補充維生素D與體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植周期結(jié)局關(guān)系的研究

宋蘇,蘇萍,鄒敏,陳烊姣

維生素D的生理功能主要是調(diào)節(jié)鈣磷、骨骼發(fā)育、促進(jìn)機體生長等。近年來，在生殖系統(tǒng)中，例如卵巢、子宮內(nèi)膜、輸卵管以及男性睪丸中均發(fā)現(xiàn)有維生素D受體存在，提示維生素D可能參與調(diào)節(jié)人類生殖[1-2]。越來越多的研究顯示維生素D缺乏是不孕女性進(jìn)行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transplantation,IVF/ICSI-ET)助孕治療的不利因素。對維生素D缺乏的女性進(jìn)行維生素D的補充可能有益于其助孕結(jié)局。但目前有關(guān)維生素D缺乏的不孕女性是否有必要補充維生素D的研究較少。本研究主要目的在于探討對維生素D缺乏的不孕女性補充維生素D后行IVF/ICSI-ET助孕治療是否獲益，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象與分組

1.1.1 研究對象 選擇2019年1月至2020年12月在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療的325例不孕癥女性患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡均小于35歲；所有對象均排除內(nèi)科疾??；無子宮畸形和宮頸疾??；無肝腎功能異常；均為第一周期在本中心接受輔助生殖技術(shù)助孕治療；治療前各項化驗指標(biāo)均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)<18 kg/m2或>28 kg/m2；基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，F(xiàn)SH)>10 mIU/mL；子宮內(nèi)膜異位癥者，有反復(fù)妊娠丟失史(定義為3次或以上自然流產(chǎn))；自身免疫疾病、內(nèi)分泌紊亂疾病、感染性疾病、抗磷脂抗體綜合征、血栓形成狀態(tài)需要抗凝治療者；先天性或獲得性子宮解剖學(xué)異常及子宮肌瘤者；輸卵管積水；既往有嚴(yán)重的心血管疾病、肺部及肝腎疾病等；在篩查前3個月內(nèi)參加過其他試驗藥物研究；研究者判斷有不適合入組的異常情況。記錄研究對象的基本資料，包括年齡、不孕年限、不孕原因、BMI、基礎(chǔ)FSH，促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)，雌二醇(estrsdiol，E2)、抗苗勒氏管激素(anti-müllerian hormone，AMH)等。

1.1.2 研究分組 325例不孕女性于初次體檢時進(jìn)行血清維生素D水平的檢測，將維生素D缺乏的180例患者隨機分為兩組：A組(90例)僅服用復(fù)合維生素(含維生素D 400 IU/片)，每日1粒 ；B組(90例)除每日服用復(fù)合維生素外，每日補充維生素D滴劑1 600 IU，共8周至取卵前，補充劑量采用2011年美國內(nèi)分泌學(xué)會推薦的成人補充量[3]。B組有18例患者未按要求進(jìn)行補充維生素D滴劑，予以剔除。其中，A組進(jìn)行胚胎移植者50例，為A1組，B組進(jìn)行胚胎移植者42例，為B1組。追訪各組的獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)；追訪A1和B1組的獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)、胚胎著床率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率的情況，研究流程見下頁圖1。

圖1 研究流程圖

1.2 材料與方法

1.2.1 血清維生素D檢測 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清25(OH)D水平，羅氏全自動發(fā)光儀開機、校準(zhǔn)、質(zhì)控，試劑盒采用美國R&D公司生產(chǎn)的。

血清維生素D水平用 2011年美國內(nèi)分泌學(xué)會臨床指南(ENDO 指南)[3]推薦的標(biāo)準(zhǔn)：采用血清25(OH)D評估人體維生素D水平，25(OH)D≥30 ng/mL為維生素D充足，20 ng/mL≤25(OH)D≤29 ng/mL為維生素D不足，25(OH)D<20 ng/mL為維生素D缺乏。

1.2.2 IVF/ICSI-ET促排方案 所有患者均采用早卵泡期長方案，依據(jù)本中心臨床操作手冊，月經(jīng)周期第1～3天給予肌肉注射達(dá)菲林3.75 mg降調(diào)節(jié)，28～30 d后達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)，即血E210～30 pg/mL，LH 1～3 mIU/mL，雙側(cè)竇卵泡在6 mm左右，給予外源性促性腺激素(gonadotropin，Gn)果納芬進(jìn)行控制性促排卵。根據(jù)卵泡發(fā)育情況和血清中E2水平調(diào)整Gn劑量。當(dāng)B超發(fā)現(xiàn)一批主導(dǎo)卵泡平均直徑在18～20 mm以上，E2值與平均直徑大于14 mm卵泡數(shù)目相符時(即每個14 mm以上卵泡分泌的E2約為250～300 pg/mL)，根據(jù)血LH、E2、P水平?jīng)Q定當(dāng)晚8:00～9:00給予皮下注射hCG 6 500 IU。36 h后行B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。取卵當(dāng)日開始肌肉注射黃體酮注射液60 mg/d，行黃體支持。取卵后第3天進(jìn)行胚胎移植，對于不能移植的患者，取消移植，行全胚冷凍保存。所有移植患者均移植兩枚第3天卵裂期胚胎。胚胎移植后14 d檢測血清hCG值，hCG>10 mIU/mL者繼續(xù)給予黃體支持；移植30～35 d后B超確定是否臨床妊娠。

1.2.3 使用藥品 達(dá)菲林(3.75 mg/支，醋酸曲普瑞林注射液，法國益普生制藥公司)；黃體酮注射液(20 mg/支，浙江仙琚制藥)；復(fù)合維生素(30片/盒，拜耳醫(yī)藥)；維生素D滴劑(400 IU/粒，青島雙鯨藥業(yè))；重組人促卵泡素(果納芬，450 IU/支，75 IU/支，默克雪蘭諾制藥)；注射用重組人促黃體激素(樂芮，75 IU/支，默克雪蘭諾制藥)；注射用重組人絨促性素注射液(艾澤250 ug/6 500 IU/支，默克雪蘭諾制藥)；地屈孕酮片(達(dá)芙通 10 mg/片，20片/盒，雅培制藥)。本研究得到華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號：【2019】倫審字(05)號。

1.2.4 胚胎質(zhì)量評價 根據(jù)Peter評分系統(tǒng)對卵裂期胚胎進(jìn)行評分。I級：卵裂球大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻，無顆?，F(xiàn)象，碎片<10%；II級：卵裂球大小稍不均勻，形狀稍不規(guī)則，胞質(zhì)有顆?，F(xiàn)象，碎片在10%～20%之間；III級：卵裂球不均勻，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)有明顯顆粒現(xiàn)象，碎片在20%～50%之間；IV級：卵裂球嚴(yán)重不均勻，形狀嚴(yán)重不規(guī)則，胞質(zhì)有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片>50%。D3優(yōu)質(zhì)胚胎為卵裂球數(shù)目≥6個的I、II級胚胎。

1.3 術(shù)語定義

臨床妊娠：移植后30～35 d，B超檢查宮腔內(nèi)見孕囊(包括單孕囊，雙孕囊及宮外妊娠者)確定為臨床妊娠；早期流產(chǎn)率：妊娠12周以前發(fā)生的流產(chǎn)例數(shù)占總?cè)焉镏芷跀?shù)的比例；活產(chǎn)率：分娩活胎的周期數(shù)占移植周期的比例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 325例不孕女性血清維生素D水平分布情況

本研究共對325 例不孕女性進(jìn)行了血清維生素D水平的檢測。其中，血清中維生素D缺乏的有180例，占比55.39%；不足124例，占比38.15%；充足21例，占比6.46%。

2.2 A、B兩組基本資料及實驗室結(jié)局比較

A、B兩組間平均年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH/LH/E2、AMH等指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。兩組間Gn天數(shù)、Gn總用量、扳機日血清LH水平、E2值、內(nèi)膜厚度、孕酮(progesterone,P)值、平均獲卵數(shù)、平均優(yōu)胚數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表2。

表1 A、B兩組患者基本臨床資料比較

表2 A、B兩組用藥情況、扳機日指標(biāo)、獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)比較

表3 A1、B1兩組用藥情況、扳機日指標(biāo)、獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)比較

2.3 A1、B1兩組移植周期結(jié)局比較

A1、B1兩組間Gn天數(shù)、Gn總用量、扳機日血清LH水平、E2值、P值、內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)、平均優(yōu)胚數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表3。B1組胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于A1組，早期流產(chǎn)率低于A1組,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表4。

表4 A1、B1兩組胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較[例(%)]

3 討論

本研究中，不孕癥女性血清維生素D水平充足患者 21 例，僅占 6.46%;不足患者124例，占38.15%;缺乏患者 180 例，占55.39%;未發(fā)現(xiàn)血清維生素D過量患者。本研究提示血清維生素D水平缺乏在不孕女性中普遍存在，這一結(jié)果與之前的研究是一致的[4-7]。

多項研究顯示，維生素D缺乏對不孕癥女性進(jìn)行IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局有不良影響，維生素D缺乏女性進(jìn)行IVF/ICSI-ET的臨床妊娠率均低于維生素D充足的女性[8-12]。影響不孕癥女性行IVF/ICSI-ET治療結(jié)局的因素眾多，目前認(rèn)為胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性是影響妊娠的主要因素。維生素D通過維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)來發(fā)揮其生物學(xué)功能，但其改善不孕癥女性行IVF/ICSI-ET助孕治療結(jié)局的具體作用機制并不明確。2009年Thill等[13]在蛋白水平發(fā)現(xiàn)女性卵巢中也存在VDR，主要在人類顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。后有研究證明，維生素D可以誘導(dǎo)卵巢激素的生成，如雌激素、孕激素等，對卵巢功能的調(diào)節(jié)起到一定的作用[14]。李紅等[15]研究結(jié)果顯示同源框基因 A10(Homebox A10 gene，HOXA10)mRNA在不明原因不孕患者中的表達(dá)低于正常育齡婦女，從而推測HOXA10基因可能參與內(nèi)膜蛻膜化過程，并且在胚胎著床過程中發(fā)揮作用，HOXA10基因低表達(dá)可能影響胚胎著床。維生素D主要在子宮內(nèi)膜的基質(zhì)表達(dá)，通過VDR與視黃醇 X 受體(retinoid X receptor，RXR)結(jié)合形成二聚體，結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的維生素D效應(yīng)元件(Vitamin D response element，VDRE)增強 HOXA10基因的表達(dá)，提高子宮內(nèi)膜容受性，有利于胚胎著床。妊娠早期，維生素D可能通過調(diào)控母胎界面細(xì)胞因子，維持母體輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)1/ Th2的平衡，減少Th1細(xì)胞增生，限制其細(xì)胞因子的生成及免疫殺傷作用，增加Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低外周血自然殺傷細(xì)胞毒性，增強免疫耐受，從而在胚胎植入過程中起到保護(hù)作用[16]。

Chu等[17]進(jìn)行的一項Meta 分析顯示，維生素D水平與IVF妊娠率呈正相關(guān)，并提出維生素D缺乏和不足可能是影響不孕女性IVF/ICSI-ET治療結(jié)局的重要因素。 Zhao等[18]2018年進(jìn)行的一項Meta 分析，研究共包括9項(3項IVF研究、1項ICSI研究、3項IVF/ICSI研究和2項卵母細(xì)胞捐贈研究)，涵蓋了2 254對夫婦行IVF/ICSI后的臨床妊娠率，共有1 112個妊娠周期。均提示缺乏維生素D與IVF/ICSI-ET后活產(chǎn)率降低有關(guān)。并建議對維生素D水平不足的不孕女性進(jìn)行維生素D的補充，可能會有益于其IVF/ICSI-ET的臨床結(jié)局，提高臨床妊娠率。但補充多少的維生素D量合適，以及補充時間，均無參考標(biāo)準(zhǔn)。

本研究采用前瞻性隨機對照研究，對試驗組維生素D缺乏的不孕女性，進(jìn)行維生素D補充，結(jié)果顯示B組的胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均明顯高于對照組，提示維生素D補充可能有益于IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局，但兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與樣本量不足有關(guān)，同時本研究也存一定的不足：單中心研究，沒有去除男方精子質(zhì)量因素等。

目前，有關(guān)維生素D缺乏的不孕女性是否有必要補充及如何補充維生素D的研究非常有限。Aflatoonian等[19]2014年進(jìn)行了一項隨機對照研究，對行凍融胚胎移植的114例維生素D缺乏的不孕癥患者隨機分組，其中57例患者移植前每周補充50 000 U維生素D，治療6～8周，研究顯示維生素D補充治療并未提高凍融胚胎移植的妊娠率。Wehr等[20]2009年報道了對46例多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)進(jìn)行給予每周20 000 U 維生素D治療，24周后發(fā)現(xiàn)，約50%PCOS患者的月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)癥狀得到改善。Dastorani等[21]對進(jìn)行IVF助孕治療的PCOS患者補充維生素D，結(jié)果顯示可改善PCOS患者胰島素代謝以及體脂狀況。Lerchbaum等[22]指出，維生素D補充治療可能并不能大幅改善不孕癥現(xiàn)狀，但其治療安全、經(jīng)濟，對不孕癥治療可起到輔助作用。

綜上所述，不孕癥女性維生素D水平普遍不足或缺乏，眾多研究提示血清維生素D缺乏，對不孕女性行IVF/ICSI-ET臨床妊娠率有不良影響，但其具體機制尚不清楚。本研究提示對維生素D缺乏的不孕癥女性補充維生素D可能有益于其IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局。但這一結(jié)果仍需要多中心大樣本隨機對照研究來證實。