草烏甲素可溶性微針的制備、質(zhì)量評(píng)價(jià)及體外透皮性能研究

李銳婷，李麗云，孫文強(qiáng)，丁江生

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

疼痛是最常見的臨床癥狀之一，全球近三分之一的人口深受疼痛困擾，特別是慢性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和工作效率。草烏甲素為毛茛科烏頭屬植物龍頭烏頭(AconitumLongtounenseT.L.Ming)提取分離出來的二萜雙酯生物堿，又叫滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A)。草烏甲素是我國20世紀(jì)80年代自主研發(fā)的新型第三類鎮(zhèn)痛藥物，不具有耐受性和成癮性，鎮(zhèn)痛作用分別是嗎啡的65倍和阿司匹林的7 000倍，臨床上已廣泛用于治療關(guān)節(jié)痛和神經(jīng)病理性疼痛、癌癥晚期疼痛等[1-2]。目前，草烏甲素已上市的劑型有注射劑、片劑和膠囊。草烏甲素因藥效強(qiáng)，毒性大，對(duì)黏膜、肌肉等組織具有較強(qiáng)的刺激性，注射給藥時(shí)局部會(huì)產(chǎn)生劇烈疼痛，使用不方便，口服時(shí)首過效應(yīng)明顯，生物利用度低，胃腸道反應(yīng)較明顯[3]。

微針(microneedle)是指直徑小于幾十微米、長(zhǎng)度為25～2000 μm 的針狀結(jié)構(gòu)[4]，通過刺穿皮膚角質(zhì)層進(jìn)行透皮給藥，基本不產(chǎn)生皮膚損傷和疼痛感?？扇苄晕⑨?dissolving microneedle，DMN)是微針中的一類，由水溶性高分子材料制備而成，具有給藥效率高、安全性好、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)[5]，現(xiàn)已廣泛用于多種藥物的經(jīng)皮給藥研究。本文選取草烏甲素為模型藥物，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選微針的處方及制備工藝，以期獲得具有鎮(zhèn)痛作用的草烏甲素可溶性微針，并對(duì)微針的表觀、機(jī)械強(qiáng)度、體外釋放、穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 材料 草烏甲素(昆明制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20140518)；透明質(zhì)酸(HA，華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：1906173)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K30，博愛新開源醫(yī)療科技集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：C200210012)；聚乙烯醇1788型(PVA，美國阿拉丁，批號(hào)：G1509033)；次甲基藍(lán)(上海試劑一廠，批號(hào)：20161018)；乙醇為分析醇，乙腈為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 主要設(shè)備及儀器 低速離心機(jī)(TD5A-WS，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；真空干燥箱(BPZ-6210LC，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電子天平[1225020258，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；電子天平(EX 125 ZH，奧豪斯儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9145A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國Agilent公司)；可調(diào)移液器(16018203，德國賽多利斯)；數(shù)顯推拉力計(jì)(HF-50，溫州市海寶儀器有限公司)；測(cè)搖式測(cè)試臺(tái)(HCS-500，溫州市海寶儀器有限公司)；透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(TK-12D，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；微針模具(ST-05，新加坡Micropoint Technologies)；體視顯微鏡(M205C，德國徠卡公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD小鼠，體重200～240 g，雄性，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK (京) 2019-0008，合格證號(hào)：1103221911011030。

2 方法與結(jié)果

2.1 微針的制備

2.1.1 基質(zhì)填充方法篩選 采用模具分層澆筑法制備可溶性微針，主要分為兩步，第一步：將含藥物的基質(zhì)填充至模具針尖部分，除去模具表面多余的針尖基質(zhì)，干燥1 h；第二步：填充背襯基質(zhì)，干燥固化即得微針。本試驗(yàn)開展了離心法和真空法填充基質(zhì)的對(duì)比研究。

采用離心法填充基質(zhì)時(shí)，在3 000～4 000 r·min-1條件下離心10～20 min下，基質(zhì)溶液能充分進(jìn)入模具針尖部分，干燥后制得的微針陣列針形完整，且無大量氣泡產(chǎn)生；采用真空法填充基質(zhì)時(shí)，抽真空至10 Pa，當(dāng)基質(zhì)濃度較高時(shí)，抽真空會(huì)使基質(zhì)產(chǎn)生大量氣泡，致使基質(zhì)溶液不能完全進(jìn)入模具針尖部分，制得的樣品針尖不完整。

因此，制備可溶性微針時(shí)采用離心法(3 500 r·min-1，10 min)對(duì)基質(zhì)溶液進(jìn)行填充。

2.1.2 基質(zhì)的篩選

2.1.2.1 單一基質(zhì)的篩選 根據(jù)材料的力學(xué)特性，將基質(zhì)材料分為韌性材料和脆性材料。通常，韌性材料具有較佳的韌性、可塑性，制備的可溶性微針不易碎裂，但機(jī)械強(qiáng)度不足，無法刺入皮膚給藥；脆性材料具有較強(qiáng)的硬度，不易發(fā)生形變，制備微針的機(jī)械強(qiáng)度佳，但給藥時(shí)易碎裂。本研究對(duì)多種常用制備可溶性微針的基質(zhì)如PVA、PVP K30、HA、CMC-Na、HPMC等進(jìn)行篩選，判斷其力學(xué)特性，并對(duì)其制備微針的情況進(jìn)行研究。

單一基質(zhì)的篩選結(jié)果如表1所示，脆性材料中HA(分子量為7 kDa)、PVP K30、PVP K90制備可溶性微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度較佳；韌性材料中PVA、HPMC制備可溶性微針的成型性、韌性較佳。胡霞[6]研究表明，PVP K90 在高濃度(160 mg·mL-1)時(shí)具有一定的細(xì)胞毒性，而本研究中PVP K90制備微針的濃度為200～300 mg·mL-1，因此選擇PVP K30、HA(低分子量)作為針尖基質(zhì)與韌性材料PVA、HPMC進(jìn)行復(fù)合基質(zhì)的篩選。

表1 多種材料制備可溶性微針的情況

2.1.2.2 復(fù)合基質(zhì)的篩選 為得到機(jī)械強(qiáng)度良好、韌性較佳的可溶性微針，本研究將篩選出的脆性材料和韌性材料相結(jié)合，篩選制備可溶性微針的最佳復(fù)合基質(zhì)，結(jié)果如表2所示。

表2 復(fù)合基質(zhì)的制備微針的情況

結(jié)果表明，將PVP K30和HA(7 kDa分子量)混合配成濃度為0.3 g·mL-1的溶液作為針尖基質(zhì)，濃度為15%PVA作為背襯基質(zhì)時(shí)制備的微針機(jī)械強(qiáng)度良好、韌性較佳。

2.1.2.3 基質(zhì)比例及濃度篩選 根據(jù)復(fù)合基質(zhì)的篩選結(jié)果，對(duì)針尖基質(zhì)HA和PVP K30的比例進(jìn)行研究。對(duì)HA∶PVP K30的重量比例1∶9、2∶8、4∶6、6∶4進(jìn)行考察，根據(jù)微針貼片的完整度、機(jī)械強(qiáng)度選擇HA∶PVP K30為2∶8、4∶6、6∶4作為正交試驗(yàn)中針尖基質(zhì)比例的三水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。在分析過程中，多組間的數(shù)據(jù)比較處理采用One-way ANOVA方法進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3 溶劑種類及濃度的篩選 不同的溶劑對(duì)微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度、藥物分布等有不同的影響。因草烏甲素不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、稀鹽酸等。為避免制備過程中殘留的溶劑在給藥過程中損害人體健康，本研究選擇毒性較小的乙醇作為溶劑，且乙醇能有效抑制微針中藥物向背襯層擴(kuò)散[7]。分別考察了35%、45%、60%、75%的乙醇溶液對(duì)微針成型性的影響，結(jié)果表明，微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度隨乙醇濃度的升高而降低，因此選擇溶劑乙醇濃度35%、45%、60%作為正交試驗(yàn)的三水平。

2.1.4 干燥溫度的篩選 微針貼片制備過程中，干燥溫度會(huì)影響微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度、制備周期等。溫度過高時(shí)，干燥過程中容易產(chǎn)生氣泡，且制備的微針貼片較脆、易碎；溫度低容易造成干燥時(shí)間長(zhǎng)、延長(zhǎng)了制備周期。本試驗(yàn)對(duì)干燥溫度25、35、45、55 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果表明隨干燥溫度的升高微針的完整度、機(jī)械強(qiáng)度會(huì)降低，但25 ℃時(shí)所需干燥時(shí)間過長(zhǎng)。因此選擇35、45、55 ℃作為正交試驗(yàn)中干燥溫度的三水平。

2.1.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)篩選結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)針尖基質(zhì)HA∶PVP K30比例(A)、干燥溫度(B)、溶劑濃度(C)進(jìn)行考察，以微針表征、機(jī)械強(qiáng)度、易脫模程度、干燥時(shí)間等綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(見表3)，自制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表4，正交結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表3 L9 (34)正交設(shè)計(jì)

表4 可溶性微針的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表5 制備空白微針的正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

表6 微針綜合評(píng)分方差分析結(jié)果

極差分析顯示，各因素中針尖基質(zhì)比例(A)對(duì)微針的綜合評(píng)分影響最大，因素影響順序?yàn)锳>C>B。方差分析顯示，因素A對(duì)微針的綜合評(píng)分具有顯著性影響(P<0.05)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出，制備可溶性微針的最佳工藝處方為 A2B1C2，即針尖基質(zhì)HA∶PVP K30=4∶6，干燥溫度35 ℃，溶劑濃度為45%。

2.1.6 草烏甲素可溶性微針的制備 根據(jù)篩選的最佳處方，將草烏甲素原料藥與針尖基質(zhì)(HA∶PVP K30=4∶6)溶解混合，制成載藥量為150、100、70 μg的草烏甲素可溶性微針。

2.2 微針的質(zhì)量評(píng)價(jià)

A.測(cè)量微針貼片的大?。籅.微針貼片；C.顯微鏡下的微針照片圖1 草烏甲素可溶性微針的表觀

2.2.2 微針機(jī)械強(qiáng)度

2.2.2.1 穿刺試驗(yàn) 將鋁箔平鋪，草烏甲素可溶性微針針尖向下放置，在一定壓力下按壓，觀察微針穿刺鋁箔的孔隙率和穿刺后微針的形態(tài)，鋁箔紙厚約24 μm。取脫毛處理后的離體豬皮膚，用含次甲基藍(lán)的微針穿刺豬皮，醫(yī)用膠布固定，處理5 min后除去微針貼片，觀察皮膚表面及微針的形態(tài)。

穿刺結(jié)果如圖2所示，草烏甲素可溶性微針可刺穿鋁箔，在鋁箔上留下完整的穿刺孔道，穿刺后微針基本保持完整，針尖部分出現(xiàn)略微彎曲情況；離體豬皮上，微針形成了與微針陣列相一致的點(diǎn)狀分布，表明微針機(jī)械強(qiáng)度良好，可順利穿刺皮膚。

A.微針貼片穿刺鋁箔的正面；B.微針貼片穿刺鋁箔的背面；C.含次甲基藍(lán)的微針貼片刺穿豬皮圖2 可溶性微針貼片刺穿鋁箔、豬皮的情況

2.2.2.2 壓力-位移研究 本實(shí)驗(yàn)室自行組裝對(duì)微針機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試的儀器，將數(shù)顯推拉力計(jì)(HF-50)固定在側(cè)搖式測(cè)試臺(tái)(HCS-500)上，通過手搖測(cè)試臺(tái)實(shí)現(xiàn)拉力計(jì)的上下運(yùn)動(dòng)，根據(jù)微針在不同壓力下的位移情況考察微針的機(jī)械強(qiáng)度。測(cè)試時(shí)選用直徑為5 mm的探頭，勻速下降，壓力與位移的曲線圖如圖3所示，當(dāng)位移達(dá)550 μm時(shí)，每針承受的力達(dá)0.222 N，壓力移除時(shí)大部分微針針型完整，表明機(jī)械強(qiáng)度良好。

圖3 操作示意圖及位移-壓力曲線圖

2.2.3 微針的體外溶解釋放情況 將含量為70 μg草烏甲素可溶性微針溶解于10 mL 35%的乙醇中，分別在0.5、1、2、4、5、6、8 min取樣0.8 mL并立即補(bǔ)充相同體積的新鮮溶液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測(cè)定藥物釋放量，HPLC法測(cè)定草烏甲素的色譜條件根據(jù)《中國藥典》[8]規(guī)定進(jìn)行。結(jié)果表明，草烏甲素可溶性微針在35%的乙醇溶液中8 min時(shí)釋放量達(dá)98.83%，釋放曲線如圖4所示。

圖4 草烏甲素可溶性微針在體外的溶解釋放情況

2.3 微針體外透皮釋放情況 取健康SD小鼠，脫頸椎處死，小心去除腹部的毛，剝離皮膚，用手術(shù)刀刮去皮下組織，并用異丙醇多次擦拭去除剩余的皮下脂肪和筋膜，用生理鹽水反復(fù)清洗，濾紙吸干水分，-20 ℃的冰箱中保存。

取直立式雙室Franz擴(kuò)散池(擴(kuò)散面積為1.766 cm2，接收池容積為7 mL)進(jìn)行微針(載藥量為70 μg)體外透皮釋放研究，考察不同比例的生理鹽水-無水乙醇接收液中草烏甲素可溶性微針中藥物體外透皮情況。微針貼片貼在處理過的皮膚上，拇指持續(xù)按壓2 min，醫(yī)用膠帶固定后，將皮膚夾在擴(kuò)散池的供體室和接收池之間，用角質(zhì)層側(cè)與接收溶液接觸，排盡皮膚下的空氣，蓋上固定蓋，用夾子固定好避免漏液，磁力攪拌速度設(shè)定為500 r·min-1，(37.0±0.5)℃恒溫水浴。通過取樣針在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h)取樣0.8 mL并立即補(bǔ)充相同體積的新鮮接收液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，HPLC法測(cè)定藥物滲透量。根據(jù)下列公式1計(jì)算單位面積累積滲透量，考察不同接收液中載藥微針的釋放情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5份樣品藥物釋放量的平均值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同接收液中草烏甲素體外透皮的單位面積累積滲透量情況(n=5)

(公式1)

Qn為第 n 個(gè)取樣點(diǎn)草烏甲素的單位面積累積滲透量(μg·cm-2)，Cn為第 n 個(gè)取樣點(diǎn)草烏甲素的濃度(μg·mL-1)，Ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)樣品中草烏甲素的濃度(μg·mL-1)，S為擴(kuò)散池截面積(cm2)，V0為接受室體積(mL)，V為取樣體積(mL)。

結(jié)果表明，草烏甲素可溶性微針的體外透皮釋放在24 h內(nèi)藥物的釋放量達(dá)到較高水平，然后慢慢趨于平穩(wěn)。草烏甲素可溶性微針在接收液40%生理鹽水+60%無水乙醇中釋放量最高，24 h時(shí)釋放率達(dá)84.67%，單位面積累積滲透量為33.56 μg·cm-2；48 h時(shí)釋放率達(dá)96.41%，單位面積累積滲透量為38.22 μg·cm-2。

對(duì)草烏甲素可溶性微針體外釋放量最高的曲線進(jìn)行3種釋放模型擬合，結(jié)果如表7所示，從數(shù)據(jù)可以看出，一級(jí)方程的R2值為0.997 2 ，為3種擬合方程中最高的，由此可見草烏甲素可溶性微針的體外透皮釋放符合一級(jí)方程的釋放規(guī)律。

表7 接收液4的釋放曲線在3種模型的曲線擬合

3 討論

基質(zhì)材料對(duì)微針的制備至關(guān)重要，其力學(xué)特性會(huì)影響微針的成型性、機(jī)械強(qiáng)度等。單一基質(zhì)的篩選中發(fā)現(xiàn)，同一物質(zhì)，分子量不同，材料的力學(xué)特性不同，如透明質(zhì)酸鈉(HA)基質(zhì)，當(dāng)分子量大于10 000時(shí)，材料為韌性材料，可塑性強(qiáng)；當(dāng)分子量小于10 000時(shí)，材料為脆性材料，制備的微針機(jī)械強(qiáng)度佳。

經(jīng)穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，微針在高溫環(huán)境中儲(chǔ)存對(duì)會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。高溫環(huán)境中，密封儲(chǔ)存的草烏甲素可溶性微針會(huì)由透明狀態(tài)變?yōu)槲ⅫS色，且部分藥物會(huì)向背襯層擴(kuò)散，載藥量越高，擴(kuò)散越明顯。載藥量為150、100 μg的微針會(huì)在背襯層形成藥物聚集的白色斑點(diǎn)，載藥量為70 μg的微針在背襯層不會(huì)形成明顯的藥物聚集斑點(diǎn)。常溫環(huán)境下，密封儲(chǔ)存的草烏甲素可溶性微針的表征、機(jī)械強(qiáng)度基本保持不變，少量藥物會(huì)向背襯層擴(kuò)散，但不會(huì)在背襯部分形成藥物聚集的斑點(diǎn)。因此，草烏甲素可溶性微針儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)避免處于高溫狀態(tài)，以免造成藥物向背襯層的流失。

微針體外透皮釋放研究中，不同的接收液中微針的體外透皮釋放情況不同。理論上接收液中無水乙醇含量越高，透皮釋放量越多，但結(jié)果卻與之有一定差異，這可能由于離體鼠皮部位的不同、角質(zhì)層厚度不同、離體皮膚的處理差異、微針貼片間載藥量存在差異等因素造成。

本研究以大分子藥物草烏甲素作為模型，采用分層澆筑法制備草烏甲素可溶性微針，因藥物處于針尖部分，因此可精確控制載藥量。正交法優(yōu)選制備微針的最佳工藝，制成的微針表征良好、針形完整，機(jī)械強(qiáng)度良好、韌性較佳，能成功刺穿鋁箔，刺入皮膚以實(shí)現(xiàn)藥物的有效滲透。草烏甲素可溶性微針作為草烏甲素的給藥新劑型，能安全、有效、快速、方便地進(jìn)行經(jīng)皮給藥，本研究能為其后續(xù)開發(fā)利用提供一定依據(jù)。