睪丸組織懸液體外培養(yǎng)對(duì)睪丸精子活力和冷凍復(fù)蘇結(jié)局的影響

馬春杰，李倩儀，莊嘉明，羅璐璐，周穎儀，梁明潔，劉晃，周雨，張欣宗，蔣敏

使用睪丸精子行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)逐漸成為梗阻性和非梗阻性無精子癥患者獲得子代的輔助生殖治療技術(shù)。不論是新鮮還是冷凍復(fù)蘇后的睪丸精子，獲得活動(dòng)的、可用的睪丸精子是ICSI是否成功的關(guān)鍵。早在1995年就有研究人員報(bào)道，手術(shù)獲得的睪丸組織在37℃體外培養(yǎng)基中進(jìn)行24～72 h的體外培養(yǎng)，隨著時(shí)間推移，進(jìn)行性活動(dòng)精子的數(shù)量明顯增加[1]。近年來，陸續(xù)有研究報(bào)道睪丸組織的多種體外培養(yǎng)方案可以提高活動(dòng)精子數(shù)量，國(guó)內(nèi)各個(gè)生殖中心或人類精子庫(kù)根據(jù)自身?xiàng)l件和經(jīng)驗(yàn)對(duì)睪丸顯微取精獲得的睪丸組織懸液或精子進(jìn)行體外培養(yǎng)和/或冷凍，目前未見相關(guān)的專家共識(shí)或其它指導(dǎo)性文件。因此，本研究對(duì)人睪丸組織懸液體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)睪丸精子活力和冷凍復(fù)蘇結(jié)局的影響進(jìn)行回顧性分析，以完善本人類精子庫(kù)的相關(guān)方案。

1 材料和方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為2017年7月至2020年8月在廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院)行顯微睪丸切開取精術(shù)的85例行睪丸精子生育力保存的非梗阻性無精子癥患者，所有患者均簽署了知情同意書，本項(xiàng)目經(jīng)廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 制備睪丸組織懸液 將顯微睪丸切開取精術(shù)獲得的曲細(xì)精管加入到已預(yù)熱的少量G-MOPSTMPLUS處理液(瑞典 Vitrolife)中，顯微剪剪碎后，攤薄睪丸組織懸液，將含有上述睪丸組織懸液的無菌培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下初檢，然后盡快收集睪丸組織懸液至培養(yǎng)管內(nèi)。

1.2.2 制備睪丸組織懸液濕片 充分混勻培養(yǎng)管內(nèi)的睪丸組織懸液，混勻后立即取樣10 μL置于潔凈的載玻片上，蓋上22 mm×22 mm的蓋玻片，制成濕片，待液體不再漂移后立即用×200或×400倍的相差顯微鏡評(píng)估此濕片，記錄睪丸精子數(shù)和活力，分為手術(shù)當(dāng)日睪丸組織懸液未見精子組、見活動(dòng)精子組、見不動(dòng)精子組。

1.2.3 睪丸組織懸液體外培養(yǎng) 將手術(shù)獲得的睪丸組織懸液置于34℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，隨機(jī)分成以下各組，體外培養(yǎng)16 h組10例，18 h組12例，20 h組14例，21 h組13例，22 h組14例，23 h組6例，24 h組16例。體外培養(yǎng)后根據(jù)是否存在活動(dòng)精子進(jìn)行睪丸精子冷凍保存。

1.2.4 睪丸精子冷凍與復(fù)蘇 體外培養(yǎng)后的各組睪丸組織懸液按上述方法進(jìn)行濕片鏡檢，記錄睪丸精子數(shù)和活力。將34℃體外培養(yǎng)16～24 h后仍可見活動(dòng)精子的睪丸組織懸液進(jìn)行冷凍，并選取部分樣品進(jìn)行復(fù)蘇。冷凍方法是將睪丸組織懸液與精子凍存液(丹麥 ORIGIO)按照3∶1的比例充分混勻后分裝至1 mL熱封口高安全性冷凍管(法國(guó) CBS)，然后將其置于液氮上方1 cm處熏蒸10 min，最后置于液氮中保存1 h。復(fù)蘇方法是將睪丸組織懸液標(biāo)本從液氮中取出后室溫放置1 min，然后置于37℃水浴 6 min。復(fù)蘇后的睪丸組織懸液再次按上述方法進(jìn)行濕片鏡檢，記錄睪丸精子數(shù)和活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織懸液體外培養(yǎng)后精子活力改變和冷凍復(fù)蘇結(jié)局

85例非梗阻性無精子癥患者行顯微睪丸切開取精術(shù)后獲得的睪丸組織懸液，經(jīng)34℃體外培養(yǎng)16～24 h后，5.77%(3/52)術(shù)后未見精子組的睪丸組織懸液可見不動(dòng)精子；15.79%(3/19)術(shù)后可見活動(dòng)精子組的睪丸組織懸液未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)精子；35.71%(5/14)術(shù)后未見活動(dòng)精子組的睪丸組織懸液發(fā)現(xiàn)活動(dòng)精子，其中7.14%(1/14)術(shù)后未見活動(dòng)精子組睪丸組織懸液經(jīng)體外培養(yǎng)20 h后濕片可見前向運(yùn)動(dòng)精子。34℃體外培養(yǎng)16～24 h后含有活動(dòng)精子的睪丸組織懸液經(jīng)冷凍復(fù)蘇后有61.90%(13/21)仍可見活動(dòng)精子。詳見下頁(yè)表1。

表1 顯微睪丸切開取精術(shù)獲得睪丸組織懸液體外培養(yǎng)和冷凍復(fù)蘇結(jié)局(n=85)

2.2 睪丸組織懸液體外培養(yǎng)不同時(shí)間后對(duì)睪丸精子及其冷凍復(fù)蘇結(jié)局的影響

睪丸組織懸液手術(shù)當(dāng)日未見精子組，經(jīng)體外培養(yǎng)后，18 h、20 h、24 h組各有1例見不動(dòng)精子，體外培養(yǎng)16 h、21 h、22h、23 h組仍未見精子，各組間睪丸精子數(shù)量和活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；手術(shù)當(dāng)日見活動(dòng)精子組，經(jīng)體外培養(yǎng)后，16 h、21 h、23 h組各有1例僅見不動(dòng)精子，18 h、20 h、22 h、24 h組仍見活動(dòng)精子，各組間睪丸精子活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；手術(shù)當(dāng)日僅見不動(dòng)精子組，經(jīng)體外培養(yǎng)后，20 h、21 h、23 h組各有1例見到活動(dòng)精子，24 h組有2例見到活動(dòng)精子，16 h、22 h組仍僅見不動(dòng)精子，各組間睪丸精子活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。睪丸組織懸液經(jīng)34℃體外培養(yǎng)16～24 h后仍見活動(dòng)精子的行冷凍復(fù)蘇，體外培養(yǎng)18 h、20 h組復(fù)蘇后均有1例僅見不動(dòng)精子，體外培養(yǎng)24 h組復(fù)蘇后有3例僅見不動(dòng)精子，其余均見活動(dòng)睪丸精子；21 h、22 h組復(fù)蘇后均可見活動(dòng)精子。各組間比較采用χ2檢驗(yàn)，34℃體外培養(yǎng)睪丸組織懸液16 h、18 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h后，手術(shù)當(dāng)日3組的睪丸精子活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

表2 不同體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)睪丸組織懸液精子及其冷凍復(fù)蘇結(jié)局的影響(n=85)

3 討論

體內(nèi)精子成熟是精子獲得前向運(yùn)動(dòng)和受精潛能的過程。睪丸精子在生理上是不成熟的，在活組織檢查后常常是不動(dòng)的或有細(xì)微的抽搐運(yùn)動(dòng)[2]。在體外培養(yǎng)體系中，睪丸體細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞之間的相互作用，甚至是各級(jí)生精細(xì)胞之間的相互作用，可能通過共培養(yǎng)系統(tǒng)來促進(jìn)睪丸精子的成熟，故本研究采用睪丸組織懸液體外培養(yǎng)，觀察睪丸組織懸液體外培養(yǎng)后睪丸精子的活動(dòng)情況和冷凍復(fù)蘇情況。體外培養(yǎng)時(shí)間的選擇是參照同步睪丸顯微取精的睪丸精子體外培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)，同步睪丸顯微取精通常是在女方取卵前一天的下午或晚上進(jìn)行，然后在取卵當(dāng)日行ICSI[3-4]。如果男方在女方取卵前一天的下午16點(diǎn)取出睪丸精子，那么女方在次日上午取卵后行ICSI的時(shí)間范圍可能是上午8點(diǎn)后，故本研究將睪丸組織懸液體外培養(yǎng)的時(shí)間擬定在16～24 h，每次間隔1 h是想能夠?qū)⒉G丸組織懸液體外培養(yǎng)時(shí)間細(xì)化，為男方睪丸顯微取精和女方取卵時(shí)間提供參考。體外培養(yǎng)睪丸組織懸液選擇34℃，一是根據(jù)正常男性生殖系統(tǒng)的特點(diǎn)，睪丸和附睪溫度低于人體體內(nèi)溫度；二是參照國(guó)內(nèi)其它中心的培養(yǎng)溫度。而37℃是目前復(fù)蘇睪丸精子、附睪精子和射出精子的常用溫度，一般復(fù)蘇后的精子馬上用于人工授精和試管嬰兒，選擇37℃也是基于正常的人體受精溫度即人的精子和卵子是在人體內(nèi)的輸卵管內(nèi)受精。本研究表明35.71%的不動(dòng)睪丸精子經(jīng)體外培養(yǎng)后可見活動(dòng)精子，7.14%的不動(dòng)睪丸精子經(jīng)體外培養(yǎng)后可見前向運(yùn)動(dòng)精子。一方面，也說明睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16～24 h的確可以使一部分精子由不動(dòng)到活動(dòng)，甚至是前向運(yùn)動(dòng)，這跟很多文獻(xiàn)報(bào)道相一致[5-6]。另一方面，也提示睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16～24 h不能使所有不動(dòng)睪丸精子運(yùn)動(dòng)起來。這可能跟睪丸組織懸液體外培養(yǎng)條件、培養(yǎng)液等有關(guān)，也可能跟非梗阻性無精子癥患者本身的病因有關(guān)，需要進(jìn)行下一步的深入研究。

非同步睪丸顯微取精是男方先行睪丸顯微切開術(shù)，進(jìn)行探查，如發(fā)現(xiàn)睪丸精子先行冷凍保存，待女方取卵后再行復(fù)蘇后睪丸精子的ICSI。由于冷凍和新鮮睪丸精子在受精率、妊娠率、種植率和分娩率等方面的結(jié)果相似[7-9]，冷凍睪丸精子又可以避免同步顯微睪丸切開取精術(shù)失敗所導(dǎo)致的夫精I(xiàn)CSI周期取消，所以冷凍睪丸精子是比較好的輔助生殖策略。使用睪丸精子行ICSI的關(guān)鍵是找到活動(dòng)睪丸精子，由于冷凍復(fù)蘇過程對(duì)精子有不同程度的損傷，所以評(píng)估復(fù)蘇后睪丸精子的一個(gè)有效指標(biāo)是睪丸精子是否活動(dòng)。本研究對(duì)34℃體外培養(yǎng)16～24 h仍有活動(dòng)精子的睪丸組織懸液行冷凍保存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍復(fù)蘇后有61.90%的睪丸組織懸液仍可見活動(dòng)精子，證明對(duì)有活動(dòng)精子的睪丸組織懸液進(jìn)行冷凍保存是可行的。到目前為止，有關(guān)體外培養(yǎng)后冷凍復(fù)蘇睪丸精子的ICSI結(jié)局研究極少。2015年，有研究提出睪丸活檢后精子額外培養(yǎng)24 h盡管提高了運(yùn)動(dòng)能力，但冷凍前額外培養(yǎng)24 h對(duì)ICSI結(jié)局有潛在的負(fù)面影響，尤其是對(duì)分娩率，建議睪丸活檢當(dāng)天冷凍睪丸精子[10]。該研究的不足是體外培養(yǎng)后冷凍復(fù)蘇睪丸精子的ICSI周期數(shù)少，仍需大樣本的結(jié)果支持。除此之外，未見有關(guān)體外培養(yǎng)后冷凍復(fù)蘇睪丸精子的ICSI結(jié)局研究的文獻(xiàn)。

本研究表明，顯微睪丸切開取精術(shù)獲得的睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16 h、18 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h后3組的睪丸精子活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示人類精子庫(kù)和生殖中心實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況對(duì)睪丸組織懸液行34℃體外培養(yǎng)16～24 h。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16～24 h后5.77%未見精子的睪丸組織懸液發(fā)現(xiàn)了不動(dòng)睪丸精子，這可能跟體外培養(yǎng)使睪丸組織中的精子游離到培養(yǎng)液中有關(guān)；睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16～24 h后35.71%不動(dòng)精子懸液可見活動(dòng)睪丸精子，甚至可見前向運(yùn)動(dòng)睪丸精子，這說明體外培養(yǎng)可以促進(jìn)精子活動(dòng)，這跟一些已有的報(bào)道相一致[6,10-11]。到目前為止，睪丸精子體外培養(yǎng)后改善其運(yùn)動(dòng)的確切機(jī)制尚不清楚。值得注意的是，15.79%術(shù)后可見活動(dòng)精子的睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16～24 h后未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)精子，提示34℃體外培養(yǎng)睪丸組織懸液可能存在負(fù)面影響。這與已有的一些報(bào)道相似[12-15]，可能原因是精子細(xì)胞質(zhì)中缺乏抗氧化劑[12]，而體外培養(yǎng)過程中產(chǎn)生活性氧，這些活性氧對(duì)精子DNA完整性有負(fù)面影響[13-15]，從而導(dǎo)致精子死亡、活動(dòng)力降低。針對(duì)這個(gè)原因也有研究人員提出相反觀點(diǎn)，Schiewe MC等[6]認(rèn)為體外培養(yǎng)后活性氧含量升高是無害的。相反，少量活性氧的產(chǎn)生是精子生命活動(dòng)所必需的[16]，培養(yǎng)過程中過量聚集活性氧才對(duì)對(duì)精子產(chǎn)生毒性，有研究建議睪丸精子體外培養(yǎng)時(shí)間不要超過48 h[2,11]。所以，睪丸組織懸液體外培養(yǎng)后活力降低的原因仍有爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)顯微睪丸切開取精術(shù)獲得的睪丸組織懸液34℃體外培養(yǎng)16～24 h進(jìn)行了回顧性分析，為睪丸精子體外培養(yǎng)提供了參考數(shù)據(jù)，但仍需在體外培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液選擇、睪丸組織懸液處理方法等對(duì)睪丸精子活力和冷凍復(fù)蘇結(jié)局以及對(duì)ICSI結(jié)局影響方面進(jìn)行進(jìn)一步研究，擬探索出手術(shù)獲得睪丸組織的最佳處理方案。