單細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法與應(yīng)用研究進(jìn)展*

張孝哲 項(xiàng)楠倪中華

（東南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計(jì)與制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211189）

理解細(xì)胞的生物化學(xué)和機(jī)械力學(xué)性能是生物物理、醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。近年來，細(xì)胞的機(jī)械性能被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能直接相關(guān)。人體在患病后，體內(nèi)部分細(xì)胞的細(xì)胞膜［1］、細(xì)胞骨架［2-4］和細(xì)胞核［5-6］等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)械性能改變。例如，研究發(fā)現(xiàn)，人體在感染瘧疾或患鐮刀型貧血癥后，體內(nèi)紅細(xì)胞硬度高于正常紅細(xì)胞，導(dǎo)致其穿越血管壁受阻［7-9］。另有研究表明，紅細(xì)胞在長期存儲(chǔ)過程中的硬度亦會(huì)略有提升［10］，且在不同存儲(chǔ)條件下呈現(xiàn)不同程度的改變［11］。癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程通常也伴隨著細(xì)胞機(jī)械性能的改變，如乳腺癌［12-13］、肺癌［14］、前列腺癌［15-16］等癌細(xì)胞比相對(duì)應(yīng)的良性細(xì)胞表現(xiàn)出更高的變形性與彈性，甚至細(xì)胞在癌癥的不同發(fā)展進(jìn)程中也表現(xiàn)出硬度、變形性等性質(zhì)的差異［3，17］，而這些特性往往與腫瘤的轉(zhuǎn)移性和侵襲性有關(guān)［18-20］。

近年來，研究者們開發(fā)了多種單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)（圖1），基于細(xì)胞機(jī)械性能的差異實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞的鑒別，并研究細(xì)胞機(jī)械性能與其生物學(xué)特性之間的關(guān)系。早期典型單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)包括：原子力顯微鏡［21］、微吸管技術(shù)［22］和光鑷與光學(xué)拉伸［23-24］，這些技術(shù)對(duì)于細(xì)胞機(jī)械性能的表征都具有非常高的精度。然而，這些技術(shù)的檢測通量相對(duì)較低（一般低于1 cell/min）。此外，亦有其他技術(shù)被應(yīng)用于單細(xì)胞機(jī)械性能的檢測，如聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)流變儀與磁鑷和粒子追蹤微流變法。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，研究人員基于微流控方法開發(fā)出多種新興的高通量單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)，如利用流體拉伸［25］或剪切細(xì)胞［26］以及使細(xì)胞過孔擠壓變形［27］，其通量一般可達(dá)數(shù)百至數(shù)千cells/min，甚至上百萬cells/min。

本文首先介紹了目前單細(xì)胞機(jī)械性能檢測領(lǐng)域經(jīng)典的檢測技術(shù)，闡述了原子力顯微鏡、微吸管技術(shù)和光鑷與光學(xué)拉伸的檢測原理及最新研究進(jìn)展并簡要概述了聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)流變儀與磁鑷以及粒子追蹤微流變法。之后，本文從細(xì)胞受力方式的角度介紹了近10年來發(fā)展迅猛的微流控高通量檢測技術(shù)。最后，本文對(duì)單細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法未來的研究與發(fā)展方向進(jìn)行了探討。

Fig.1 Technologies for the detection of single cell mechanical properties圖1單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)

1 傳統(tǒng)單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)

隨著細(xì)胞機(jī)械性能在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上表現(xiàn)出越來越重要的作用，細(xì)胞的機(jī)械性能受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。由于細(xì)胞的異質(zhì)性，單細(xì)胞的檢測相比于細(xì)胞群的檢測，在獲取稀有目標(biāo)細(xì)胞機(jī)械性能時(shí)具有更大的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的單細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法主要包括：原子力顯微鏡、微吸管技術(shù)和光鑷與光學(xué)拉伸；此外，聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)流變儀與磁鑷以及粒子追蹤微流變法也被用于單細(xì)胞機(jī)械性能的檢測。

1.1 原子力顯微鏡

壓痕實(shí)驗(yàn)是檢測材料機(jī)械性能最常用的方法之一，可以給出材料廣泛的機(jī)械力學(xué)參數(shù)，如彈性、粘彈性，甚至是動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性。細(xì)胞作為一種生物材料，壓痕實(shí)驗(yàn)亦是單細(xì)胞機(jī)械性能檢測的重要方法。自1986年原子力顯微鏡被Binnig等［21］提出，原子力顯微鏡的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大［28-29］。由于原子力顯微鏡不依賴于樣品表面的電導(dǎo)率，適用于各種實(shí)驗(yàn)樣品及環(huán)境，Radmacher等［30］提出將其用于測量細(xì)胞機(jī)械性能，并應(yīng)用力學(xué)中經(jīng)典的梁理論來確定細(xì)胞的力學(xué)參數(shù)。

原子力顯微鏡的工作原理是基于掃描隧道顯微鏡與針形輪廓儀的結(jié)合。測量細(xì)胞的力學(xué)特性時(shí)，原子力顯微鏡執(zhí)行端的彈性懸臂（一般由硅微制造而成，彈簧常數(shù)一般在0.02～0.08 N/m之間［31］）受預(yù)設(shè)程序控制下壓（圖1a）。彈性懸臂前端附著有與細(xì)胞接觸的探針，其外形一般為球形、金字塔形和錐形。其中球形尖端與細(xì)胞有更大的接觸面積和更低的局部應(yīng)變，受細(xì)胞局部力學(xué)響應(yīng)的影響較小，在全細(xì)胞機(jī)械性能的測量中具有明顯的優(yōu)勢［32］。通常尖端所造成的細(xì)胞壓痕深度一般不超過細(xì)胞高度的15%。當(dāng)壓痕深度接近或大于尖端高度時(shí)，除了懸臂末端附著的探針與細(xì)胞接觸外，懸臂的底部還可能與細(xì)胞接觸，導(dǎo)致測量的細(xì)胞彈性高于實(shí)際值［32］。Pogoda等［33］對(duì)成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞的力學(xué)特性分析結(jié)果表明：當(dāng)壓痕深度增加時(shí)，測得的細(xì)胞楊氏模量逐漸下降。然而，Hayashi等［34］的研究結(jié)果與之相反，他們發(fā)現(xiàn)與低懸臂受力閾值相比，較高的閾值所測得的細(xì)胞彈性模量更高。產(chǎn)生上述差異的原因尚不清楚，有待后續(xù)研究的進(jìn)一步探索。

雖然原子力顯微鏡對(duì)于單細(xì)胞機(jī)械性能的檢測通量極低，但極高的精度使其常被作為衡量其他高通量檢測方法的評(píng)估工具。

1.2 微吸管

微吸管技術(shù)使用一個(gè)內(nèi)徑小于被測細(xì)胞的微管，利用負(fù)壓將細(xì)胞吸入管內(nèi)，并記錄不同負(fù)壓下細(xì)胞進(jìn)入微管內(nèi)的長度（圖1b）。細(xì)胞進(jìn)入管內(nèi)的長度一般使用光學(xué)顯微鏡跟蹤測量，精度可達(dá)幾十納米。不同的管內(nèi)負(fù)壓（一般為1～1 000 Pa）可用于實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞［35］、腫瘤細(xì)胞［13，36-38］、干細(xì)胞［6］等不同細(xì)胞以及同種細(xì)胞中細(xì)胞骨架［39］、細(xì)胞核［6］等不同細(xì)胞組成的機(jī)械性能表征。

微吸管技術(shù)的測量精度可與原子力顯微鏡媲美，但其復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作要求實(shí)驗(yàn)者具備熟練的操作技術(shù)。為簡化實(shí)驗(yàn)操作，Shojaei-Baghini等［40］設(shè)計(jì)了一種基于自動(dòng)微吸管技術(shù)的單細(xì)胞機(jī)械性能表征系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用基于視覺的位置控制系統(tǒng)，操縱微管接近細(xì)胞，并將細(xì)胞吸入微管中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞彈性、粘彈性及黏度的定量分析。此外，新興微流控技術(shù)的引入使得基于微吸管技術(shù)原理的單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作方式獲得極大簡化，同時(shí)在一定程度上克服了傳統(tǒng)微吸管技術(shù)中因蒸發(fā)損失導(dǎo)致的吸入壓力基線漂移問題［22］。Davidson等［41］設(shè)計(jì)的基于微吸管原理的微流體裝置可以同時(shí)測量多個(gè)細(xì)胞（圖2a）。通過控制3個(gè)出口端的壓強(qiáng)，該裝置允許快速加載和清洗細(xì)胞，并將大顆粒或細(xì)胞團(tuán)簇造成的堵塞最小化。然而，由于芯片不同，并行流道內(nèi)細(xì)胞受到的壓力不同，一定程度上影響了檢測精度。為使并行測量中每一通路內(nèi)細(xì)胞所受壓力基本相同，Myrand-Lapierre等［37］設(shè)計(jì)出一種多路流體柱塞裝置，該裝置形成了自補(bǔ)償流體網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞在任何一個(gè)流道中承受的流道兩端壓差相同，不受其所在位置以及鄰近通路細(xì)胞的影響（圖2b）。

Fig.2 High throughput detection devices based on micropipette technology圖2基于微吸管技術(shù)的高通量檢測裝置

微吸管技術(shù)是一種可以替換原子力顯微鏡的單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)。相比于原子力顯微鏡適于測量黏附細(xì)胞的局部力學(xué)特性，微吸管技術(shù)多被用于測量懸浮細(xì)胞的全細(xì)胞機(jī)械響應(yīng)［42］。此外，在微吸管技術(shù)中，細(xì)胞往往在同一位置同一受力下變形數(shù)秒到數(shù)分鐘，故可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞長期受載時(shí)的粘彈性與蠕變特性的測量。

1.3 光鑷與光學(xué)拉伸

光鑷最初由Ashkin等［43］提出，該技術(shù)利用高度聚焦的激光束創(chuàng)建三維光梯度，使細(xì)胞受到光子沖擊產(chǎn)生的散射力和由場強(qiáng)梯度誘導(dǎo)的梯度力，其中細(xì)胞所受的散射力和梯度力取決于激光波長（λ）和粒子半徑（r）［44］（圖1c）。利用光鑷技術(shù)，F(xiàn)oo等［45］測量了脂質(zhì)體在恒定溫度下，以不同流速突然停止運(yùn)動(dòng)所引起的隨時(shí)間變化的形狀改變和恢復(fù)；Titushkin等［24］研究了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和分化成纖維細(xì)胞的膜力學(xué)特性。光鑷施加于細(xì)胞的力一般不足以使有核細(xì)胞產(chǎn)生大變形，因而多用于細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的機(jī)械性能檢測。

光學(xué)拉伸是一種基于光鑷原理的單細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被置于非聚焦的兩相對(duì)激光束之間時(shí)，作用在該細(xì)胞上的總力為零（任何沿著光束移動(dòng)的細(xì)胞受凈散射力作用回到中心，而任何遠(yuǎn)離光束軸線的細(xì)胞在指向光束中心的梯度力作用下回到中心［46］），但相加的表面力將導(dǎo)致該細(xì)胞沿激光束的軸線被拉伸［23，44］（圖1d）。相比于光鑷，光學(xué)拉伸作用于細(xì)胞上的力可達(dá)數(shù)納牛，能夠使大多數(shù)有核細(xì)胞發(fā)生全細(xì)胞變形。光學(xué)拉伸常用的激光波長一般為1 064 nm［47-48］，激光功率在數(shù)毫瓦至1.5瓦［49］，更大的激光功率可以使細(xì)胞產(chǎn)生更大的變形，但高強(qiáng)度激光可能會(huì)損傷細(xì)胞。

與微吸管技術(shù)相似，由于光鑷與光學(xué)拉伸中的細(xì)胞懸浮于溶液中，因而更容易與微流控方法相結(jié)合以提高檢測通量。Morawetz等［50］開發(fā)了一種新型流式光學(xué)拉伸器，該裝置通過光力使整個(gè)細(xì)胞在連續(xù)流動(dòng)中變形，避免了光學(xué)拉伸裝置中所需的細(xì)胞定位步驟（圖3a）。Yao等［51］通過將光鑷和微流控技術(shù)結(jié)合，展示了一種基于“捕獲-拖拽”機(jī)制的光流控細(xì)胞拉伸器。該器件利用高度聚焦的激光束生成光鑷以捕獲細(xì)胞，同時(shí)利用流動(dòng)誘導(dǎo)的拽力對(duì)微流道中被捕獲的細(xì)胞進(jìn)行橫向拉伸。此外，他們利用一個(gè)頻率為2 Hz的斬波器阻斷光束，使被拉伸的細(xì)胞可隨流體從光鑷中釋放；當(dāng)光束再次被打開時(shí)，另一個(gè)流經(jīng)的細(xì)胞將會(huì)被捕獲（圖3b）。雖然與微流控結(jié)合可在一定程度上提高光學(xué)方法的檢測通量，但受限于技術(shù)本身的低應(yīng)變率，其檢測通量仍較低，約每分鐘數(shù)個(gè)細(xì)胞［51］。

與原子力顯微鏡和微吸管技術(shù)不同，光鑷或光學(xué)拉伸不需要與細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械接觸，是一種非接觸測量方法，避免了接觸測量中潛在的干擾因素。

1.4 其他用于單細(xì)胞機(jī)械性能檢測的技術(shù)

除原子力顯微鏡、微吸管和光鑷與光學(xué)拉伸等典型傳統(tǒng)單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)外，聲學(xué)方法、磁扭轉(zhuǎn)與磁鑷以及粒子追蹤微流變法等技術(shù)也被應(yīng)用于單細(xì)胞機(jī)械性能的檢測。

近年來，利用聲場在流道內(nèi)產(chǎn)生駐面聲波被用于測量細(xì)胞機(jī)械性能（圖1e）。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入微流道時(shí)，聲輻射力使細(xì)胞移動(dòng)到聲壓節(jié)點(diǎn)，其移動(dòng)速度取決于細(xì)胞可壓縮性［52］。利用細(xì)胞間有效聲阻抗值的差異，Augustsson等［53］對(duì)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、BA-F3和MCF7細(xì)胞的機(jī)械性能進(jìn)行了表征。由于細(xì)胞向聲節(jié)點(diǎn)的遷移往往需要數(shù)秒鐘，故其檢測通量較低且其測量參數(shù)常需要轉(zhuǎn)化為傳統(tǒng)的粘彈性參數(shù)。

磁扭轉(zhuǎn)流變儀通過磁場對(duì)附著于細(xì)胞表面或內(nèi)部的磁化微珠進(jìn)行操控（圖1f）。附著特定受體的配體的鐵磁性微珠與細(xì)胞粘連并在某一方向上被磁化；再在垂直于磁化方向施加磁場使磁珠產(chǎn)生扭轉(zhuǎn)，從而對(duì)結(jié)合的細(xì)胞表面受體施加可控的作用力并量化磁珠旋轉(zhuǎn)角度。細(xì)胞的機(jī)械性能可以從施加于磁珠的扭矩與磁珠的旋轉(zhuǎn)角度中獲得。磁扭轉(zhuǎn)流變儀已被應(yīng)用于細(xì)胞膜［54］、細(xì)胞骨架［55-56］等細(xì)胞成分的動(dòng)態(tài)機(jī)械響應(yīng)。磁鑷的工作原理與磁扭轉(zhuǎn)流變儀相似，也常被用來測量細(xì)胞的機(jī)械特性［57-58］。磁扭轉(zhuǎn)與磁鑷適于測量在細(xì)胞內(nèi)部組織的機(jī)械性能，但受限于施加在磁珠上的力較?。╬N），使其多用于測量細(xì)胞的局部機(jī)械性能而難以評(píng)估細(xì)胞整體機(jī)械性能。

在粒子追蹤微流變中，直徑小于1 μm的熒光珠被直接注射到活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這些熒光珠在細(xì)胞質(zhì)中迅速分散，隨后熒光顯微鏡跟蹤這些熒光珠的運(yùn)動(dòng)軌跡，從而評(píng)估細(xì)胞的力學(xué)特性［59］（圖1g）。粒子追蹤微流變是一種被動(dòng)測量單細(xì)胞機(jī)械性能的方法，可對(duì)處于復(fù)雜環(huán)境中（如三維基質(zhì)與體內(nèi)）的細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械性能檢測［60］。

Fig.3 Detection of mechanical properties of cells based on optical tweezers and stretcher圖3基于光鑷與光學(xué)拉伸的細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)

2 單細(xì)胞機(jī)械性能檢測的高通量方法

傳統(tǒng)的單細(xì)胞分析技術(shù)在面對(duì)大量樣本時(shí)難以快速獲得樣本的檢測數(shù)據(jù)。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，基于微流控技術(shù)的流式檢測方法不斷出現(xiàn)，使單細(xì)胞機(jī)械性能檢測的通量呈幾何式增長。接下來，本文將從細(xì)胞受力方式的角度對(duì)不同的微流控變形性細(xì)胞術(shù)（deformability cytometry，DC）進(jìn)行介紹，具體包括：細(xì)胞過孔受迫擠壓、剪切誘導(dǎo)變形以及拉伸誘導(dǎo)變形。

2.1 細(xì)胞過孔

測量細(xì)胞過孔時(shí)物理參數(shù)的機(jī)械性能檢測方法最先在微流控領(lǐng)域得到應(yīng)用。該技術(shù)（圖1h）通過驅(qū)動(dòng)懸浮液中的細(xì)胞穿過一個(gè)比其自身直徑略小的狹窄流道，當(dāng)細(xì)胞在狹窄流道內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于細(xì)胞抵抗流道壁擠壓變形的能力不同，其通過時(shí)間（細(xì)胞通過狹窄流道的時(shí)間）［7，61-64］、進(jìn)入時(shí)間（細(xì)胞由接觸入口到完全進(jìn)入狹窄流道的時(shí)間）［12，65］、通過 速 度［19，27，66］、細(xì) 胞 形 態(tài)［5，67-68］、馳 豫 時(shí) 間（離開狹窄流道后細(xì)胞恢復(fù)初始形態(tài)的時(shí)間）［69-70］及流體壓降［71-72］等物理參數(shù)各不相同。通過分析這些參數(shù)，研究者可確定細(xì)胞的變形性［5，9，73］、彈性［74-75］及粘彈性［76-78］等機(jī)械性能。

目前細(xì)胞過孔時(shí)的數(shù)據(jù)獲取方式主要有兩種：一是通過高速攝像機(jī)捕獲細(xì)胞圖像，二是在檢測流道區(qū)域布置電極獲得電信號(hào)。Hou等［12］利用高速攝像機(jī)拍攝到的細(xì)胞圖像獲得了細(xì)胞的進(jìn)入時(shí)間，并計(jì)算出細(xì)胞截面投影的長短軸之比，成功區(qū)分了人正常乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）與人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）。Adamo等［61］在狹窄流道的兩端布置電極，當(dāng)細(xì)胞穿過收縮區(qū)時(shí)，兩側(cè)電極之間的電阻值發(fā)生變化（圖4a）。通過比較電阻值峰寬，即細(xì)胞的通過時(shí)間，可以得到不同細(xì)胞的變形能力。利用這一方法，該課題組實(shí)現(xiàn)了正常HeLa細(xì)胞、經(jīng)微絲解聚劑處理的HeLa細(xì)胞和經(jīng)細(xì)胞松弛素B處理的HeLa細(xì)胞的鑒別。

細(xì)胞在通過狹窄流道時(shí)，變形的細(xì)胞膜與流道壁之間存在摩擦力，并影響細(xì)胞的通過時(shí)間、通過速度等參數(shù)，而摩擦力的大小與細(xì)胞機(jī)械性能有關(guān)。Gabriele等［2］發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞與流道壁面的摩擦力受到細(xì)胞硬度的影響，較硬細(xì)胞的膜與壁面之間的作用力更大，摩擦力更高，從而導(dǎo)致不同硬度白細(xì)胞的通過速度不同。為盡可能減小摩擦力的影響，直接考察細(xì)胞受迫變形能力，Walter等［79］提出一種直接量化狹窄流道內(nèi)細(xì)胞變形能力的方法來研究紅細(xì)胞變形時(shí)的力學(xué)響應(yīng)。通過在狹窄流道處設(shè)置懸臂式彈性微瓣作為變形傳感器，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過流道并被壓縮時(shí)，高速攝像機(jī)將記錄彈性微瓣的撓度及細(xì)胞的變形（圖4b）。

除細(xì)胞膜與流道壁面間的摩擦力外，細(xì)胞兩側(cè)的流體壓降以及細(xì)胞大小等因素也會(huì)影響測量結(jié)果。細(xì)胞通過狹窄流道時(shí)造成的壓降對(duì)于準(zhǔn)確獲得細(xì)胞力學(xué)參數(shù)十分重要，更大的壓降導(dǎo)致更短的細(xì)胞過孔時(shí)間。然而，直接測量細(xì)胞兩側(cè)的流體壓力十分困難，為此，Khan等［71］設(shè)計(jì)了一對(duì)完全相同的平行狹窄流道，兩平行流道的入口分離，出口聯(lián)通。當(dāng)上流道有細(xì)胞經(jīng)過時(shí)，出口處聯(lián)通區(qū)域的兩種不同液體之間的界面由于壓差而產(chǎn)生偏移（圖4c）。通過對(duì)界面偏移量的分析，得到細(xì)胞通過流道時(shí)的壓降。多數(shù)微流控芯片中的狹窄流道尺寸單一，難以實(shí)現(xiàn)尺寸差異較大細(xì)胞群體的精確檢測。Raj等［75］設(shè)計(jì)了一種包含多個(gè)不同尺寸的平行微收縮流道器件，實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)器件上同時(shí)表征具有較大尺寸差異的細(xì)胞機(jī)械性能（圖4d）。

Fig.4 Different detection methods of micro-constriction圖4細(xì)胞過孔的不同檢測方式

雖然細(xì)胞的進(jìn)入時(shí)間、通過時(shí)間、通過速度等參數(shù)可以作為區(qū)分不同變形性細(xì)胞的間接衡量指標(biāo)，但僅通過這些指標(biāo)的測量難以量化細(xì)胞的楊氏模量、剪切模量、冪律指數(shù)等機(jī)械性能參數(shù)。為獲得細(xì)胞的具體機(jī)械性能參數(shù)值，諸多理論模型被應(yīng)用于分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Luo等［74］在二維平面中采用不可壓縮新胡克粘超彈性固體（neo-Hookean visco-hyperelastic solid）模擬生物細(xì)胞，觀察其進(jìn)入收縮流道的過程，并采用庫侖定律模擬了細(xì)胞與固體壁間的摩擦。通過將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入數(shù)值模擬結(jié)果，得到了相應(yīng)的擬合公式，并計(jì)算出細(xì)胞瞬時(shí)楊氏模量。Ye等［80］使用光滑耗散粒子動(dòng)力學(xué)研究了細(xì)胞通過時(shí)間和機(jī)械性能之間的關(guān)系。通過分析模擬數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出了3種關(guān)于細(xì)胞通過時(shí)間的表達(dá)式，分別對(duì)應(yīng)于狹窄流道尺寸、細(xì)胞剪切模量和彎曲模量。

細(xì)胞檢測精度一直是研究者所關(guān)注的重要問題，部分研究者希望通過引進(jìn)先進(jìn)的精準(zhǔn)測量方法以提高測量精度。Byun等［27］制造出帶有狹窄流道的懸浮微通道諧振器，通過激光束的偏轉(zhuǎn)來檢測諧振頻率（圖5a）。該方法采用增益控制振蕩器電路連續(xù)跟蹤單個(gè)細(xì)胞流過狹窄流道時(shí)懸臂諧振頻率的變化，從而得到有關(guān)細(xì)胞進(jìn)入狹窄流道和通過狹窄流道的信息，進(jìn)而對(duì)具有不同物理特性的細(xì)胞系（如兩種不同的人肺腺癌細(xì)胞HCC827與H1975）實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分。Yang等［81］設(shè)計(jì)了一種具有一對(duì)平行多段狹窄流道的芯片，該芯片流道兩邊布置了自對(duì)準(zhǔn)3D電極對(duì)細(xì)胞進(jìn)行差分電阻抗測量（圖5b）。當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)其中一個(gè)流道時(shí)，與之接觸的兩個(gè)電極測量單細(xì)胞阻抗，而另一對(duì)電極則測量介質(zhì)阻抗，進(jìn)而形成差分測量以消除介質(zhì)電導(dǎo)率波動(dòng)和共模漂移對(duì)信號(hào)的影響，使細(xì)胞通過流道時(shí)測得的阻抗變化更為精準(zhǔn)，從而獲得更為準(zhǔn)確的細(xì)胞機(jī)械性能［82］。

多參量檢測與機(jī)器學(xué)習(xí)的結(jié)合亦是提高檢測精度的重要趨勢。Nyberg等［83］使用高通量變形細(xì)胞儀（quantitative deformability cytometry，q-DC）測量了細(xì)胞的6種物理表型，包括彈性模量、細(xì)胞流動(dòng)性、通過時(shí)間、進(jìn)入時(shí)間、細(xì)胞尺寸和最大應(yīng)變，借助K鄰接機(jī)器學(xué)習(xí)算法訓(xùn)練已知數(shù)據(jù)集，并將訓(xùn)練結(jié)果應(yīng)用于未知實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別。Apichitsopa等［84］將兩種單細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法集成在同一平臺(tái)上，并使用基于圖像的細(xì)胞跟蹤將所有測量參數(shù)與細(xì)胞對(duì)應(yīng)，同時(shí)得到尺寸、變形性（通過時(shí)間）和3種頻率下的極化率等細(xì)胞內(nèi)在屬性（圖5c）。

為進(jìn)一步提高檢測通量，Lange等［77］設(shè)計(jì)了一種集成8個(gè)平行流道的微流控芯片，基于圖像方法表征人紅白血病細(xì)胞系K562和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的進(jìn)入時(shí)間及形態(tài)變化，檢測通量高達(dá)160 cells/min（圖5d）。然而，受顯微鏡鏡視場的限制，利用顯微鏡捕獲變形細(xì)胞圖像的方法不能無限增加并行流道數(shù)。Ren等［85］設(shè)計(jì)了一種基于阻抗譜檢測的芯片，該芯片包含4個(gè)并行流道，其中每個(gè)流道包括2個(gè)由突擴(kuò)腔分隔的狹窄流道（圖5e）。雖然四流道的并行集成所提升的通量較小，但由于電學(xué)測量方法不受觀測區(qū)域的限制，有望大規(guī)模并行集成，從而極大提高整體通量。

利用高速攝像機(jī)或電阻抗技術(shù)測量細(xì)胞通過小于其自身直徑的狹窄流道時(shí)，各種物理參數(shù)的差異可以很好地區(qū)分不同變形性的細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合數(shù)值模型可以得到細(xì)胞的楊氏模量、冪律指數(shù)等機(jī)械性能參數(shù)值。由于涉及到細(xì)胞與流道壁的物理接觸，這種方法適合用于研究在微循環(huán)等過程中細(xì)胞的摩擦或滯留。然而，該類技術(shù)往往對(duì)細(xì)胞尺寸十分敏感，其檢測流道必須與被測細(xì)胞大小相匹配，細(xì)胞過大或過小都會(huì)造成測量結(jié)果的偏差。因此，該類技術(shù)往往適用于細(xì)胞尺寸較為均一的細(xì)胞群體。此外，由于其檢測流道尺寸小于細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過程中易造成流道堵塞。

2.2 剪切流誘導(dǎo)變形

細(xì)胞在流體作用下的剪切變形是一種高通量非接觸的單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)（圖1i）。細(xì)胞在經(jīng)過一個(gè)比其自身直徑略大的微流道時(shí)，由于流道截面的流體速度呈拋物線分布，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的剪切力以及流體正壓力作用于細(xì)胞，使細(xì)胞產(chǎn)生變形。細(xì)胞的變形圖像一般通過高速攝像機(jī)捕獲，以獲得細(xì)胞變形指數(shù)（1-4πA/C2，其中A為細(xì)胞投影面積、C為細(xì)胞投影周長［26，86-88］；b/a或(b-a)/(b+a)，其中b為細(xì)胞變形后投影截面的長軸尺寸、a為短軸尺寸［89-91］；）、形狀恢復(fù)過程［91-92］、熒光強(qiáng)度［11，93-94］等信息?；讷@得的數(shù)據(jù)，結(jié)合理論研究與數(shù)據(jù)分析，研究者能夠獲得細(xì)胞的各種力學(xué)參數(shù)［95-98］，甚至是生物學(xué)特征［93-94］。

Fig.5 High precision and high throughput detection of micro-constriction圖5細(xì)胞過孔的高精度與高通量檢測

細(xì)胞剪切變形作為一種非接觸的水動(dòng)力變形方法，相比于細(xì)胞過孔，檢測通量得到進(jìn)一步提升。Zheng等［91］在截面尺寸為8 μm×8 μm的流道兩側(cè)通入相同流量的鞘液，使中間樣品液中紅細(xì)胞穩(wěn)定在流道中心并對(duì)其施加剪切力（圖6a）。利用高速攝像機(jī)捕獲紅細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變形過程，量化了紅細(xì)胞圓度（4πA/C2）、變形指數(shù)（a/b）、形狀恢復(fù)速率（變形指數(shù)與時(shí)間的指數(shù)擬合）等多個(gè)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了超過300個(gè)紅細(xì)胞/min的表征。然而，由于檢測過程中所獲得的大量數(shù)據(jù)需要后期處理，降低了整個(gè)系統(tǒng)的實(shí)際通量。為此，Otto等［26］開發(fā)了一種實(shí)時(shí)變形性細(xì)胞術(shù)（real-time deformability cytometry，RT-DC），利用在線圖像分析算法，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞變形性的實(shí)時(shí)表征，使系統(tǒng)實(shí)際通量達(dá)到了6 000 cells/min以上（圖6b）。

實(shí)時(shí)變形性細(xì)胞術(shù)所檢測到的細(xì)胞機(jī)械性能不僅與細(xì)胞自身硬度有關(guān)，同時(shí)也會(huì)受到細(xì)胞尺寸的影響。為了解釋細(xì)胞尺寸與細(xì)胞變形能力之間的關(guān)系，Mietke等［95］利用斯托克斯方程求解一個(gè)圓柱微流道內(nèi)球形物體周圍的流場以得到作用于球形物體表面的應(yīng)力，進(jìn)而將其作為邊界條件并結(jié)合線彈性理論量化彈性球體表面的位移場，成功解釋了細(xì)胞尺寸對(duì)于細(xì)胞變形性的影響。但由于該模型忽略了細(xì)胞變形后產(chǎn)生的形狀改變與周圍流體間的相互作用，因而僅適用于較小的細(xì)胞變形量。為進(jìn)一步擴(kuò)大數(shù)值模型對(duì)于細(xì)胞剪切變形的適用范圍，并探討細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)的影響，Mokbel等［96］將細(xì)胞膜內(nèi)物質(zhì)表示為粘彈性材料，而細(xì)胞膜被表示為受彎曲剛度和表面張力影響的薄殼皮層，使模型對(duì)于細(xì)胞的大變形依然適用。

實(shí)際應(yīng)用中常常需要對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行同時(shí)分析，如在藥物篩選中需要對(duì)大量經(jīng)過不同方式處理的樣本進(jìn)行測試。為滿足實(shí)際應(yīng)用中的多樣本分析需求，Ahmmed等［87］結(jié)合分離的并行微流道陣列，開發(fā)了一種多樣本變形性細(xì)胞術(shù)（multi-sample deformability cytometry，MS-DC），實(shí)現(xiàn)了對(duì)多個(gè)樣本中細(xì)胞剪切誘導(dǎo)變形的檢測（圖6c）。

實(shí)驗(yàn)中流體速度在一定程度上影響著細(xì)胞機(jī)械性能的檢測精度，不同的流速下細(xì)胞受到的力不同，導(dǎo)致同等變形能力的細(xì)胞變形程度不同，從而干擾細(xì)胞機(jī)械性能的測量。由于難以直接測量流速，Saadat等［99］通過兩次數(shù)值模擬構(gòu)建了流道中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度與流體流速之間的關(guān)系，從而由細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度得到流速。

Fig.6 The schematic of microfluidic shear-induced deformation chip structure圖6微流控剪切誘導(dǎo)變形芯片結(jié)構(gòu)示意圖

為進(jìn)一步將細(xì)胞的機(jī)械性能與細(xì)胞分子特異性相關(guān)聯(lián)，Rosendahl等［93］將熒光成像技術(shù)引入實(shí)時(shí)細(xì)胞變形性檢測，設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光和變形性細(xì)胞術(shù)（real-time fluorescence and deformability cytometry，RT-FDC）（圖6d）。基于獲得的熒光信號(hào)以及形變數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)果蠅Kc167細(xì)胞系不同有絲分裂階段的有效鑒別。為進(jìn)一步提高分類準(zhǔn)確率，Nawaz等［94］應(yīng)用深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)紅細(xì)胞缺失血液中的中性粒細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)分選，分選純度達(dá)到89.7%，表達(dá)CD66+/CD14-的細(xì)胞被富集10倍。

基于流體剪切力誘導(dǎo)細(xì)胞變形的微流控細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法可以達(dá)到數(shù)千cells/min的極高通量。雖然相比于細(xì)胞擠壓變形，剪切誘導(dǎo)變形受細(xì)胞尺寸的影響較小，但由于流場中作用于細(xì)胞的應(yīng)力場會(huì)受到細(xì)胞尺寸與形狀的影響，導(dǎo)致參數(shù)測量存在誤差，因而需要準(zhǔn)確的建模方法來校準(zhǔn)流道中的流場，以獲得更準(zhǔn)確的細(xì)胞機(jī)械性能參數(shù)。

2.3 拉伸流誘導(dǎo)變形

除剪切流誘導(dǎo)細(xì)胞變形的高通量非接觸檢測技術(shù)外，另一種檢測方法采用拉伸流使細(xì)胞產(chǎn)生軸向拉伸。該技術(shù)利用兩股相同的流體在十字形流道處匯聚形成的拉伸流場對(duì)細(xì)胞施加拉應(yīng)力，細(xì)胞在拉應(yīng)力的作用下沿流場方向拉伸（圖1j）。

與剪切力主導(dǎo)的水動(dòng)力變形方法相比，拉應(yīng)力主導(dǎo)的細(xì)胞變形方式由于流道內(nèi)流速更高，因而其通量得到進(jìn)一步提升。Gossett等［25］設(shè)計(jì)的檢測芯片利用兩側(cè)的蛇形流道使細(xì)胞慣性聚焦形成一列，并逐一進(jìn)入?yún)R聚點(diǎn)處的拉伸流場（圖7a）。細(xì)胞在拉伸流場中產(chǎn)生的變形被高速攝像機(jī)記錄并量化細(xì)胞初始直徑與變形量。在不考慮后期圖像處理的情況下，該方法能夠以超過十萬cells/min的速率獲得細(xì)胞的原始圖像數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上，Dudani等［100］對(duì)流道結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，采用液壓回路設(shè)計(jì)對(duì)細(xì)胞所受拉應(yīng)力進(jìn)行優(yōu)化。細(xì)胞進(jìn)入流道后首先經(jīng)過蛇形聚焦流道，之后流道分為3股，細(xì)胞由中間流道向下游運(yùn)動(dòng)，而兩側(cè)流體形成高速夾流，在下游垂直匯入中間流道，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拉伸（圖7b）。這種方式避免了細(xì)胞長時(shí)間停留在拉伸流場，將檢測通量提高到近4百萬cells/min。

Fig.7 The schematic of microfluidic stretch-induced deformation chip structure圖7微流控拉伸誘導(dǎo)變形芯片結(jié)構(gòu)示意圖

雖然利用慣性微流控的蛇形流道聚焦可以將細(xì)胞排列至流道寬度方向的單一位置，但細(xì)胞在流道高度方向上并未實(shí)現(xiàn)單一位置聚焦，導(dǎo)致顯微成像系統(tǒng)不能獲得高質(zhì)量的細(xì)胞圖像且細(xì)胞受力不均。為克服上述問題，Cha等［101］引入黏彈性微流控技術(shù)，黏彈性液體中細(xì)胞在慣性力和彈性力的協(xié)同作用下在流道截面中心實(shí)現(xiàn)三維聚焦（圖7c）。除利用黏彈性溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維聚焦外，Deng等［102］提出一種直流道中均布著一系列垂直排列的矩形障礙物的芯片結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了慣性流下的細(xì)胞三維聚焦。在慣性升力的作用下，每個(gè)障礙物產(chǎn)生一對(duì)螺旋二次流，將細(xì)胞引導(dǎo)到一個(gè)單一的平衡位置（圖7d）。

除細(xì)胞在特定時(shí)刻特定位置的變形外，細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變形過程亦包含了大量信息。Masaeli等［103］從細(xì)胞在微流體拉伸流場中變形的過程中提取出15個(gè)生物物理參數(shù)（包括細(xì)胞的尺寸和應(yīng)變、基于時(shí)間的變形和細(xì)胞形態(tài)學(xué)等），應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)方法處理15維數(shù)據(jù)集，該技術(shù)可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行精確的分類，準(zhǔn)確率超過95%。

相比于流體剪切力主導(dǎo)的細(xì)胞變形，細(xì)胞在十字形流道中受到的應(yīng)力更大。Armistead等［104］通過調(diào)整流體黏度及流速，分別測試了剪切主導(dǎo)與拉伸主導(dǎo)下的細(xì)胞變形。研究結(jié)果表明，與高黏度、低流速的環(huán)境相比，細(xì)胞在低黏度、高流速測得的硬度更高。Urbanska等［105］對(duì)于兩者的比較研究亦證明了上述研究結(jié)論。這一差異產(chǎn)生的可能原因是低應(yīng)變下細(xì)胞骨架主導(dǎo)了細(xì)胞的變形性，而當(dāng)細(xì)胞承受高應(yīng)變時(shí)，更硬的細(xì)胞核主導(dǎo)了細(xì)胞的力學(xué)響應(yīng)［19］。

雖然該方法的檢測通量是目前微流控單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)中最高的，但高流速下對(duì)于細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)捕捉需要高性能的高速攝像機(jī)和大量的數(shù)據(jù)后處理，檢測成本較高。

3 結(jié)論與展望

細(xì)胞機(jī)械性能與細(xì)胞生理功能之間有著緊密的聯(lián)系，細(xì)胞遷移、分裂與分化等重要的生物過程以及許多疾病的發(fā)生與發(fā)展都伴隨著細(xì)胞機(jī)械性能的改變。傳統(tǒng)的單細(xì)胞機(jī)械性能檢測技術(shù)的通量與流式細(xì)胞術(shù)相比非常低，使其難以在大量異質(zhì)細(xì)胞中識(shí)別出少數(shù)感興趣的稀有細(xì)胞，如在癌癥病人的外周血液中尋找稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞。近年來發(fā)展起來的微流控技術(shù)給這一問題提供了解決方案，一些微流控機(jī)械性能檢測技術(shù)的通量達(dá)到甚至超過了流式細(xì)胞術(shù)。然而，這些新興技術(shù)仍面臨著諸多問題亟待解決。例如，各種方法的檢測結(jié)果存在較大差異，甚至同一類型的細(xì)胞使用不同方法測得的細(xì)胞力學(xué)參數(shù)亦相差甚遠(yuǎn)。此外，需要昂貴的設(shè)備與復(fù)雜的操作亦是微流控機(jī)械性能檢測技術(shù)走向應(yīng)用所需解決的問題。

未來單細(xì)胞機(jī)械性能的檢測勢必會(huì)向著高通量、自動(dòng)化及集成化等方向發(fā)展以滿足不同應(yīng)用場景的需求。高通量對(duì)于臨床中疾病的快速篩查和診斷具有非常重要的作用，特別是當(dāng)樣本細(xì)胞數(shù)量非常龐大，達(dá)到數(shù)萬甚至數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞時(shí)，高通量的處理方法可以在短時(shí)間內(nèi)得獲得樣本的測試結(jié)果，以避免細(xì)胞在測量過程中發(fā)生潛在特性改變?？s減檢測過程中人工操作，實(shí)現(xiàn)檢測過程的自動(dòng)化不僅可以省去在人員培訓(xùn)中所耗費(fèi)的大量時(shí)間，同時(shí)也可避免檢測過程中可能存在的各種人為誤差。檢測設(shè)備的小型化與集成化是這些檢測方法實(shí)現(xiàn)市場化應(yīng)用需要解決的重要問題之一。

除了細(xì)胞機(jī)械性能檢測本身外，細(xì)胞在水動(dòng)力作用下的變形亦有了新的應(yīng)用方向。已有研究證明，細(xì)胞的大變形伴隨著細(xì)胞表面順態(tài)孔的出現(xiàn)，使加入細(xì)胞懸液的合成生物分子或功能性納米材料通過擴(kuò)散與溶液交換將這些物質(zhì)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部［106-109］。相比于傳統(tǒng)的電穿孔、脂肪分離或病毒傳導(dǎo)，這種方式成本更低、操作更簡單［110］。

本文介紹了6種單細(xì)胞機(jī)械性能檢測方法的物理原理及最新研究進(jìn)展，闡明了每種測量方法的優(yōu)缺點(diǎn)。未來，期望通過這些技術(shù)的不斷改進(jìn)與完善，使其廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)及臨床診斷等領(lǐng)域，為疾病診斷和生物學(xué)研究提供新的工具手段。