白，如Nrf2、IKKβ、p62、SOX9、PGAM5、PALB2和MCM3等。有趣的是，在這些底物中，擁有另一個DLG基序的底物蛋白如Nrf2、IKKβ被Keap1泛素化后被蛋白酶體降解，然而僅含有E（T/S）GE基序的底物蛋白如PGAM5、PALB2和MCM3被Keap1泛素化修飾，但蛋白質穩(wěn)定性并不受影響。而同樣存在具有ETGE和DLG基序的Nrf1僅被Keap1泛素化而不被降解。此外SOX9不同于其他，它與Keap1結合是通過兩個DLK基序，這種基序與DLG基序非常相似。在這里我們提出一種猜想，底物是否標記為泛素化降解以及其降解動力學如何，可能部分取決于DLG基序的存在。但這似乎不足以完全解決泛素化之后通路的問題，因此，今后更多底物的發(fā)現(xiàn)可能有助于解決該問題。

Keap1作為一種抑癌基因，在人類癌癥中存在著各式的Keap1體細胞突變，且這些突變遍布在整個Keap1蛋白。因此，了解特定的體細胞突變對蛋白質功能有何影響，能為以后治療那些存在Keap1突變的癌癥提供一定的見解。例如一項對鱗狀細胞肺癌中體細胞突變的研究表明，Keap1中沒有一個突變發(fā)生在與Nrf2直接相互作用的氨基酸中。然而，其中一些突變能增強Keap1和Nrf2之間的相互作用，盡管它們不影響泛素化，但它們阻止了Nrf2的蛋白酶體降解?？傊?，探究Keap1突變影響其底物蛋白結合能力或者是泛素化具有重要意義。此外Keap1癌癥基因組的改變與癌基因信號通路的異常激活存在一定聯(lián)系，并提示泛素介導的腫瘤蛋白水解作用有助于腫瘤的發(fā)展。因此，進一步研究Keap1激活機制并開發(fā)針對Keap1表達的藥物可能對癌癥的治療或預防具有重要的臨床意義。

上文討論了Keap1在由于氧化應激導致的許多人類疾病中的負面作用。Keap1抑制劑的出現(xiàn)為對這些疾病有效的治療或預防劑。早期的Keap1抑制劑是作用于Keap1半胱氨酸發(fā)揮作用的親電子試劑，也被稱之為Keap1間接抑制劑。如三萜化合物2-氰 基-3，12-二 氧ooleana-1，9-二 烯-28-油 酸（CDDO）的衍生物是極強的親電反擊反應誘導劑。這些衍生物與C151結合并破壞KEAP1和CUL3之間的相互作用。具有與CDDO類似骨架結構的小分子（例如CDDO-Im）已被開發(fā)為立體選擇性KEAP1-C151結合試劑。但這些抑制劑存在著很大的缺陷，Keap1的抑制劑可能會產生脫靶反應，引起潛在的毒性作用。為此，在Keap1-Nrf2 PPI研究的基礎下，人們已經開發(fā)了針對于Keap1-Nrf2 PPI的幾種直接抑制劑。這些直接抑制劑通過非共價機制通過抑制Keap1-Nrf2 PPI起作用，也被認為是一種用于治療和預防多種疾病和病癥的新穎治療策略。最近也開發(fā)了Keap1與其他底物之間的直接抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)N-［2-丙酮基-4-（4-乙氧基苯磺?；被┹?1-基］-4-乙氧基苯磺酰胺（K67）是磷酸化p62-Keap1相互作用的抑制劑，可降低肝癌中Nrf2的水平。K67抑制肝癌細胞的增殖并加速抗癌藥的作用。K67還可能使癌細胞對抗癌藥物的抵抗力降低，尤其是在HCV陽性肝癌患者中。因此，在未來Keap1與底物之間的PPI的研究可以為更多直接作用與PPI的Keap1抑制劑提供見解。Keap1抑制劑在疾病中是把雙刃劍，Keap1抑制劑的使用在肝病模型中已經體現(xiàn)出Keap1抑制劑的黑暗一面。Keap1抑制劑可以激活Nrf2改善3期慢性腎臟疾病和2型糖尿病患者的腎小球濾過率而發(fā)揮積極作用，但也能激活NF-κB而加重腎纖維化。因此，在使用Keap1抑制劑時，腎病中NF-κB和Nrf2激活的對立面似乎更加體現(xiàn)了Keap1抑制劑特異性的重要性。此外，Keap1的其他功能也是目前研究的熱點，雖然已經有了實質性的進展，但Keap1的功能仍有待完善。特別是在衰老這一人類不可避免的事件中，雖然已經提出Keap1-Nrf2在衰老中的重要作用，但僅局限于Nrf2的作用，而Keap1的神秘面紗卻始終沒有揭開。因此，在未來，衰老中Keap1的非規(guī)范功能研究是重要的。