子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21水平與不孕不育的相關(guān)性分析

許文麗,邢秀月,徐川微

子宮內(nèi)膜異位癥主要患病人群是育齡期婦女，它是指子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜以外部位出現(xiàn)生長、浸潤，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)月經(jīng)異常、痛經(jīng)、性交痛、生育能力低、不孕等癥狀，能夠?qū)D女的生育能力造成很大傷害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。目前子宮內(nèi)膜異位癥常用的檢測方法為腹腔鏡檢查和病理學(xué)診斷，而腹腔鏡檢查因具有創(chuàng)傷性，使用時有很大限制[3]。微小RNA-21(miR-21)在胎盤及腫瘤等多種組織中高表達(dá)，在腫瘤微環(huán)境中參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4- 5]。研究表明，miR-21在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]。推測miR-21可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展及患者不孕不育有關(guān)。因此，本研究通過探究血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21水平與子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后不孕不育的相關(guān)性，以期為改善不孕不育等不良結(jié)局提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年11月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院就診并行腹腔鏡手術(shù)治療的120例子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對象(患者均合并不孕癥)，根據(jù)妊娠結(jié)局將其分為妊娠成功組69例(均為自然妊娠)與不孕不育組51例，其中妊娠成功組年齡23～34歲，平均(28.68±5.49)歲；不孕不育組年齡23～35歲，平均(28.72±5.68)歲。本試驗經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 所有患者均經(jīng)病理證實，符合子宮內(nèi)膜異位癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥患者符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；② 夫妻有正常性生活且未采取任何避孕措施；③ 患者臨床資料保存完整；④ 術(shù)前未接受過其他相關(guān)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 伴有其他婦科疾病及惡性腫瘤者；② 生殖器官發(fā)育不良者；③ 存在免疫功能異常及心、肝、腎等功能異常者。

收集并整理患者一般資料，主要包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、不孕年限等。

1.2 主要試劑與儀器

miRNA提取試劑盒(貨號：AM1556)購自美國Life公司；TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：D1802)購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；miScript SYBR Green PCR Kit(貨號：DXT-218073)購自美國Qiagen公司；Rox reference dye(貨號：JKG029)購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：ABI 7700)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 在腹腔鏡手術(shù)時取得子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜組織后，置于-80℃保存?zhèn)溆?；采集子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后24 h血液樣品，離心收集血清，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平檢測 采用miRNA提取試劑盒提取所有受試者血清及子宮內(nèi)膜組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對目的基因miR-21和內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，miScript SYBR Green Mix(2×)5 μL，Rox reference dye(50×)0.2 μL，ddH2O 3.0 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，引物序列詳見表1。各樣品均重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法對各組血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 子宮內(nèi)膜異位癥生育指數(shù)測評[9]子宮內(nèi)膜異位癥生育指數(shù)(endometriosis fertility index，EFI)評分內(nèi)容主要包括手術(shù)因素和病史因素，手術(shù)因素包括美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會修訂的(revised American Fertility Society，r-AFS)子宮內(nèi)膜異位癥分期總分(01分)以及最低功能評分(03分)，病史因素包括生育史、不孕年限、年齡(每項02分)。EFI總分10分，得分越高則妊娠概率越高。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 妊娠成功組與不孕不育組一般資料比較

妊娠成功組與不孕不育組年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、LH、T、E2、不孕年限比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 妊娠成功組與不孕不育組一般資料比較

2.2 妊娠成功組與不孕不育組血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平比較

不孕不育組血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平均高于妊娠成功組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見下頁表3。

表3 妊娠成功組與不孕不育組血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平比較

2.3 血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21水平對子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結(jié)局的預(yù)測價值

分別以血清、子宮內(nèi)膜組織miR-21單個指標(biāo)檢測值及二者聯(lián)合預(yù)測概率值為檢驗變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清、子宮內(nèi)膜組織miR-21水平預(yù)測子宮內(nèi)膜異位癥患者不孕不育的曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.899(95%CI:0.846-0.951)、0.942(95%CI:0.901-0.983)，截斷值分別為1.212、1.325，特異性分別為79.7%、92.8%，敏感度分別為82.4%、86.3%；二者聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.977(95%CI:0.955-0.998)，特異性為91.3%，敏感度為92.2%，見圖1。

圖1 血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21水平預(yù)測子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結(jié)局的ROC曲線

2.4 子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平與EFI評分的相關(guān)性

以ROC曲線結(jié)果中的截斷值為界，將子宮內(nèi)膜異位癥患者血清miR-21分為高表達(dá)62例、低表達(dá)58例；子宮內(nèi)膜組織miR-21分為高表達(dá)59例、低表達(dá)61例。Spearman法分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平與EFI評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.483、-0.570，P<0.05)，詳見下頁表4。

表4 子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平與EFI評分的相關(guān)性

2.5 影響子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結(jié)局的多因素Logistic回歸分析

將子宮內(nèi)膜異位癥患者是否術(shù)后不孕不育作為因變量，以血清miR-21、子宮內(nèi)膜組織miR-21、年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH、LH、T、E2為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜組織miR-21是影響子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后不孕不育的獨立危險因素(P<0.05)，詳見下頁表5。

表5 影響子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠結(jié)局的多因素Logistic回歸分析

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展過程仍有待探究，發(fā)病機(jī)制有經(jīng)血逆流、種植及體腔上皮化等，其某些生物學(xué)行為與惡性腫瘤相似，具有局部散播、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織侵襲等惡性行為[10]。子宮內(nèi)膜異位癥根治手術(shù)有可能使婦女喪失生育能力，因此臨床上對有生育需求的子宮內(nèi)膜異位癥患者一般采用保守性手術(shù)治療[11]。子宮內(nèi)膜異位癥成為困擾醫(yī)學(xué)界的難治之癥，需從基礎(chǔ)、臨床等各方面加強(qiáng)病理研究，解決診治難題。

miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，可按照堿基互補(bǔ)配對原則與靶基因3’端非編碼區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的翻譯，下調(diào)靶蛋白的生成，進(jìn)而在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞代謝、胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮重要調(diào)控功能[12]。miR-21參與細(xì)胞趨化運(yùn)動及腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[13]。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展與纖維化相關(guān)因子的異常表達(dá)密切相關(guān)，而miR-21參與多種纖維化疾病的調(diào)控[14- 15]；丁屹等[16]研究結(jié)果顯示miR-21在子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中高表達(dá)，且對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力有一定影響，因此推測miR-21可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的病情進(jìn)展，進(jìn)而影響患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后不孕不育患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平均高于妊娠成功患者，且子宮內(nèi)膜組織miR-21是影響子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后不孕不育的獨立危險因素。提示miR-21可能通過高表達(dá)參與子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后不孕不育的病理機(jī)制。Liu S等[17]研究顯示，miR-21是參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的細(xì)胞信號通路的重要調(diào)節(jié)因子。本研究推測術(shù)后病理狀態(tài)下miR-21水平上調(diào)，通過相關(guān)靶基因?qū)w維化相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮致纖維化作用，進(jìn)而造成患者盆腔粘連加重、卵巢功能損傷、盆腔內(nèi)環(huán)境惡化，最終干擾精卵結(jié)合、造成受精失敗。研究表明，EFI評分是一種用于預(yù)測子宮內(nèi)膜異位癥患者預(yù)后的工具，該評分綜合考慮手術(shù)及患者病史等多方面因素，可有效預(yù)測患者術(shù)后妊娠率[18]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平與EFI評分均呈負(fù)相關(guān)，且血清、子宮內(nèi)膜組織miR-21對患者不孕不育均有一定的預(yù)測價值，其AUC分別為0.899、0.942。進(jìn)一步提示臨床中可考慮將miR-21作為評估子宮內(nèi)膜異位癥患者預(yù)后的標(biāo)志物，有利于早期篩選術(shù)后不孕不育患者，對于高危患者應(yīng)積極給予治療措施，協(xié)助患者妊娠。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后不孕不育患者血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21水平升高，且血清及子宮內(nèi)膜組織miR-21表達(dá)水平與EFI評分均呈負(fù)相關(guān)，miR-21在子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后不孕不育的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。miR-21檢測簡單易行，無操作性創(chuàng)傷，降低了醫(yī)療費(fèi)用和患者負(fù)擔(dān)，可能作為子宮內(nèi)膜異位癥患者術(shù)后不孕不育的預(yù)測指標(biāo)和潛在治療靶點。但miR-21在子宮內(nèi)膜異位癥及不孕不育病理機(jī)制中的作用極為復(fù)雜，需進(jìn)一步深入分析。