番石榴葉精油對曲紋紫灰蝶的驅(qū)避活性和觸角電生理*

黃 華 凌斯全 邱華龍 鐘家美 徐金柱

（1.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520；2.廣東省肇慶市封開縣林業(yè)局森林病蟲害防治檢疫站，廣東 肇慶 526500）

曲紋紫灰蝶Chilades pandava隸屬鱗翅目Lepidoptera 灰蝶科Lycaenidae 紫灰蝶屬Chilades，是我國外來入侵害蟲。該蟲從90 年代中后期開始傳入我國大陸，現(xiàn)已廣泛分布于廣西、廣東、海南、福建等10 多個?。ㄗ灾螀^(qū)）[1]。曲紋紫灰蝶幼蟲食性較為單一，寄主為蘇鐵屬植物，以幼蟲群集啃食新梢、莖端組織和球花，形成缺刻，為害嚴(yán)重時嫩葉被吃光，球花萎靡干枯倒垂，胚珠、花粉不能成熟[2-4]，抽芯連續(xù)受害后，植株生長緩慢或枯死[4]，嚴(yán)重影響蘇鐵的生長繁殖和資源保存，影響城市園林綠化美觀和經(jīng)濟效益。目前，主要使用化學(xué)農(nóng)藥來防控曲紋紫灰蝶，但因其世代重疊，蟲卵小、幼蟲多隱藏于蘇鐵羽葉背面，不易被發(fā)現(xiàn)而錯過最佳防治時期，并且成蟲遷徙能力強，飛離施藥區(qū)域從而規(guī)避農(nóng)藥，給防治帶來困難[5]。此外，蘇鐵作為城市園林的重要景觀樹種，過量、頻繁噴施化學(xué)農(nóng)藥使曲紋紫灰蝶產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致藥劑的使用劑量加大，對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生不良影響。

植物精油又稱揮發(fā)油，是植物體內(nèi)分子量較小的一類次生代謝產(chǎn)物，其主要化學(xué)成分為萜類、芳香族、脂肪族和含氮含硫等揮發(fā)性有機化合物[6]。植物精油含有豐富的活性成分，對昆蟲具有熏蒸、驅(qū)避、觸殺和抑制生長發(fā)育活性[7]，同時還能影響昆蟲尋找寄主、交配、產(chǎn)卵和取食等行為[8-9]。植物精油具有對人畜安全、易降解、無殘留等優(yōu)點[10]，近年來已成為害蟲防治研究的熱點。

番石榴Psidium guajava含有豐富的植物次生代謝物，如酚類、黃酮類、類胡蘿卜素、三萜類和精油等成分，具有良好的保健功效[11-12]。已有研究表明，番石榴葉精油對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有驅(qū)避作用[13-15]，且可抑制害蟲的取食行為[16]，是潛在的昆蟲行為調(diào)控劑，在城市園林害蟲的防治上同樣具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析了番石榴葉精油的化學(xué)組成，同時測定了本精油及其主要成分對曲紋紫灰蝶的驅(qū)避活性和觸角電生理活性。旨在探索利用番石榴葉精油及其主要活性成分作為曲紋紫灰蝶的植物源驅(qū)避劑，為曲紋紫灰蝶的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設(shè)備

曲紋紫灰蝶幼蟲采集于肇慶市封開縣縣人民政府廣場的蘇鐵Cycas revoluta新梢上，將幼蟲連帶新梢轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲籠于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)（26±1 ℃，濕度70%～80%，光周期16/8 h）。羽化后，放入一團含20%蜂蜜水的脫脂棉供成蟲取食。珍珠番石榴葉片采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝教學(xué)實驗基地，室內(nèi)陰涼處風(fēng)干后備用。

主要試劑：(E)-β-石竹烯（＞ 90%），梯希愛（上海）有限公司；C7～C30 飽和烷烴混標(biāo)（1 mg/mL，正己烷配制），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；正己烷（色譜純），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；其他一些試劑為國產(chǎn)分析純。主要設(shè)備：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（8890-5977B GCMS），美國Agilent；氣相色譜-觸角電位儀（GCEAD），荷蘭Syntech；Y 型嗅覺儀（臂長20 cm，夾角80°，內(nèi)徑3 cm）和精油蒸餾萃取裝置，廣州市精科化玻儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 番石榴葉精油的提取與化學(xué)成分分析 采用水蒸氣蒸餾法提取番石榴葉精油[17]。將陰干的番石榴葉粉碎，過20 目篩，取50 g 粉末，置于2 000 mL 圓底燒瓶中，加入500 mL 蒸餾水，打開電熱套加熱圓底燒瓶至沸騰，并一直保持微沸直至無油狀物流出為止（約5 h）。用二氯甲烷萃取餾出液，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除二氯甲烷，精油置于棕色瓶中，密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

番石榴葉精油用正己烷稀釋至0.5 μL/mL (v/v)，然后在Agilent GC-MS 上對組分進(jìn)行分析。進(jìn)樣量為1 μL，無分流模式，進(jìn)樣口、連接口和四極桿溫度分別為250 ℃、280 ℃和150 ℃，載氣為氦氣（1.2 mL/min）。色譜柱為HP-5MS（30 m× 0.25 mm × 0.25 μm），升溫程序為：初始溫度60 ℃（保持2 min），4 ℃/min 升溫至150 ℃（保持10 min），然后以8 ℃/min 升溫至250 ℃（保持2 min），最后以10 ℃/min 升溫至280 ℃（保持10 min）。在同樣儀器條件下，以飽和烷烴混標(biāo)（C7～C30）來計算各揮發(fā)物成分的保留指數(shù)（Retention index，RI）[14]。通過匹配NIST17 數(shù)據(jù)庫中化合物的質(zhì)譜特征峰、RI 值以及標(biāo)準(zhǔn)品比對來鑒定揮發(fā)物。采用峰面積歸一化法計算精油各成分的百分含量。

1.2.2 曲紋紫灰蝶嗅覺選擇行為測定 本試驗選用Y 型嗅覺儀測定曲紋紫灰蝶對番石榴葉精油的行為反應(yīng)，參考于金鑫等的方法[18]，有所修改。在Y 型管兩側(cè)臂前方（位于Y 型管中線且距兩側(cè)臂前端均為10 cm，保證照射到兩側(cè)臂的光強一致）放置一個10 w 燈泡，利用趨光性來提高曲紋紫灰蝶的出管選擇率。將番石榴葉精油用正己烷稀 釋 至0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 或5 μL/mL，吸取10 μL 稀釋后的精油滴入200 mL 洗氣瓶內(nèi)的濾紙片上，以10 μL 正己烷為對照，然后連通Y 型嗅覺儀，氣流設(shè)定為200 mL/min。從Y 型管主臂端口釋放曲紋紫灰蝶雌成蟲，在5 min 內(nèi)，試蟲在Y 型管某一側(cè)臂內(nèi)前進(jìn)超過臂長三分之一則認(rèn)為該試蟲選擇了該臂。未選擇任何側(cè)臂以及在側(cè)臂內(nèi)前進(jìn)不超過三分之一的試蟲則被視為無反應(yīng)試蟲。每測試10 頭試蟲后，調(diào)換Y 型管兩側(cè)臂的位置，消除幾何位置對試蟲的影響。測試40頭試蟲后，更換另一支干凈的Y 型管繼續(xù)試驗。已用過的Y 型管則用酒精清洗，烘干備用。每濃度測試40 頭曲紋紫灰蝶雌成蟲。測試時間為每天的8:00—17:00 時，室內(nèi)條件為溫度26±1 ℃，濕度70%～80%，光周期16/8 h。按照以下公式計算驅(qū)避率：驅(qū)避率（%）=（選擇對照的蟲數(shù)-選擇精油的蟲數(shù)）/選擇對照的蟲數(shù)×100%。

將(E)-β-石竹烯稀釋至0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 或5 μL/mL，以正己烷為對照，以同樣的方法測定曲紋紫灰蝶對(E)-β-石竹烯的嗅覺行為反應(yīng)。

1.2.3 曲紋紫灰蝶觸角電位測定 采用GC-EAD測定曲紋紫灰蝶觸角對番石榴葉精油組分的觸角電位反應(yīng)。在體視鏡下將曲紋紫灰蝶雌成蟲觸角從基部切下，切掉觸角尖部一節(jié)（約1 mm）。把觸角的兩端分別連接已吸取0.9%生理鹽水的毛細(xì)玻璃管，兩根毛細(xì)玻璃管分別連接參考極和測量極，完成觸角與電極的搭連[19]。色譜柱為HP-1（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），進(jìn)樣口和檢測器溫度分別為250 ℃和280 ℃，升溫程序與GC-MS分析相同。番石榴葉精油經(jīng)正己烷稀釋至0.5 μL/mL，取2 μL 手動進(jìn)樣，經(jīng)色譜柱分離后1 ∶1 分流至FID（氫火焰離子化檢測器）和EAD。GcEad 2014 軟件（Syntech）采集氣相色譜和觸角電位反應(yīng)數(shù)據(jù)。重復(fù)測試5 頭雌蟲觸角，每次重復(fù)中均有電位變化的表示觸角對該揮發(fā)物有電位反應(yīng)。

此外，測定曲紋紫灰蝶對不同濃度（0.005、0.01、0.05 和0.1 μL/mL）的(E)-β-石竹烯的觸角電位反應(yīng)，每濃度5 次重復(fù)，測定方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS statistics v23.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗分析Y 型嗅覺選擇行為試驗中選擇兩臂試蟲的差異，采用Duncan’s 檢驗比較多組數(shù)據(jù)間的差異，P＜ 0.05 或0.01 表示差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 番石榴葉精油化學(xué)成分

采用水蒸氣蒸餾法獲得0.21 mL 番石榴葉精油，提取率為0.42%。GC-MS 的總離子流圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離良好，有利于揮發(fā)物的質(zhì)譜鑒定（圖1）。番石榴葉精油含有46 種揮發(fā)物，通過與NIST 數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)比對，共鑒定38 種揮發(fā)物，其中(E)-β-石竹烯含量最高，為32.47%（表1）。其它主要成分依次為α-古巴烯（10.44%）、菖莆烯（8.19%）、藍(lán)桉醇（7.19%）、香橙烯（5.01%）、β-紅沒藥烯（3.99%）、葎草烯（3.79%）、δ-杜松醇（2.54%）、表-α-依蘭油醇（2.13%）、檸檬烯（2.10%）和α-紅沒藥烯（2.05%）等。分類分析表明，精油成分主要為倍半萜和氧化倍半萜，含量分別為74.75%和19.25%，而單萜及其氧化物含量較低，僅為2.81%和0.33%。

表1 番石榴葉精油成分及含量分析Table 1 Essential oil compositions and contents of guava leaves

注：1-單萜，2-氧化單萜，3-倍半萜，4-氧化倍半萜，5-其它。Note: 1-Monoterpene hydrocarbons，2-Oxygenated monoterpenes，3-Sesquiterpene hydrocarbons，4-Oxygenated sesquiterpenes，5-Others.

圖1 番石榴精油GC-MS 總離子流色譜圖Fig. 1 GC-MS total ion current chromatogram of guava leaf oil

2.2 番石榴葉精油對曲紋紫灰蝶的驅(qū)避活性

Y 型嗅覺儀測定的結(jié)果表明，番石榴葉精油濃度低于0.05 μL/mL 時，對曲紋紫灰蝶的嗅覺選擇行為無顯著影響，而當(dāng)精油濃度為0.1～5.0 μL/mL 時，曲紋紫灰蝶對精油的選擇率分別為35.29%、21.21%、25.81% 和23.53%，顯著低于(P＜0.05)對照（圖2a）。根據(jù)精油各成分的含量，本試驗選取主要成分(E)-β-石竹烯進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，(E)-β-石竹烯同樣影響曲紋紫灰蝶的行為，在濃度為0.05～5.00 μL/mL 時抑制曲紋紫灰蝶的選擇（圖2b），表現(xiàn)出顯著(P＜0.05)的驅(qū)避作用。

圖2 番石榴葉精油和(E)-β-石竹烯對曲紋紫灰蝶嗅覺選擇行為的影響Fig. 2 Effect of guava leaf oil and (E)-β-caryophyllene on the olfactory selection of C. pandava

計算不同濃度番石榴葉精油和(E)-β-石竹烯對曲紋紫灰蝶的驅(qū)避率，結(jié)果如表2 所示。濃度為0.005～0.5 μL/mL 時，隨著番石榴葉精油濃度的升高，驅(qū)避率逐漸升高，并且在0.5 μL/mL 時，驅(qū)避率達(dá)73.08%。在測試濃度下，(E)-β-石竹烯對曲紋紫灰蝶的驅(qū)避率（y）與化合物濃度的log10對數(shù)（x）呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（R2=0.93），濃度為0.1 μL/mL 時的驅(qū)避率為58.33%，而0.5 μL/mL 的驅(qū)避率為68.00%，略低于相同濃度的番石榴葉精油。

表2 番石榴葉精油和(E)-β-石竹烯對曲紋紫灰蝶的驅(qū)避活性Table 2 Repellent activities of guava leaf oil and (E)-β-caryophyllene against C. pandava

2.3 曲紋紫灰蝶對番石榴葉精油和(E)-β-石竹烯的觸角電位反應(yīng)

采用GC-EAD 鑒定和分析了番石榴葉精油成分對曲紋紫灰蝶的觸角電位活性。從圖3a 中可知，曲紋紫灰蝶對α-蒎烯、檸檬烯、α-古巴烯、(E)-β-石竹烯、香橙烯、葎草烯、β-紅沒藥烯和菖莆烯有明顯的觸角電位反應(yīng)，其中對(E)-β-石竹烯的反應(yīng)最強，其次是α-古巴烯和檸檬烯。根據(jù)本試驗和行為測定的結(jié)果，進(jìn)一步測定了曲紋紫灰蝶對主要成分(E)-β-石竹烯的觸角電位反應(yīng)。如圖3b 所示，0.005～0.1 μL/mL 的(E)-β-石竹烯均能引起觸角電位變化，并且隨著化合物濃度的升高觸角電位變化越明顯，平均值分別為-0.010、-0.015、-0.038 和-0.142 mV，具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 番石榴葉精油和(E)-β-石竹烯對曲紋紫灰蝶觸角電生理的影響Fig. 3 Effect of guava leaf oil and (E)-β-caryophyllene on the electroantennography of C. pandava

3 結(jié)論與討論

植物精油是植物用來保護(hù)自身的重要次生代謝物質(zhì)，單萜和倍半萜及其衍生物是其主要成分，并且對昆蟲具有較強的行為和生理干擾作用[20]。目前，科學(xué)界在植物精油對農(nóng)業(yè)害蟲驅(qū)避效果方面的研究進(jìn)行了大量的探討，但對觀賞植物上的曲紋紫灰蝶的驅(qū)避作用研究還較少。

本研究采用GC-MS 對番石榴葉精油的化學(xué)組成進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，番石榴葉精油中主要含有46 種揮發(fā)物，共鑒定38 種，主要是倍半萜及其氧化物（相對含量＞90%），其中(E)-β-石竹烯的含量最高（32.47%），與前人的研究結(jié)果相一致[14,21]?；钚詼y定表明，番石榴葉精油對曲紋紫灰蝶雌成蟲具有顯著的驅(qū)避作用，在0.5 μL/mL時，驅(qū)避率達(dá)73.08%，但隨著濃度的進(jìn)一步升高，但驅(qū)避率不顯著變化，其原因尚不清楚。番石榴葉精油的主要成分(E)-β-石竹烯對曲紋紫灰蝶同樣具有驅(qū)避作用，在0.5 μL/mL 時的驅(qū)避率為68.00%。GC-EAD 測試結(jié)果表明，番石榴葉精油中多種揮發(fā)物成分引起曲紋紫灰蝶觸角的電位變化，其中(E)-β-石竹烯的作用最為明顯，并且具有明顯的濃度依賴性，表明(E)-β-石竹烯是番石榴葉精油對曲紋紫灰蝶有驅(qū)避活性的主要成分。已有研究表明，一定濃度的(E)-β-石竹烯及其氧化物對柑橘木虱和橘小實蠅等害蟲有驅(qū)避或行為干擾作用[22-24]。因此，番石榴葉精油及(E)-β-石竹烯具有進(jìn)一步開發(fā)為曲紋紫灰蝶植物源驅(qū)避劑的潛力。

植物精油中含量高的主要成分的驅(qū)避作用往往弱于精油本身的活性，而幾種精油單組分化合物混配后驅(qū)避效果往往優(yōu)于其單劑驅(qū)避效果，表明植物精油對害蟲的驅(qū)避活性可能是各組分之間的協(xié)同作用[9,25]。例如，鄰二甲苯（10-4）和(E)-β-石竹烯（10-6）在混配后對普通大薊馬Megalurothrips usitatus表現(xiàn)出極顯著的驅(qū)避作用[26]。本研究中，除(E)-β-石竹烯外，α-蒎烯、檸檬烯、α-古巴烯、香橙烯、葎草烯、β-紅沒藥烯和菖莆烯也能引起曲紋紫灰蝶觸角電位的變化，表明這些揮發(fā)物成分也可能影響曲紋紫灰蝶的行為，并且可能和(E)-β-石竹烯發(fā)揮協(xié)同作用。因此，加強植物精油有效成分協(xié)同作用的研究對提升曲紋紫灰蝶的防控效果具有重要意義。后期試驗擬進(jìn)一步鑒定番石榴葉精油中含量較低的驅(qū)避活性成分，探究多種驅(qū)避活性成分間的協(xié)同增效作用，并進(jìn)行田間試驗。