消瘀泄?jié)犸媽毙阅I損傷小鼠自噬水平的影響*

胡佳雯 崔當鴿 周 宇 鄭迷雪 項曉駿#

1 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

2 浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院 浙江 杭州 310020

本研究通過采用缺血再灌注法誘導急性腎損傷（AKI）小鼠模型，以期探討消瘀泄?jié)犸媽KI小鼠的保護作用和潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：8周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠30只。購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005；飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心，動物使用許可證號為SYXK（浙)2020-0024。飼養(yǎng)期間允許自由飲食飲水。

1.2 實驗材料：分述如下。

1.2.1 藥材：生黃芪15g，川牛膝、桃仁、地龍各6g，制大黃5g，車前草10g，配方藥品由醫(yī)院中藥房提供。加水熬制濃縮到500ml，得到濃度為96mg/ml的消瘀泄?jié)犸嫛?/p>

1.2.2 試劑：小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合成酶(NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶（CAT）、ELISA試劑盒(批號：MM-0389M1、MM-0388M1、MM-0453M1、MM-0758R1，購于酶免）?？贵w：LC3A/B、BECLIN 1、SQSTM1/P62、PI3K P85 ALPHA、AKT2、PHOSPHO-MTOR(SER2448)、MTOR、β-ACTIN（批號：AF5402、AF5128、AF5384、AF6241、AF6264、AF3308、AF7803、AF7018，購于 AFFINITY）。山羊抗兔 IGG H&L(HRP)（批號AB97080，購于ABCAM）

1.2.3 設備：C16000型全自動生化檢測儀，雅培公司生產(chǎn)；RM2016病理切片機，上海徠卡儀器有限公司生產(chǎn)；NIKON ECLIPSE E100型正置光學顯微鏡，日本尼康生產(chǎn)；UTP-313型電子天平，上?；ǔ鄙a(chǎn)；EPS300型電泳儀、VE186型轉(zhuǎn)膜儀，天能生產(chǎn)。

1.3 實驗方法：分述如下。

1.3.1 小鼠AKI模型建立：30只C57BL/6小鼠隨機分為5組，術(shù)前禁水12小時。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（45mg/kg），備皮，剪開小鼠背部肋骨下緣皮膚，鈍性分離輸尿管與腎動脈、腎靜脈，用夾子阻斷雙側(cè)腎動脈血液運輸，使腎臟供血受阻。夾持35分鐘后去掉夾子，實現(xiàn)再灌注，假手術(shù)組僅進行鈍性分離操作。AKI模型制備完成后，消瘀泄?jié)犸嫿M小鼠分別進行不同濃度劑量的給藥操作：生藥量96mg/ml、192mg/ml和384mg/ml，連續(xù)14天灌胃。假手術(shù)組和AKI模型組分別給予等體積生理鹽水連續(xù)灌胃14天。

1.3.2 體重、腎臟指數(shù)：測量各組小鼠體重并記錄。行常規(guī)解剖摘取腎臟進行稱重，計算腎臟指數(shù)。

1.3.3 生化指標：取血，收集血清于半自動生化檢測儀中檢測肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）、尿素（UREA）、血尿酸（UA）、總膽固醇（CHO）的含量。

1.3.4 氧化應激指標：參照試劑盒，ELISA法檢測腎臟上清液中SOD、MDA、NOS、GSH-PX、CAT含量。

1.3.5 HE、PAS染色：取腎組織固定，制備石蠟切片。分別行HE和PAS染色，顯微鏡檢拍照分析。

1.3.6 免疫組化：腎組織石蠟切片預處理后加入一抗P62和二抗孵育，進行顯色、封片、鏡檢。

1.3.7 Western Blot檢測：取腎組織樣品，SDS-PAGE電泳，封閉反應后加一抗、二抗孵育，洗膜ECL化學發(fā)光儀顯影，分析蛋白表達量。ECL化學發(fā)光儀顯影，分析蛋白表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 消瘀泄?jié)犸媽KI小鼠體重、腎重和腎臟指數(shù)的影響：如圖1。與假手術(shù)組相比，模型組腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嬛?、高劑量組腎重和腎臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 小鼠體重、腎重變化情況（±s，n=6）

2.2 消瘀泄?jié)犸媽KI小鼠生化指標影響：見表1。與假手術(shù)組相比，模型組血清CRE、BUN、UREA、UA和CHO含量均顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫷?、中、高劑量組血清CRE、BUN、UREA、UA和CHO含量顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 小鼠血清中CRE、BUN、UREA、UA和CHO含量變化情況（±s，n=6）

表1 小鼠血清中CRE、BUN、UREA、UA和CHO含量變化情況（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組消瘀泄?jié)犸嫷蛣┝拷M消瘀泄?jié)犸嬛袆┝拷M消瘀泄?jié)犸嫺邉┝拷MCHO(G/DL)3.57±0.44 18.63±2.18▲▲8.88±0.96★★11.70±0.79★★8.90±1.01★★CRE(UMOL/L)15.98±2.00 49.57±4.76▲▲29.56±2.62★★28.41±2.58★★31.10±3.70★★BUN(MMOL/L)3.75±0.56 19.94±2.00▲▲11.90±1.50★★9.69±0.48★★7.94±0.57★★UREA(MMOL/L)5.15±0.69 19.93±2.40▲▲16.54±1.42★13.85±1.35★★12.05±1.12★★UA(UMOL/L)85.66±9.97 136.92±10.50▲▲106.81±11.03★★111.28± 5.38★★99.86± 9.61★★

2.3 消瘀泄?jié)犸媽KI小鼠腎組織氧化應激的影響：與假手術(shù)組相比，模型組血清中SOD、GSH-PX和 CAT含量顯著性降低，NOS和MDA含量顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫷?、中、高劑量組血清中SOD、GSH-PX和CAT含量顯著性上升，NOS和MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。

圖2 小鼠血清中SOD、MDA、NOS、GSH-PX和CAT含量變化情況（±s，n=6）

2.4 HE染色結(jié)果分析：見圖3，與假手術(shù)組比，模型組出現(xiàn)腎小管擴張，腎間質(zhì)炎性細胞出現(xiàn)大量浸潤，與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫺深A后，腎小管擴張情況得到了改善，并且其中的炎性細胞浸潤也相應減少。

圖3 小鼠腎組織病理學改變（HE染色，200、400倍）

2.5 PAS染色結(jié)果分析：見圖4，對比假手術(shù)組，模型組出現(xiàn)大量的紅色基質(zhì)；對比模型組，可看到用藥后紅色基質(zhì)明顯減少，表明消瘀泄?jié)犸媽τ谀I損傷有一定的修復作用。

圖4 小鼠腎組織病理學改變情況（PAS染色，200、400倍）

2.6 消瘀泄?jié)犸媽KI小鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白P62的影響：見圖5。模型組小鼠腎組織P62蛋白表達量顯著上升；與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫷?、中、高劑量組小鼠腎組織P62蛋白表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 小鼠腎組織中自噬相關(guān)蛋白P62的表達（免疫組化，200、400倍）

2.7 消瘀泄?jié)犸媽KI小鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/MTOR通路的影響：見圖6。與假手術(shù)組比，模型組小鼠腎組織中LC3Ⅱ/Ⅰ、BECLIN1的蛋白表達水平降低，P62、P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-MTOR/MTOR的蛋白表達水平升高。與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫷?、中、高劑量組小鼠腎組織中LC3Ⅱ/Ⅰ、BECLIN1的蛋白表達水平均顯著升高，P62、P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-MTOR/MTOR的蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖6 小鼠腎組織中P62、P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、PMTOR/MTOR蛋白表達情況（±s，n=3）

3 討論

腎臟是維持人體生命活動的重要代謝器官，而AKI會直接影響正常腎功能，使得腎小球濾過率減低，腎小管出現(xiàn)擴張、系膜增生等癥狀，給腎臟帶來嚴重的負擔[1]。魯科達[2，3]等利用5/6腎切除同時低蛋白飲食的方式建立慢性腎衰竭小鼠模型，發(fā)現(xiàn)消瘀泄?jié)犸嬆軌虮Ｗo慢性腎衰竭小鼠腎功能；采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型，研究發(fā)現(xiàn)消瘀泄?jié)犸嬆軌蛴行а泳從I間質(zhì)纖維化程度，因此我們推斷消瘀泄?jié)犸嬁赡茉谥委烝KI過程中亦具有較好的效果。

本研究利用C57BL/6小鼠，通過夾閉腎動脈造成腎缺血再灌注損傷構(gòu)建AKI模型開展實驗。結(jié)果顯示用藥組腎小管擴張及炎性細胞浸潤顯著改善，且高劑量更顯著。活性氧（ROS）會在組織缺血再灌注的過程中大量產(chǎn)生，可造成較為嚴重的氧化應激反應。MDA是不飽和脂質(zhì)氧化反應的終產(chǎn)物，可正向影響氧化應激，而SOD與之相反。結(jié)果顯示，用藥后SOD、GSH-PX和CAT的含量上升，NOS和MDA的含量降低，表明消瘀泄?jié)犸嬁梢愿纳艻/R造成的腎組織氧化應激損傷。

AKI模型中，近端小管的自噬能力降低或缺失將直接影響腎小管的功能。Lawrence J.[4]研究表明，腎臟疾病進展中PI3K/AKT具有至關(guān)重要的作用，參與糖尿病腎病腎功能損傷，且PI3K/AKT也是抑制自噬的主要信號通路。本次研究發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注損傷會造成抑制自噬相關(guān)蛋白表達水平顯著升高，促進自噬相關(guān)蛋白表達水平顯著降低，表明AKI會造成機體自噬能力的降低。而用藥后結(jié)果相反，表明給藥治療能夠促進腎組織自噬，這與劉浩等利用缺血再灌注小鼠所得出的實驗結(jié)論一致。

綜上所述，本研究認為消瘀泄?jié)犸媽θ毖俟嘧е碌腁KI模型小鼠腎損傷有一定的改善作用。其作用機制可能是通過上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ、BECLIN1的蛋白表達，下調(diào)P62、P-PI3K/PI3K、P-AKT/AKT、P-MTOR/MTOR的蛋白表達，作用PI3KAKT/MTOR通路來改善自噬作用，使細胞活力增強，加速新陳代謝，進而起到修復受損腎組織的作用。