杉木葉片揮發(fā)物中對雀麗毒蛾的活性成分鑒定*

賴 略 徐金柱 秦長生 凌斯全田龍艷 楊 華 張春花 邱華龍

(1.河源市森林病蟲害防治服務(wù)中心，廣東 河源 517000; 2.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

杉木Cunninghamia lanceolata主要分布在中國和越南，因其生長快、易成活、材性好，是我國南方諸省主要的速生用材樹種[1]。杉木病蟲害的爆發(fā)是影響杉木生長和品質(zhì)的重要因素之一[2]，因此，病蟲害防治是杉木林經(jīng)營管理的重要內(nèi)容之一。雀麗毒蛾Calliteara melliCollenette 隸屬于鱗翅目，毒蛾科，在中國分布于廣東、廣西、福建、江西、浙江、貴州、四川等主要杉木產(chǎn)區(qū)，主要以幼蟲取食杉樹針葉，嚴(yán)重發(fā)生時可將針葉全部食光，被害處僅留葉基部分，地面一片蟲糞，嚴(yán)重影響杉木生長，是我國南方杉木林內(nèi)重要的食葉害蟲之一（圖1）。近年來南方杉木林種植面積較大，該害蟲在杉木主產(chǎn)區(qū)爆發(fā)成災(zāi)[3]。目前主要是利用化學(xué)農(nóng)藥對該害蟲進(jìn)行防治[4]，雖然保障了林產(chǎn)品安全，但是大量使用高毒化學(xué)農(nóng)藥不僅污染和破壞生態(tài)環(huán)境大量及大面積用藥而且殺傷天敵、使害蟲容易產(chǎn)生抗藥性。因此，研究更為安全、高效、無殘留的雀麗毒蛾防治技術(shù)勢在必行。

圖1 雀麗毒蛾蟲態(tài)及對杉木的危害狀Fig.1 Images of developmental states of C. melli Collenette and its damage symptoms to C. lanceolata

在昆蟲與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化過程中，植食性昆蟲主要利用密布在其觸角上的氣味感受器接收和識別寄主植物氣味進(jìn)行寄主定位、取食或產(chǎn)卵[5-6]。利用植食性昆蟲與寄主植物的化學(xué)通訊進(jìn)行害蟲發(fā)生測報及防治已在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用，并依據(jù)這種化學(xué)通訊成功開發(fā)了針對不同昆蟲的高效植物源引誘劑[7]。然而，目前尚未見與雀麗毒蛾通過寄主植物的揮發(fā)性氣味進(jìn)行識別和定位有關(guān)的報道。本研究分析鑒定了杉木葉片的揮發(fā)性氣味組成，并測試了這些揮發(fā)物對雀麗毒蛾雌雄成蟲的觸角電生理反應(yīng)，以期為雀麗毒蛾的有效監(jiān)測及防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雀麗毒蛾采集與飼養(yǎng)

2020 年4—9 月在廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)小坑林場和樂昌市龍山林場采集雀麗毒蛾幼蟲，將其放入養(yǎng)蟲籠中帶回實驗室。再將樣本置于環(huán)境條件為溫度（25±1）℃、相對濕度80%左右和光周期L : D=12 h : 12 h 養(yǎng)蟲室內(nèi)，用新鮮的杉木葉片飼喂幼蟲，直至其羽化出成蟲。

1.2 杉木葉片揮發(fā)物的提取與鑒定

將表面洗凈晾干的杉木葉片20 g 放在色譜純的正己烷中浸泡15 min 以收集杉木葉片的揮發(fā)性物質(zhì)，用無水硫酸鈉去除多余水分后，用帶過濾膜的移液器將樣品轉(zhuǎn)移到2 mL 樣品瓶內(nèi)，并用氮吹儀濃縮到適合的濃度，保存在-20 ℃冰箱內(nèi)待用。用安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS：7890B-5977B）對杉木葉片揮發(fā)物進(jìn)行分析鑒定。氣相色譜GC 的型號為安捷倫7890B，色譜柱為HP-5ms 毛細(xì)管色譜柱 (長度為30 m,內(nèi)徑為0.25 mm，內(nèi)壁的膜厚度為0.25 μm)，柱流量為1 mL/min，以99.999%高純氮氣作為載氣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，柱箱程序升溫程序為：50 ℃保留 1 min，然后以10 ℃/min 升至250 ℃并保留1 min。進(jìn)樣分流比為15 : 1。MS 條件為：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲5 min，離子掃描范圍50-350 m/z。C7-C40 正構(gòu)烷烴混合物的樣品用來計算目標(biāo)化合物的保留指數(shù)，保留指數(shù)計算公式參照文獻(xiàn)中的計算公式計算[8]。根據(jù)NIST17 譜庫中的特征離子片段及化合物的保留指數(shù)對化合物進(jìn)行鑒定。選取NIST 普庫比對給出的化合物中匹配值最大的化合物（匹配值需大于90%）作為鑒定得到的化合物，當(dāng)給出的最大匹配度仍小于90%時，將該化合物定性為未知化合物。保留峰面積大于最大峰面積的1%的峰進(jìn)行化合物相對百分含量計算，同時購買標(biāo)準(zhǔn)品對已初步鑒定的部分化合物進(jìn)行確認(rèn)。

1.3 杉木葉片揮發(fā)物對雀麗毒蛾的觸角電位測試

用氣象色譜-觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)測試雀麗毒蛾觸角對杉木葉片揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)。GC 的進(jìn)樣口溫度、升溫條件、色譜柱規(guī)格和柱流量等氣象色譜條件與GC-MS 分析的相同。利用荷蘭Syntech 公司的EAG 昆蟲觸角電位記錄儀測定揮發(fā)物引起昆蟲的觸角電生理反應(yīng)大小。首先沿蛾子觸角基部將觸角剪下，并在觸角尖部用小刀將表皮切開一個細(xì)口，然后將觸角連接到觸角電位儀的兩個玻璃電極上。GC 和EAD 的樣品分流比為1 : 1。采用手動進(jìn)樣2 μL，并為不分流模式，測試蛾子的觸角電生理反應(yīng)。每次實驗重復(fù)6 根觸角以上，至少重復(fù)3 次以上都有反應(yīng)的化合物質(zhì)則被判定為有活性的化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木葉片揮發(fā)物鑒定

GC-MS 分析和NIST 譜庫比對表明，從杉木葉片中共分離出13 種化合物（圖2），通過標(biāo)準(zhǔn)品、離子碎片信息及保留指數(shù)等信息，鑒定了其中10 個化合物，其中8 個為萜類化合物，包括2個半萜化合物，5 個倍半萜化合物，一個二萜類化合物，另外一個烷烴和一個烯烴化合物；在出峰時間為17.281、17.489 和18.171 min 的3 個峰由于和NIST 普庫比對得到的相似性較低，暫時無法鑒定（表1）。所有揮發(fā)物當(dāng)中，二萜化合物松柏烯的相對含量最高，為48.68%，其次依次為為α-蒎烯8.51%、β-瑟林烯7.17%、α-瑟林烯6.09%、β-欖香烯4.28%。

圖2 杉木葉片揮發(fā)物的GC-MS 總離子流圖Fig.2 Total Ion chromatogram of hexane extracts from C. lanceolata leaves

表1 杉木葉片揮發(fā)物組分及相對含量Table1 Compounds and relative contents of volatiles from C. lanceolata leaves

2.2 杉木葉片對雀麗毒蛾有觸角電生理反應(yīng)的活性物質(zhì)

GC-EAD 檢測結(jié)果表明，杉木葉片揮發(fā)物中有6 種化合物（P1-P3、P6、P7、P12）能引起雌雄成蟲的觸角電生理反應(yīng)（圖3）。通過保留指數(shù)和GC-MS NIST 譜庫鑒定的物質(zhì)進(jìn)行比較，確定這6 種物質(zhì)均為萜類化合物，分別為：α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯和1-二十四烯。其中α-蒎烯、β-欖香烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯和1-二十四烯均能引起雌蟲和雄蟲的觸角反應(yīng)，但是β-蒎烯只能引起雌蟲的觸角反應(yīng)。這6 種活性物質(zhì)和譜庫鑒定的化合物離子碎片對比信息如圖4 所示。

圖3 杉木葉片揮發(fā)物對雀麗毒蛾雌蟲、雄成蟲的觸角電位反應(yīng)圖Fig. 3 Electroantennogram of antennae of C. melli Collenette to volatiles of C. lanceolata leaves

圖4 對雀麗毒蛾具有電生理活性的6 種揮發(fā)物成分的離子碎片圖Fig. 4 Mass spectrograms of six volatiles that induce antennal electrophysiological effect of C. melli Collenette

3 結(jié)論

目前對于雀麗毒蛾的防治措施主要包括人工防治、燈光誘殺和化學(xué)藥劑防治。人工防治是根據(jù)雀麗毒蛾11 月上中旬老熟幼蟲爬到樹下的隱蔽場所越冬的習(xí)性進(jìn)行人工摘繭。物理防治是利用該成蟲有趨光性特點在成蟲羽化盛期進(jìn)行燈光誘殺?；瘜W(xué)防治是在幼蟲低齡期利用苦參堿或溴氰菊酯等化學(xué)藥劑進(jìn)行噴霧防治[4,9]。由于越冬幼蟲比較隱蔽，不易發(fā)現(xiàn)，人工防治比較費時費力。在杉木林區(qū)燈誘時發(fā)現(xiàn)，杉梢小卷蛾的趨光性較強，而雀麗毒蛾趨光性較弱，每次能誘集到很多杉梢小卷蛾，而只能誘集到零星幾頭雀麗毒蛾，因此推測利用誘殺燈光對雀麗毒蛾引誘效果不理想。利用化學(xué)防治雖然短期內(nèi)會有一定效果，但是杉木林面積較大，且地形較復(fù)雜，大面積噴灑化學(xué)藥劑成本較高，而且會對生態(tài)污染造成破壞。綜上所述，有必要開發(fā)針對性較強的、可用于雀麗毒蛾監(jiān)測和防治的引誘劑研發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)杉木葉片揮發(fā)性化合物主要為萜類化合物，而且以倍半萜化合物的數(shù)量最多，其中，二萜化合物松柏烯的相對含量高達(dá)48.68%，其次為α-蒎烯和β-瑟林烯等其它萜烯類化合物。本研究首次報道松柏烯在杉木葉片中存在，而且相對含量最高，但是未明確其對雀麗毒蛾有活性。松柏烯是松節(jié)油、五針?biāo)伤芍?、云南紅豆杉內(nèi)生真菌的主要次生代謝產(chǎn)物[10-12]。松柏烯不僅是香料的提取原料，而且對白色念珠菌、金黃色葡球菌、枯草桿菌等致病真菌及癌癥具有一定的抑制作用[12-13]。

在所有揮發(fā)物中，有6 種萜烯類揮發(fā)物能夠引起雀麗毒蛾成蟲的觸角電生理反應(yīng)，其中β-蒎烯只引起雌蟲的觸角電生理反應(yīng)，而對雄蟲沒有觸角反應(yīng)。萜烯類化合物是植物芳香性氣味的主要成分，對植食性害蟲及害蟲天敵的行為具有重要的調(diào)控作用[14-15]。本研究篩選的對雀麗毒蛾成蟲具有觸角電生理活性的化合物，可以作為雀麗毒蛾引誘劑的重要候選物質(zhì)。其中β-蒎烯只引起雌蟲的觸角反應(yīng)，可以作為對雀麗毒蛾雌雄成蟲具有特異性的引誘劑開發(fā)候選物質(zhì)，以用于不同性別蟲態(tài)的精準(zhǔn)監(jiān)測。