單細(xì)胞機械性能檢測方法與應(yīng)用研究進(jìn)展*

張孝哲 項楠倪中華

（東南大學(xué)機械工程學(xué)院，江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計與制造重點實驗室，南京 211189）

理解細(xì)胞的生物化學(xué)和機械力學(xué)性能是生物物理、醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。近年來，細(xì)胞的機械性能被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能直接相關(guān)。人體在患病后，體內(nèi)部分細(xì)胞的細(xì)胞膜［1］、細(xì)胞骨架［2-4］和細(xì)胞核［5-6］等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞機械性能改變。例如，研究發(fā)現(xiàn)，人體在感染瘧疾或患鐮刀型貧血癥后，體內(nèi)紅細(xì)胞硬度高于正常紅細(xì)胞，導(dǎo)致其穿越血管壁受阻［7-9］。另有研究表明，紅細(xì)胞在長期存儲過程中的硬度亦會略有提升［10］，且在不同存儲條件下呈現(xiàn)不同程度的改變［11］。癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程通常也伴隨著細(xì)胞機械性能的改變，如乳腺癌［12-13］、肺癌［14］、前列腺癌［15-16］等癌細(xì)胞比相對應(yīng)的良性細(xì)胞表現(xiàn)出更高的變形性與彈性，甚至細(xì)胞在癌癥的不同發(fā)展進(jìn)程中也表現(xiàn)出硬度、變形性等性質(zhì)的差異［3，17］，而這些特性往往與腫瘤的轉(zhuǎn)移性和侵襲性有關(guān)［18-20］。

近年來，研究者們開發(fā)了多種單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)（圖1），基于細(xì)胞機械性能的差異實現(xiàn)不同細(xì)胞的鑒別，并研究細(xì)胞機械性能與其生物學(xué)特性之間的關(guān)系。早期典型單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)包括：原子力顯微鏡［21］、微吸管技術(shù)［22］和光鑷與光學(xué)拉伸［23-24］，這些技術(shù)對于細(xì)胞機械性能的表征都具有非常高的精度。然而，這些技術(shù)的檢測通量相對較低（一般低于1 cell/min）。此外，亦有其他技術(shù)被應(yīng)用于單細(xì)胞機械性能的檢測，如聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)流變儀與磁鑷和粒子追蹤微流變法。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，研究人員基于微流控方法開發(fā)出多種新興的高通量單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)，如利用流體拉伸［25］或剪切細(xì)胞［26］以及使細(xì)胞過孔擠壓變形［27］，其通量一般可達(dá)數(shù)百至數(shù)千cells/min，甚至上百萬cells/min。

本文首先介紹了目前單細(xì)胞機械性能檢測領(lǐng)域經(jīng)典的檢測技術(shù)，闡述了原子力顯微鏡、微吸管技術(shù)和光鑷與光學(xué)拉伸的檢測原理及最新研究進(jìn)展并簡要概述了聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)流變儀與磁鑷以及粒子追蹤微流變法。之后，本文從細(xì)胞受力方式的角度介紹了近10年來發(fā)展迅猛的微流控高通量檢測技術(shù)。最后，本文對單細(xì)胞機械性能檢測方法未來的研究與發(fā)展方向進(jìn)行了探討。

Fig.1 Technologies for the detection of single cell mechanical properties圖1單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)

1 傳統(tǒng)單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)

隨著細(xì)胞機械性能在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上表現(xiàn)出越來越重要的作用，細(xì)胞的機械性能受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。由于細(xì)胞的異質(zhì)性，單細(xì)胞的檢測相比于細(xì)胞群的檢測，在獲取稀有目標(biāo)細(xì)胞機械性能時具有更大的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的單細(xì)胞機械性能檢測方法主要包括：原子力顯微鏡、微吸管技術(shù)和光鑷與光學(xué)拉伸；此外，聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)流變儀與磁鑷以及粒子追蹤微流變法也被用于單細(xì)胞機械性能的檢測。

1.1 原子力顯微鏡

壓痕實驗是檢測材料機械性能最常用的方法之一，可以給出材料廣泛的機械力學(xué)參數(shù)，如彈性、粘彈性，甚至是動態(tài)流變學(xué)特性。細(xì)胞作為一種生物材料，壓痕實驗亦是單細(xì)胞機械性能檢測的重要方法。自1986年原子力顯微鏡被Binnig等［21］提出，原子力顯微鏡的應(yīng)用范圍不斷擴大［28-29］。由于原子力顯微鏡不依賴于樣品表面的電導(dǎo)率，適用于各種實驗樣品及環(huán)境，Radmacher等［30］提出將其用于測量細(xì)胞機械性能，并應(yīng)用力學(xué)中經(jīng)典的梁理論來確定細(xì)胞的力學(xué)參數(shù)。

原子力顯微鏡的工作原理是基于掃描隧道顯微鏡與針形輪廓儀的結(jié)合。測量細(xì)胞的力學(xué)特性時，原子力顯微鏡執(zhí)行端的彈性懸臂（一般由硅微制造而成，彈簧常數(shù)一般在0.02～0.08 N/m之間［31］）受預(yù)設(shè)程序控制下壓（圖1a）。彈性懸臂前端附著有與細(xì)胞接觸的探針，其外形一般為球形、金字塔形和錐形。其中球形尖端與細(xì)胞有更大的接觸面積和更低的局部應(yīng)變，受細(xì)胞局部力學(xué)響應(yīng)的影響較小，在全細(xì)胞機械性能的測量中具有明顯的優(yōu)勢［32］。通常尖端所造成的細(xì)胞壓痕深度一般不超過細(xì)胞高度的15%。當(dāng)壓痕深度接近或大于尖端高度時，除了懸臂末端附著的探針與細(xì)胞接觸外，懸臂的底部還可能與細(xì)胞接觸，導(dǎo)致測量的細(xì)胞彈性高于實際值［32］。Pogoda等［33］對成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞的力學(xué)特性分析結(jié)果表明：當(dāng)壓痕深度增加時，測得的細(xì)胞楊氏模量逐漸下降。然而，Hayashi等［34］的研究結(jié)果與之相反，他們發(fā)現(xiàn)與低懸臂受力閾值相比，較高的閾值所測得的細(xì)胞彈性模量更高。產(chǎn)生上述差異的原因尚不清楚，有待后續(xù)研究的進(jìn)一步探索。

雖然原子力顯微鏡對于單細(xì)胞機械性能的檢測通量極低，但極高的精度使其常被作為衡量其他高通量檢測方法的評估工具。

1.2 微吸管

微吸管技術(shù)使用一個內(nèi)徑小于被測細(xì)胞的微管，利用負(fù)壓將細(xì)胞吸入管內(nèi)，并記錄不同負(fù)壓下細(xì)胞進(jìn)入微管內(nèi)的長度（圖1b）。細(xì)胞進(jìn)入管內(nèi)的長度一般使用光學(xué)顯微鏡跟蹤測量，精度可達(dá)幾十納米。不同的管內(nèi)負(fù)壓（一般為1～1 000 Pa）可用于實現(xiàn)紅細(xì)胞［35］、腫瘤細(xì)胞［13，36-38］、干細(xì)胞［6］等不同細(xì)胞以及同種細(xì)胞中細(xì)胞骨架［39］、細(xì)胞核［6］等不同細(xì)胞組成的機械性能表征。

微吸管技術(shù)的測量精度可與原子力顯微鏡媲美，但其復(fù)雜的實驗操作要求實驗者具備熟練的操作技術(shù)。為簡化實驗操作，Shojaei-Baghini等［40］設(shè)計了一種基于自動微吸管技術(shù)的單細(xì)胞機械性能表征系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用基于視覺的位置控制系統(tǒng)，操縱微管接近細(xì)胞，并將細(xì)胞吸入微管中，實現(xiàn)細(xì)胞彈性、粘彈性及黏度的定量分析。此外，新興微流控技術(shù)的引入使得基于微吸管技術(shù)原理的單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)的實驗操作方式獲得極大簡化，同時在一定程度上克服了傳統(tǒng)微吸管技術(shù)中因蒸發(fā)損失導(dǎo)致的吸入壓力基線漂移問題［22］。Davidson等［41］設(shè)計的基于微吸管原理的微流體裝置可以同時測量多個細(xì)胞（圖2a）。通過控制3個出口端的壓強，該裝置允許快速加載和清洗細(xì)胞，并將大顆?；蚣?xì)胞團簇造成的堵塞最小化。然而，由于芯片不同，并行流道內(nèi)細(xì)胞受到的壓力不同，一定程度上影響了檢測精度。為使并行測量中每一通路內(nèi)細(xì)胞所受壓力基本相同，Myrand-Lapierre等［37］設(shè)計出一種多路流體柱塞裝置，該裝置形成了自補償流體網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞在任何一個流道中承受的流道兩端壓差相同，不受其所在位置以及鄰近通路細(xì)胞的影響（圖2b）。

Fig.2 High throughput detection devices based on micropipette technology圖2基于微吸管技術(shù)的高通量檢測裝置

微吸管技術(shù)是一種可以替換原子力顯微鏡的單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)。相比于原子力顯微鏡適于測量黏附細(xì)胞的局部力學(xué)特性，微吸管技術(shù)多被用于測量懸浮細(xì)胞的全細(xì)胞機械響應(yīng)［42］。此外，在微吸管技術(shù)中，細(xì)胞往往在同一位置同一受力下變形數(shù)秒到數(shù)分鐘，故可實現(xiàn)細(xì)胞長期受載時的粘彈性與蠕變特性的測量。

1.3 光鑷與光學(xué)拉伸

光鑷最初由Ashkin等［43］提出，該技術(shù)利用高度聚焦的激光束創(chuàng)建三維光梯度，使細(xì)胞受到光子沖擊產(chǎn)生的散射力和由場強梯度誘導(dǎo)的梯度力，其中細(xì)胞所受的散射力和梯度力取決于激光波長（λ）和粒子半徑（r）［44］（圖1c）。利用光鑷技術(shù)，F(xiàn)oo等［45］測量了脂質(zhì)體在恒定溫度下，以不同流速突然停止運動所引起的隨時間變化的形狀改變和恢復(fù)；Titushkin等［24］研究了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和分化成纖維細(xì)胞的膜力學(xué)特性。光鑷施加于細(xì)胞的力一般不足以使有核細(xì)胞產(chǎn)生大變形，因而多用于細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的機械性能檢測。

光學(xué)拉伸是一種基于光鑷原理的單細(xì)胞機械性能檢測方法，當(dāng)一個細(xì)胞被置于非聚焦的兩相對激光束之間時，作用在該細(xì)胞上的總力為零（任何沿著光束移動的細(xì)胞受凈散射力作用回到中心，而任何遠(yuǎn)離光束軸線的細(xì)胞在指向光束中心的梯度力作用下回到中心［46］），但相加的表面力將導(dǎo)致該細(xì)胞沿激光束的軸線被拉伸［23，44］（圖1d）。相比于光鑷，光學(xué)拉伸作用于細(xì)胞上的力可達(dá)數(shù)納牛，能夠使大多數(shù)有核細(xì)胞發(fā)生全細(xì)胞變形。光學(xué)拉伸常用的激光波長一般為1 064 nm［47-48］，激光功率在數(shù)毫瓦至1.5瓦［49］，更大的激光功率可以使細(xì)胞產(chǎn)生更大的變形，但高強度激光可能會損傷細(xì)胞。

與微吸管技術(shù)相似，由于光鑷與光學(xué)拉伸中的細(xì)胞懸浮于溶液中，因而更容易與微流控方法相結(jié)合以提高檢測通量。Morawetz等［50］開發(fā)了一種新型流式光學(xué)拉伸器，該裝置通過光力使整個細(xì)胞在連續(xù)流動中變形，避免了光學(xué)拉伸裝置中所需的細(xì)胞定位步驟（圖3a）。Yao等［51］通過將光鑷和微流控技術(shù)結(jié)合，展示了一種基于“捕獲-拖拽”機制的光流控細(xì)胞拉伸器。該器件利用高度聚焦的激光束生成光鑷以捕獲細(xì)胞，同時利用流動誘導(dǎo)的拽力對微流道中被捕獲的細(xì)胞進(jìn)行橫向拉伸。此外，他們利用一個頻率為2 Hz的斬波器阻斷光束，使被拉伸的細(xì)胞可隨流體從光鑷中釋放；當(dāng)光束再次被打開時，另一個流經(jīng)的細(xì)胞將會被捕獲（圖3b）。雖然與微流控結(jié)合可在一定程度上提高光學(xué)方法的檢測通量，但受限于技術(shù)本身的低應(yīng)變率，其檢測通量仍較低，約每分鐘數(shù)個細(xì)胞［51］。

與原子力顯微鏡和微吸管技術(shù)不同，光鑷或光學(xué)拉伸不需要與細(xì)胞進(jìn)行機械接觸，是一種非接觸測量方法，避免了接觸測量中潛在的干擾因素。

1.4 其他用于單細(xì)胞機械性能檢測的技術(shù)

除原子力顯微鏡、微吸管和光鑷與光學(xué)拉伸等典型傳統(tǒng)單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)外，聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)與磁鑷以及粒子追蹤微流變法等技術(shù)也被應(yīng)用于單細(xì)胞機械性能的檢測。

近年來，利用聲場在流道內(nèi)產(chǎn)生駐面聲波被用于測量細(xì)胞機械性能（圖1e）。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入微流道時，聲輻射力使細(xì)胞移動到聲壓節(jié)點，其移動速度取決于細(xì)胞可壓縮性［52］。利用細(xì)胞間有效聲阻抗值的差異，Augustsson等［53］對單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、BA-F3和MCF7細(xì)胞的機械性能進(jìn)行了表征。由于細(xì)胞向聲節(jié)點的遷移往往需要數(shù)秒鐘，故其檢測通量較低且其測量參數(shù)常需要轉(zhuǎn)化為傳統(tǒng)的粘彈性參數(shù)。

磁扭轉(zhuǎn)流變儀通過磁場對附著于細(xì)胞表面或內(nèi)部的磁化微珠進(jìn)行操控（圖1f）。附著特定受體的配體的鐵磁性微珠與細(xì)胞粘連并在某一方向上被磁化；再在垂直于磁化方向施加磁場使磁珠產(chǎn)生扭轉(zhuǎn)，從而對結(jié)合的細(xì)胞表面受體施加可控的作用力并量化磁珠旋轉(zhuǎn)角度。細(xì)胞的機械性能可以從施加于磁珠的扭矩與磁珠的旋轉(zhuǎn)角度中獲得。磁扭轉(zhuǎn)流變儀已被應(yīng)用于細(xì)胞膜［54］、細(xì)胞骨架［55-56］等細(xì)胞成分的動態(tài)機械響應(yīng)。磁鑷的工作原理與磁扭轉(zhuǎn)流變儀相似，也常被用來測量細(xì)胞的機械特性［57-58］。磁扭轉(zhuǎn)與磁鑷適于測量在細(xì)胞內(nèi)部組織的機械性能，但受限于施加在磁珠上的力較?。╬N），使其多用于測量細(xì)胞的局部機械性能而難以評估細(xì)胞整體機械性能。

在粒子追蹤微流變中，直徑小于1 μm的熒光珠被直接注射到活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這些熒光珠在細(xì)胞質(zhì)中迅速分散，隨后熒光顯微鏡跟蹤這些熒光珠的運動軌跡，從而評估細(xì)胞的力學(xué)特性［59］（圖1g）。粒子追蹤微流變是一種被動測量單細(xì)胞機械性能的方法，可對處于復(fù)雜環(huán)境中（如三維基質(zhì)與體內(nèi)）的細(xì)胞進(jìn)行機械性能檢測［60］。

Fig.3 Detection of mechanical properties of cells based on optical tweezers and stretcher圖3基于光鑷與光學(xué)拉伸的細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)

2 單細(xì)胞機械性能檢測的高通量方法

傳統(tǒng)的單細(xì)胞分析技術(shù)在面對大量樣本時難以快速獲得樣本的檢測數(shù)據(jù)。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，基于微流控技術(shù)的流式檢測方法不斷出現(xiàn)，使單細(xì)胞機械性能檢測的通量呈幾何式增長。接下來，本文將從細(xì)胞受力方式的角度對不同的微流控變形性細(xì)胞術(shù)（deformability cytometry，DC）進(jìn)行介紹，具體包括：細(xì)胞過孔受迫擠壓、剪切誘導(dǎo)變形以及拉伸誘導(dǎo)變形。

2.1 細(xì)胞過孔

測量細(xì)胞過孔時物理參數(shù)的機械性能檢測方法最先在微流控領(lǐng)域得到應(yīng)用。該技術(shù)（圖1h）通過驅(qū)動懸浮液中的細(xì)胞穿過一個比其自身直徑略小的狹窄流道，當(dāng)細(xì)胞在狹窄流道內(nèi)運動時，由于細(xì)胞抵抗流道壁擠壓變形的能力不同，其通過時間（細(xì)胞通過狹窄流道的時間）［7，61-64］、進(jìn)入時間（細(xì)胞由接觸入口到完全進(jìn)入狹窄流道的時間）［12，65］、通過 速 度［19，27，66］、細(xì) 胞 形 態(tài)［5，67-68］、馳 豫 時 間（離開狹窄流道后細(xì)胞恢復(fù)初始形態(tài)的時間）［69-70］及流體壓降［71-72］等物理參數(shù)各不相同。通過分析這些參數(shù)，研究者可確定細(xì)胞的變形性［5，9，73］、彈性［74-75］及粘彈性［76-78］等機械性能。

目前細(xì)胞過孔時的數(shù)據(jù)獲取方式主要有兩種：一是通過高速攝像機捕獲細(xì)胞圖像，二是在檢測流道區(qū)域布置電極獲得電信號。Hou等［12］利用高速攝像機拍攝到的細(xì)胞圖像獲得了細(xì)胞的進(jìn)入時間，并計算出細(xì)胞截面投影的長短軸之比，成功區(qū)分了人正常乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）與人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）。Adamo等［61］在狹窄流道的兩端布置電極，當(dāng)細(xì)胞穿過收縮區(qū)時，兩側(cè)電極之間的電阻值發(fā)生變化（圖4a）。通過比較電阻值峰寬，即細(xì)胞的通過時間，可以得到不同細(xì)胞的變形能力。利用這一方法，該課題組實現(xiàn)了正常HeLa細(xì)胞、經(jīng)微絲解聚劑處理的HeLa細(xì)胞和經(jīng)細(xì)胞松弛素B處理的HeLa細(xì)胞的鑒別。

細(xì)胞在通過狹窄流道時，變形的細(xì)胞膜與流道壁之間存在摩擦力，并影響細(xì)胞的通過時間、通過速度等參數(shù)，而摩擦力的大小與細(xì)胞機械性能有關(guān)。Gabriele等［2］發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞與流道壁面的摩擦力受到細(xì)胞硬度的影響，較硬細(xì)胞的膜與壁面之間的作用力更大，摩擦力更高，從而導(dǎo)致不同硬度白細(xì)胞的通過速度不同。為盡可能減小摩擦力的影響，直接考察細(xì)胞受迫變形能力，Walter等［79］提出一種直接量化狹窄流道內(nèi)細(xì)胞變形能力的方法來研究紅細(xì)胞變形時的力學(xué)響應(yīng)。通過在狹窄流道處設(shè)置懸臂式彈性微瓣作為變形傳感器，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過流道并被壓縮時，高速攝像機將記錄彈性微瓣的撓度及細(xì)胞的變形（圖4b）。

除細(xì)胞膜與流道壁面間的摩擦力外，細(xì)胞兩側(cè)的流體壓降以及細(xì)胞大小等因素也會影響測量結(jié)果。細(xì)胞通過狹窄流道時造成的壓降對于準(zhǔn)確獲得細(xì)胞力學(xué)參數(shù)十分重要，更大的壓降導(dǎo)致更短的細(xì)胞過孔時間。然而，直接測量細(xì)胞兩側(cè)的流體壓力十分困難，為此，Khan等［71］設(shè)計了一對完全相同的平行狹窄流道，兩平行流道的入口分離，出口聯(lián)通。當(dāng)上流道有細(xì)胞經(jīng)過時，出口處聯(lián)通區(qū)域的兩種不同液體之間的界面由于壓差而產(chǎn)生偏移（圖4c）。通過對界面偏移量的分析，得到細(xì)胞通過流道時的壓降。多數(shù)微流控芯片中的狹窄流道尺寸單一，難以實現(xiàn)尺寸差異較大細(xì)胞群體的精確檢測。Raj等［75］設(shè)計了一種包含多個不同尺寸的平行微收縮流道器件，實現(xiàn)了在單個器件上同時表征具有較大尺寸差異的細(xì)胞機械性能（圖4d）。

Fig.4 Different detection methods of micro-constriction圖4細(xì)胞過孔的不同檢測方式

雖然細(xì)胞的進(jìn)入時間、通過時間、通過速度等參數(shù)可以作為區(qū)分不同變形性細(xì)胞的間接衡量指標(biāo)，但僅通過這些指標(biāo)的測量難以量化細(xì)胞的楊氏模量、剪切模量、冪律指數(shù)等機械性能參數(shù)。為獲得細(xì)胞的具體機械性能參數(shù)值，諸多理論模型被應(yīng)用于分析實驗數(shù)據(jù)。Luo等［74］在二維平面中采用不可壓縮新胡克粘超彈性固體（neo-Hookean visco-hyperelastic solid）模擬生物細(xì)胞，觀察其進(jìn)入收縮流道的過程，并采用庫侖定律模擬了細(xì)胞與固體壁間的摩擦。通過將實驗數(shù)據(jù)代入數(shù)值模擬結(jié)果，得到了相應(yīng)的擬合公式，并計算出細(xì)胞瞬時楊氏模量。Ye等［80］使用光滑耗散粒子動力學(xué)研究了細(xì)胞通過時間和機械性能之間的關(guān)系。通過分析模擬數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出了3種關(guān)于細(xì)胞通過時間的表達(dá)式，分別對應(yīng)于狹窄流道尺寸、細(xì)胞剪切模量和彎曲模量。

細(xì)胞檢測精度一直是研究者所關(guān)注的重要問題，部分研究者希望通過引進(jìn)先進(jìn)的精準(zhǔn)測量方法以提高測量精度。Byun等［27］制造出帶有狹窄流道的懸浮微通道諧振器，通過激光束的偏轉(zhuǎn)來檢測諧振頻率（圖5a）。該方法采用增益控制振蕩器電路連續(xù)跟蹤單個細(xì)胞流過狹窄流道時懸臂諧振頻率的變化，從而得到有關(guān)細(xì)胞進(jìn)入狹窄流道和通過狹窄流道的信息，進(jìn)而對具有不同物理特性的細(xì)胞系（如兩種不同的人肺腺癌細(xì)胞HCC827與H1975）實現(xiàn)有效區(qū)分。Yang等［81］設(shè)計了一種具有一對平行多段狹窄流道的芯片，該芯片流道兩邊布置了自對準(zhǔn)3D電極對細(xì)胞進(jìn)行差分電阻抗測量（圖5b）。當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)其中一個流道時，與之接觸的兩個電極測量單細(xì)胞阻抗，而另一對電極則測量介質(zhì)阻抗，進(jìn)而形成差分測量以消除介質(zhì)電導(dǎo)率波動和共模漂移對信號的影響，使細(xì)胞通過流道時測得的阻抗變化更為精準(zhǔn)，從而獲得更為準(zhǔn)確的細(xì)胞機械性能［82］。

多參量檢測與機器學(xué)習(xí)的結(jié)合亦是提高檢測精度的重要趨勢。Nyberg等［83］使用高通量變形細(xì)胞儀（quantitative deformability cytometry，q-DC）測量了細(xì)胞的6種物理表型，包括彈性模量、細(xì)胞流動性、通過時間、進(jìn)入時間、細(xì)胞尺寸和最大應(yīng)變，借助K鄰接機器學(xué)習(xí)算法訓(xùn)練已知數(shù)據(jù)集，并將訓(xùn)練結(jié)果應(yīng)用于未知實驗數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了對目標(biāo)細(xì)胞的精準(zhǔn)識別。Apichitsopa等［84］將兩種單細(xì)胞機械性能檢測方法集成在同一平臺上，并使用基于圖像的細(xì)胞跟蹤將所有測量參數(shù)與細(xì)胞對應(yīng)，同時得到尺寸、變形性（通過時間）和3種頻率下的極化率等細(xì)胞內(nèi)在屬性（圖5c）。

為進(jìn)一步提高檢測通量，Lange等［77］設(shè)計了一種集成8個平行流道的微流控芯片，基于圖像方法表征人紅白血病細(xì)胞系K562和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的進(jìn)入時間及形態(tài)變化，檢測通量高達(dá)160 cells/min（圖5d）。然而，受顯微鏡鏡視場的限制，利用顯微鏡捕獲變形細(xì)胞圖像的方法不能無限增加并行流道數(shù)。Ren等［85］設(shè)計了一種基于阻抗譜檢測的芯片，該芯片包含4個并行流道，其中每個流道包括2個由突擴腔分隔的狹窄流道（圖5e）。雖然四流道的并行集成所提升的通量較小，但由于電學(xué)測量方法不受觀測區(qū)域的限制，有望大規(guī)模并行集成，從而極大提高整體通量。

利用高速攝像機或電阻抗技術(shù)測量細(xì)胞通過小于其自身直徑的狹窄流道時，各種物理參數(shù)的差異可以很好地區(qū)分不同變形性的細(xì)胞，同時結(jié)合數(shù)值模型可以得到細(xì)胞的楊氏模量、冪律指數(shù)等機械性能參數(shù)值。由于涉及到細(xì)胞與流道壁的物理接觸，這種方法適合用于研究在微循環(huán)等過程中細(xì)胞的摩擦或滯留。然而，該類技術(shù)往往對細(xì)胞尺寸十分敏感，其檢測流道必須與被測細(xì)胞大小相匹配，細(xì)胞過大或過小都會造成測量結(jié)果的偏差。因此，該類技術(shù)往往適用于細(xì)胞尺寸較為均一的細(xì)胞群體。此外，由于其檢測流道尺寸小于細(xì)胞，實驗過程中易造成流道堵塞。

2.2 剪切流誘導(dǎo)變形

細(xì)胞在流體作用下的剪切變形是一種高通量非接觸的單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)（圖1i）。細(xì)胞在經(jīng)過一個比其自身直徑略大的微流道時，由于流道截面的流體速度呈拋物線分布，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的剪切力以及流體正壓力作用于細(xì)胞，使細(xì)胞產(chǎn)生變形。細(xì)胞的變形圖像一般通過高速攝像機捕獲，以獲得細(xì)胞變形指數(shù)（1-4πA/C2，其中A為細(xì)胞投影面積、C為細(xì)胞投影周長［26，86-88］；b/a或(b-a)/(b+a)，其中b為細(xì)胞變形后投影截面的長軸尺寸、a為短軸尺寸［89-91］；）、形狀恢復(fù)過程［91-92］、熒光強度［11，93-94］等信息?；讷@得的數(shù)據(jù)，結(jié)合理論研究與數(shù)據(jù)分析，研究者能夠獲得細(xì)胞的各種力學(xué)參數(shù)［95-98］，甚至是生物學(xué)特征［93-94］。

Fig.5 High precision and high throughput detection of micro-constriction圖5細(xì)胞過孔的高精度與高通量檢測

細(xì)胞剪切變形作為一種非接觸的水動力變形方法，相比于細(xì)胞過孔，檢測通量得到進(jìn)一步提升。Zheng等［91］在截面尺寸為8 μm×8 μm的流道兩側(cè)通入相同流量的鞘液，使中間樣品液中紅細(xì)胞穩(wěn)定在流道中心并對其施加剪切力（圖6a）。利用高速攝像機捕獲紅細(xì)胞的動態(tài)變形過程，量化了紅細(xì)胞圓度（4πA/C2）、變形指數(shù)（a/b）、形狀恢復(fù)速率（變形指數(shù)與時間的指數(shù)擬合）等多個參數(shù)，實現(xiàn)了超過300個紅細(xì)胞/min的表征。然而，由于檢測過程中所獲得的大量數(shù)據(jù)需要后期處理，降低了整個系統(tǒng)的實際通量。為此，Otto等［26］開發(fā)了一種實時變形性細(xì)胞術(shù)（real-time deformability cytometry，RT-DC），利用在線圖像分析算法，實現(xiàn)細(xì)胞變形性的實時表征，使系統(tǒng)實際通量達(dá)到了6 000 cells/min以上（圖6b）。

實時變形性細(xì)胞術(shù)所檢測到的細(xì)胞機械性能不僅與細(xì)胞自身硬度有關(guān)，同時也會受到細(xì)胞尺寸的影響。為了解釋細(xì)胞尺寸與細(xì)胞變形能力之間的關(guān)系，Mietke等［95］利用斯托克斯方程求解一個圓柱微流道內(nèi)球形物體周圍的流場以得到作用于球形物體表面的應(yīng)力，進(jìn)而將其作為邊界條件并結(jié)合線彈性理論量化彈性球體表面的位移場，成功解釋了細(xì)胞尺寸對于細(xì)胞變形性的影響。但由于該模型忽略了細(xì)胞變形后產(chǎn)生的形狀改變與周圍流體間的相互作用，因而僅適用于較小的細(xì)胞變形量。為進(jìn)一步擴大數(shù)值模型對于細(xì)胞剪切變形的適用范圍，并探討細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞膜對細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)的影響，Mokbel等［96］將細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)表示為粘彈性材料，而細(xì)胞膜被表示為受彎曲剛度和表面張力影響的薄殼皮層，使模型對于細(xì)胞的大變形依然適用。

實際應(yīng)用中常常需要對多個樣本進(jìn)行同時分析，如在藥物篩選中需要對大量經(jīng)過不同方式處理的樣本進(jìn)行測試。為滿足實際應(yīng)用中的多樣本分析需求，Ahmmed等［87］結(jié)合分離的并行微流道陣列，開發(fā)了一種多樣本變形性細(xì)胞術(shù)（multi-sample deformability cytometry，MS-DC），實現(xiàn)了對多個樣本中細(xì)胞剪切誘導(dǎo)變形的檢測（圖6c）。

實驗中流體速度在一定程度上影響著細(xì)胞機械性能的檢測精度，不同的流速下細(xì)胞受到的力不同，導(dǎo)致同等變形能力的細(xì)胞變形程度不同，從而干擾細(xì)胞機械性能的測量。由于難以直接測量流速，Saadat等［99］通過兩次數(shù)值模擬構(gòu)建了流道中細(xì)胞運動速度與流體流速之間的關(guān)系，從而由細(xì)胞運動速度得到流速。

Fig.6 The schematic of microfluidic shear-induced deformation chip structure圖6微流控剪切誘導(dǎo)變形芯片結(jié)構(gòu)示意圖

為進(jìn)一步將細(xì)胞的機械性能與細(xì)胞分子特異性相關(guān)聯(lián)，Rosendahl等［93］將熒光成像技術(shù)引入實時細(xì)胞變形性檢測，設(shè)計了實時熒光和變形性細(xì)胞術(shù)（real-time fluorescence and deformability cytometry，RT-FDC）（圖6d）?；讷@得的熒光信號以及形變數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了對果蠅Kc167細(xì)胞系不同有絲分裂階段的有效鑒別。為進(jìn)一步提高分類準(zhǔn)確率，Nawaz等［94］應(yīng)用深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)處理實驗數(shù)據(jù)，對紅細(xì)胞缺失血液中的中性粒細(xì)胞進(jìn)行實時分選，分選純度達(dá)到89.7%，表達(dá)CD66+/CD14-的細(xì)胞被富集10倍。

基于流體剪切力誘導(dǎo)細(xì)胞變形的微流控細(xì)胞機械性能檢測方法可以達(dá)到數(shù)千cells/min的極高通量。雖然相比于細(xì)胞擠壓變形，剪切誘導(dǎo)變形受細(xì)胞尺寸的影響較小，但由于流場中作用于細(xì)胞的應(yīng)力場會受到細(xì)胞尺寸與形狀的影響，導(dǎo)致參數(shù)測量存在誤差，因而需要準(zhǔn)確的建模方法來校準(zhǔn)流道中的流場，以獲得更準(zhǔn)確的細(xì)胞機械性能參數(shù)。

2.3 拉伸流誘導(dǎo)變形

除剪切流誘導(dǎo)細(xì)胞變形的高通量非接觸檢測技術(shù)外，另一種檢測方法采用拉伸流使細(xì)胞產(chǎn)生軸向拉伸。該技術(shù)利用兩股相同的流體在十字形流道處匯聚形成的拉伸流場對細(xì)胞施加拉應(yīng)力，細(xì)胞在拉應(yīng)力的作用下沿流場方向拉伸（圖1j）。

與剪切力主導(dǎo)的水動力變形方法相比，拉應(yīng)力主導(dǎo)的細(xì)胞變形方式由于流道內(nèi)流速更高，因而其通量得到進(jìn)一步提升。Gossett等［25］設(shè)計的檢測芯片利用兩側(cè)的蛇形流道使細(xì)胞慣性聚焦形成一列，并逐一進(jìn)入?yún)R聚點處的拉伸流場（圖7a）。細(xì)胞在拉伸流場中產(chǎn)生的變形被高速攝像機記錄并量化細(xì)胞初始直徑與變形量。在不考慮后期圖像處理的情況下，該方法能夠以超過十萬cells/min的速率獲得細(xì)胞的原始圖像數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上，Dudani等［100］對流道結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，采用液壓回路設(shè)計對細(xì)胞所受拉應(yīng)力進(jìn)行優(yōu)化。細(xì)胞進(jìn)入流道后首先經(jīng)過蛇形聚焦流道，之后流道分為3股，細(xì)胞由中間流道向下游運動，而兩側(cè)流體形成高速夾流，在下游垂直匯入中間流道，對細(xì)胞進(jìn)行拉伸（圖7b）。這種方式避免了細(xì)胞長時間停留在拉伸流場，將檢測通量提高到近4百萬cells/min。

Fig.7 The schematic of microfluidic stretch-induced deformation chip structure圖7微流控拉伸誘導(dǎo)變形芯片結(jié)構(gòu)示意圖

雖然利用慣性微流控的蛇形流道聚焦可以將細(xì)胞排列至流道寬度方向的單一位置，但細(xì)胞在流道高度方向上并未實現(xiàn)單一位置聚焦，導(dǎo)致顯微成像系統(tǒng)不能獲得高質(zhì)量的細(xì)胞圖像且細(xì)胞受力不均。為克服上述問題，Cha等［101］引入黏彈性微流控技術(shù)，黏彈性液體中細(xì)胞在慣性力和彈性力的協(xié)同作用下在流道截面中心實現(xiàn)三維聚焦（圖7c）。除利用黏彈性溶液對細(xì)胞進(jìn)行三維聚焦外，Deng等［102］提出一種直流道中均布著一系列垂直排列的矩形障礙物的芯片結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了慣性流下的細(xì)胞三維聚焦。在慣性升力的作用下，每個障礙物產(chǎn)生一對螺旋二次流，將細(xì)胞引導(dǎo)到一個單一的平衡位置（圖7d）。

除細(xì)胞在特定時刻特定位置的變形外，細(xì)胞的動態(tài)變形過程亦包含了大量信息。Masaeli等［103］從細(xì)胞在微流體拉伸流場中變形的過程中提取出15個生物物理參數(shù)（包括細(xì)胞的尺寸和應(yīng)變、基于時間的變形和細(xì)胞形態(tài)學(xué)等），應(yīng)用機器學(xué)習(xí)方法處理15維數(shù)據(jù)集，該技術(shù)可以對單個細(xì)胞進(jìn)行精確的分類，準(zhǔn)確率超過95%。

相比于流體剪切力主導(dǎo)的細(xì)胞變形，細(xì)胞在十字形流道中受到的應(yīng)力更大。Armistead等［104］通過調(diào)整流體黏度及流速，分別測試了剪切主導(dǎo)與拉伸主導(dǎo)下的細(xì)胞變形。研究結(jié)果表明，與高黏度、低流速的環(huán)境相比，細(xì)胞在低黏度、高流速測得的硬度更高。Urbanska等［105］對于兩者的比較研究亦證明了上述研究結(jié)論。這一差異產(chǎn)生的可能原因是低應(yīng)變下細(xì)胞骨架主導(dǎo)了細(xì)胞的變形性，而當(dāng)細(xì)胞承受高應(yīng)變時，更硬的細(xì)胞核主導(dǎo)了細(xì)胞的力學(xué)響應(yīng)［19］。

雖然該方法的檢測通量是目前微流控單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)中最高的，但高流速下對于細(xì)胞的運動捕捉需要高性能的高速攝像機和大量的數(shù)據(jù)后處理，檢測成本較高。

3 結(jié)論與展望

細(xì)胞機械性能與細(xì)胞生理功能之間有著緊密的聯(lián)系，細(xì)胞遷移、分裂與分化等重要的生物過程以及許多疾病的發(fā)生與發(fā)展都伴隨著細(xì)胞機械性能的改變。傳統(tǒng)的單細(xì)胞機械性能檢測技術(shù)的通量與流式細(xì)胞術(shù)相比非常低，使其難以在大量異質(zhì)細(xì)胞中識別出少數(shù)感興趣的稀有細(xì)胞，如在癌癥病人的外周血液中尋找稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞。近年來發(fā)展起來的微流控技術(shù)給這一問題提供了解決方案，一些微流控機械性能檢測技術(shù)的通量達(dá)到甚至超過了流式細(xì)胞術(shù)。然而，這些新興技術(shù)仍面臨著諸多問題亟待解決。例如，各種方法的檢測結(jié)果存在較大差異，甚至同一類型的細(xì)胞使用不同方法測得的細(xì)胞力學(xué)參數(shù)亦相差甚遠(yuǎn)。此外，需要昂貴的設(shè)備與復(fù)雜的操作亦是微流控機械性能檢測技術(shù)走向應(yīng)用所需解決的問題。

未來單細(xì)胞機械性能的檢測勢必會向著高通量、自動化及集成化等方向發(fā)展以滿足不同應(yīng)用場景的需求。高通量對于臨床中疾病的快速篩查和診斷具有非常重要的作用，特別是當(dāng)樣本細(xì)胞數(shù)量非常龐大，達(dá)到數(shù)萬甚至數(shù)百萬個細(xì)胞時，高通量的處理方法可以在短時間內(nèi)得獲得樣本的測試結(jié)果，以避免細(xì)胞在測量過程中發(fā)生潛在特性改變?？s減檢測過程中人工操作，實現(xiàn)檢測過程的自動化不僅可以省去在人員培訓(xùn)中所耗費的大量時間，同時也可避免檢測過程中可能存在的各種人為誤差。檢測設(shè)備的小型化與集成化是這些檢測方法實現(xiàn)市場化應(yīng)用需要解決的重要問題之一。

除了細(xì)胞機械性能檢測本身外，細(xì)胞在水動力作用下的變形亦有了新的應(yīng)用方向。已有研究證明，細(xì)胞的大變形伴隨著細(xì)胞表面順態(tài)孔的出現(xiàn)，使加入細(xì)胞懸液的合成生物分子或功能性納米材料通過擴散與溶液交換將這些物質(zhì)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部［106-109］。相比于傳統(tǒng)的電穿孔、脂肪分離或病毒傳導(dǎo)，這種方式成本更低、操作更簡單［110］。

本文介紹了6種單細(xì)胞機械性能檢測方法的物理原理及最新研究進(jìn)展，闡明了每種測量方法的優(yōu)缺點。未來，期望通過這些技術(shù)的不斷改進(jìn)與完善，使其廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)及臨床診斷等領(lǐng)域，為疾病診斷和生物學(xué)研究提供新的工具手段。