副豬嗜血桿菌病檢測(cè)技術(shù)

黃 利，袁東波，曹省艷，尹念春

（1.四川省閬中市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 閬中 637400；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.四川省綿陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽(yáng) 621000；4.四川省遂寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 遂寧 629000）

副豬嗜血桿菌病又稱(chēng)多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，由副豬嗜血桿菌（Hps）引起。

病豬主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、行動(dòng)障礙等。該病2 周齡至4 月齡仔豬，特別是斷奶期和保育期仔豬多發(fā)，發(fā)病率可高達(dá)40%，病死率達(dá)50%～90%，成年豬病死率稍低。該病多為慢性經(jīng)過(guò)，致病菌易和豬鏈球菌、豬丹毒桿菌和豬放線(xiàn)桿菌等引起敗血性細(xì)菌感染。

1 血清學(xué)檢測(cè)

間接血凝試驗(yàn)（IHA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等基于抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法是常見(jiàn)及快速的副豬嗜血桿菌檢測(cè)方法。

1.1 間接血凝試驗(yàn)（IHA）IHA 檢測(cè)豬抗Hps，其原理是經(jīng)酸處理后的紅細(xì)胞易吸附Hps 抗原，在抗血清存在的環(huán)境下，與紅細(xì)胞發(fā)生凝集。在建立間接血凝試驗(yàn)時(shí)，有研究者提取莢膜作為IHA 抗原，建立了較高特異性和敏感性的檢測(cè)方法。有的將分離的3個(gè)型的菌體超聲產(chǎn)物致敏后作為診斷抗原，建立了檢測(cè)Hps抗體的IHA，其敏感性和特異性都優(yōu)于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

以Hps 7 型GS122 株滅活菌體為抗原，建立了微量凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)方法。研究者利用豬瘟、豬鏈球菌病等9 種常見(jiàn)豬病陽(yáng)性血清檢測(cè)了該方法的特異性，利用4、5、12型檢測(cè)了該方法的交叉反應(yīng)，也進(jìn)行了敏感性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)等，結(jié)果均較好。該方法加速了對(duì)副豬嗜血桿菌7型的疫苗免疫評(píng)價(jià)和流行病學(xué)調(diào)查的進(jìn)度。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）與間接血凝試驗(yàn)相比較，間接ELISA 方法敏感性更高、準(zhǔn)確性更好和特異性更優(yōu)。

選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA 檢測(cè)方法的關(guān)鍵。以莢膜多糖和純化蛋白作為包被抗原的間接ELISA 方法在臨床診斷、免疫評(píng)價(jià)和流行病學(xué)調(diào)查中得到廣泛運(yùn)用?；诩兓腡bpA 蛋白作為包被抗原建立的Hps 抗體間接ELISA 檢測(cè)方法，檢測(cè)免疫抗體陽(yáng)性率高，為免疫實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。以Neu 作為包被抗原構(gòu)建的間接ELISA 檢測(cè)方法具有高特異性。基于黏附素蛋白的ELISA 檢測(cè)方法能有效區(qū)分Hps 陰性血清和陽(yáng)性血清，通過(guò)優(yōu)化參數(shù)，研究了可應(yīng)用于滅活疫苗免疫后的抗體監(jiān)測(cè)和HPS的血清抗體檢測(cè)。

2 病原學(xué)檢查

2.1 細(xì)菌分離 副豬嗜血桿菌分離培養(yǎng)較為困難，采集經(jīng)抗生素治療后的病豬樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)難度更大。理想的Hps樣本應(yīng)來(lái)自既有該病特征性癥狀，又尚未使用抗生素治療的急性發(fā)病豬。

2.2 免疫組化技術(shù)（IHC）由于各種細(xì)菌的交叉感染、繼發(fā)感染，病豬臨床上多表現(xiàn)為非特征性發(fā)病經(jīng)過(guò)，這增加了臨床診斷的難度。

組織學(xué)病變?cè)\斷解決了這一難題，利用福爾馬林固定和石蠟包埋組織的免疫組化法可以敏感、直觀(guān)的檢測(cè)Hps 抗原，但運(yùn)用此方法獲得的抗副豬嗜血桿菌單克隆抗體非常少，限制了此法在臨床診斷上的運(yùn)用，因此其多用于研究發(fā)病機(jī)理。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）有研究者建立了基于SYBR Green I 的快速檢測(cè)Hps 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，其敏感性比常規(guī)PCR 高，試驗(yàn)重復(fù)性好，同時(shí)對(duì)Hps具有良好的特異性，較大提高了臨床診斷中低濃度樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

研究者建立的基于PPV、PCV2、Hps 的三重實(shí)時(shí)定量熒光PCR，解決了臨床中混合感染難以快速診斷的難題，也為三種疫病的免疫程序修訂提供了依據(jù)。

3.2 腸桿菌科基因間重復(fù)序列PCR（ERICPCR）以腸桿菌科基因間重復(fù)序列（ERIC）為引物，可擴(kuò)增未知細(xì)菌的基因序列，從而對(duì)具有菌株特異性的指紋圖譜進(jìn)行分析。

該技術(shù)在菌株特異性分析和描述上較血清學(xué)分型更準(zhǔn)確。在流行病學(xué)調(diào)查中，對(duì)于場(chǎng)點(diǎn)間流行毒株的分析，此技術(shù)體現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)。

3.3 寡核苷酸特異性捕獲圓盤(pán)雜交（OS-CPH）

代替細(xì)菌分離的技術(shù)還有寡核苷酸特異性捕獲圓盤(pán)雜交（OS-CPH）試驗(yàn)，其敏感性可達(dá)到濃度低于100 CFU/mL的細(xì)菌，解決了臨床診斷對(duì)低樣品濃度的限制。該技術(shù)的時(shí)效性也優(yōu)于細(xì)菌培養(yǎng)，可在24 h內(nèi)得到結(jié)果。

在特異性方面，通過(guò)對(duì)15種豬體分離細(xì)菌所提取的DNA 樣品的比較，均為陰性，此技術(shù)在確定發(fā)病豬場(chǎng)的流行情況中得到運(yùn)用。

3.4 基因芯片檢測(cè)技術(shù) 基因芯片技術(shù)在檢測(cè)中的高通量、自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)凸顯。

有研究者建立了Hps和豬細(xì)小病毒基因芯片雙重檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)特異性、重復(fù)性均較好，固定的芯片4 ℃放置2個(gè)月后穩(wěn)定性和重復(fù)性仍然很好，有效提高了臨床診斷的時(shí)效性，也為基因芯片診斷技術(shù)的應(yīng)用提供了前景。

3.5 納米PCR檢測(cè)方法 該方法基于納米流體強(qiáng)大的熱導(dǎo)性，控制PCR反應(yīng)過(guò)程中的溫度和時(shí)間，減少非特異性擴(kuò)增，提高PCR 特異性產(chǎn)物。該技術(shù)在非洲豬瘟病毒檢測(cè)上的運(yùn)用證明，PCR反應(yīng)效率得到有效提升，敏感性大幅提高，最低核酸檢出量達(dá)到10個(gè)拷貝。

有研究者用建立的納米PCR 檢測(cè)Hps 與其他4種豬源細(xì)菌，以驗(yàn)證該納米PCR的特異性，結(jié)果表明無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法的敏感性比普通PCR 高10 倍，最低可檢出4 個(gè)拷貝的Hps基因組DNA。因其較好的特異性和較高的靈敏度，該方法可為副豬嗜血桿菌病的防控和檢驗(yàn)檢疫提供技術(shù)支撐。

3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）該技術(shù)利用Hps 的16S r RNA 序列設(shè)計(jì)引物，在酶的作用下進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增出特異性的產(chǎn)物。

試驗(yàn)證明該方法敏感性比PCR 高，特異性良好，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，1 h 內(nèi)能完成樣品的檢測(cè)，適用于基層進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

4 血清型與毒力因子測(cè)定

副豬嗜血桿菌的毒力在不同血清型之間存在變異，在同一血清型不同菌株之間也存在變異，這種毒力差異可能是由不同的基因表達(dá)方式所導(dǎo)致的。

據(jù)報(bào)道通過(guò)RT-PCR 技術(shù)對(duì)其離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因（cirA）、溶血素相關(guān)基因（hhdBA）、抗菌素相關(guān)基因（copha）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)具有毒力性的血清型中，約有一半多的血清型存在上述情況。