黃蜀葵花不同開放程度對藥材中總黃酮及其糖苷類成分含量及其提取率的影響

郭小藤，劉燕，張清華，尚立霞

(1.山東省藥學科學院泰山學者重點實驗室，山東 濟南 250101；2.山東省藥學科學院山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟南 250101)

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.) Medic.]的干燥花冠(帶雄蕊及花柱)，味甘性寒，歸腎及膀胱經(jīng)；具有清利濕熱、消腫解毒的功效；內(nèi)服用于濕熱壅遏和淋濁水腫；外治癰疽腫毒，水火燙傷[1]。它作為藥用始于宋代[2]，其后歷代本草均有記載，民間應(yīng)用歷史悠久，并收載于各版《中國藥典》以及江蘇、山東等一些地方藥材標準中。黃蜀葵花原產(chǎn)于我國南方，喜溫暖濕潤，現(xiàn)除西北地區(qū)外，全國各地均有栽培，主要產(chǎn)區(qū)有江蘇、浙江以及安徽等[3-4]。黃蜀葵花含有上千種化合物，主要包括黃酮類、還原糖類、鞣質(zhì)、甾醇類、多糖類化合物以及其他成分，其中黃酮類化合物為黃蜀葵花的主要活性成分，黃酮類成分中又以金絲桃苷和異槲皮苷含量最高[5-8]。藥理學研究表明，黃蜀葵花的黃酮類成分具有保護心、腦缺血，改善肝、腎功能以及修復口腔黏膜潰瘍等作用[9-10]。臨床應(yīng)用黃蜀葵花及其總黃酮治療多種口腔炎癥、慢性支氣管炎，止痛效果顯著，對慢性腎小球腎炎有明顯療效[11]。

中藥材的采收、加工是其生產(chǎn)和品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，對確保中藥材質(zhì)量和臨床療效有著十分重要的意義。歷版《中國藥典》僅規(guī)定黃蜀葵花于夏、秋二季花開時采摘，及時干燥。但目前關(guān)于黃蜀葵花開放程度對藥材質(zhì)量影響的相關(guān)報道尚少。因此，為了保證黃蜀葵花藥材質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)和均一，本研究以金絲桃苷和異槲皮苷為對照品，采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法對黃屬葵花藥材中總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷成分進行含量測定，同時采用正交試驗確定的總黃酮提取最佳工藝，考察藥材的提取率，評價黃蜀葵花不同開放程度時藥材的質(zhì)量，為黃蜀葵花的合理開發(fā)及利用提供了科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備 Waters e2695高效液相色譜儀(2998PDA二極管陣列檢測器，Waters Empower工作站，均為美國 Waters公司)；Agilent 8454 UV-Vis分光光度計(美國安捷倫)；Mettler XS-205電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)；DNT-0.1/00多功能提取濃縮機組(浙江溫兄機械閥業(yè)有限公司)；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；KQ2200DA 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 金絲桃苷對照品(批號：111521-201809，含量:94.9%，中國食品藥品檢定研究院)；異槲皮苷對照品(批號：111809-201804，含量:97.2%，中國食品藥品檢定研究院)；黃蜀葵花藥材產(chǎn)地均為江蘇，經(jīng)山東省藥學科學院泰山學者重點實驗室鑒定為錦葵科植物黃蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.) Medic.]的干燥花；乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純，超純水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 黃蜀葵花藥材的外觀性狀是其質(zhì)量評價的重要部分，由于黃蜀葵花不屬于大宗藥材，市售黃蜀葵花藥材外觀性狀差異較大，因此本研究對黃蜀葵花藥材的花形及開放程度、花色進行了觀察，并考察了外觀性狀與含量之間的相關(guān)性。江蘇是黃蜀葵花藥材種植規(guī)模較大的省份，花期為8—10月，本試驗選用的藥材均為江蘇種植且在花期內(nèi)不同開放程度的藥材。

經(jīng)過對6批藥材樣品外觀性狀的觀察，發(fā)現(xiàn)其花形基本分為全開放形或半開放形、未開放螺旋卷狀形等開放程度；花色分為亮黃色或黃色、黃色偏綠等顏色。其中全開放的花，花瓣大而舒展，花色為亮黃色；半開放的花，花瓣沒有完全展開，花色多為黃色；未開放的花，花形為卷曲螺旋狀，外層花瓣呈淺綠色，結(jié)果見表1、圖1～2。

表1 黃蜀葵花藥材來源及外觀性狀

A.全開放形；B.半開放形；C.未開放螺旋卷形圖1 黃蜀葵花藥材不同花形樣品

A.亮黃色；B.黃色；C.黃色偏綠圖2 黃蜀葵花藥材不同花色樣品

2.2 黃蜀葵花藥材的提取 分別取不同開放程度的黃蜀葵花藥材各4 kg，加85%乙醇回流提取兩次，第一次12倍量，第二次10倍量，每次提取1 h，提取液濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.18～1.20(60 ℃)。將醇提濃縮液靜置16～20 h，撇去上層油，即得醇提浸膏。分別稱定醇提浸膏和油層的重量，計算本品醇提浸膏得率，結(jié)果見表2。

表2 黃蜀葵花藥材提取結(jié)果

全開放的黃蜀葵花提醇提出膏率最高，油層最少；半開放的黃蜀葵花出膏率略低于全開放的花，去油率偏高；未開放的黃蜀葵花醇提浸膏出膏率最低，去油率高且油層結(jié)實。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備 取不同開放程度的黃蜀葵花藥材樣品粉末(過四號篩)0.5 g，每個樣品各2份，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。取不同批次的醇提取樣品0.15 g，置25 mL量瓶中，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，離心10 min，取上清液備用。

2.3.2 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷80 μg的溶液，即得。

2.3.3 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液3 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取供試品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻；以50%甲醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，金絲桃苷對照品與供試品溶液在256 nm波長處均有相同的最大吸收。

2.3.4 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。以50%甲醇為空白，照紫外-可見分光光度法在256 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：C=0.052 1A-0.001 1(R2=0.999 99)，線性范圍為3.036 8～18.221 0 μg·mL-1。

2.3.5 含量測定 精密量取藥材供試品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，精密量取醇提浸膏供試品溶液1.0 mL，置50 mL量瓶中，分別加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在256 nm處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中金絲桃苷的量，計算總黃酮含量。結(jié)果見表3。

表3 不同開放程度黃蜀葵花及醇提浸膏總黃酮含量測定結(jié)果(%,n=2)

全開放的黃蜀葵花樣品中總黃酮含量及醇提轉(zhuǎn)移率最高，半開放的黃蜀葵花總黃酮含量及醇提轉(zhuǎn)移率略低于全開放的花，未開放的黃蜀葵花總黃酮含量和醇提轉(zhuǎn)移率均最低，醇提浸膏中總黃酮含量趨勢與藥材基本一致。

2.4 金絲桃苷、異槲皮苷含量測定

2.4.1 色譜條件 Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)，流速 1.0 mL·min-1，檢測波長：360 nm，進樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 取金絲桃苷和異槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含金絲桃苷100 μg、異槲皮苷60 μg的混合溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末(過四號篩)0.2 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇15 mL超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取不同批次的醇提取樣品0.15 g，置25 mL量瓶中，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.4.4 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖3)。供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且金絲桃苷峰、異槲皮苷峰與相鄰峰之間的分離度均符合要求。

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液 1.金絲桃苷 2.異槲皮苷圖3 黃蜀葵花高效液相色譜圖

2.4.5 樣品含量測定 分別取黃蜀葵花不同部位藥材粉末及不同批次的醇提取樣品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，按外標法以峰面積計算金絲桃苷、異槲皮苷含量，結(jié)果見表4。

表4 不同開放程度黃蜀葵花及醇提浸膏金絲桃苷、異槲皮苷含量測定結(jié)果(%,n=2)

全開放的黃蜀葵花樣品中金絲桃苷、異槲皮苷平均含量最高，半開放的黃蜀葵花中兩成分平均含量略低于全開放的花，未開放的黃蜀葵花中兩成分平均含量均最低，醇提浸膏中兩成分含量趨勢與藥材基本一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取溶劑及方法考察 黃酮類成分是黃蜀葵花的有效部位，由于黃酮類成分在水中溶解度不高，多采用適當濃度的甲醇或乙醇作為溶劑，采用加熱回流、超聲或索氏等方法進行提取[12-13]。由于索氏和超聲提取僅適合少量藥材的提取，且甲醇的毒性較大，而乙醇具有價格低、易回收、污染小等優(yōu)點，因此本研究采用的乙醇回流提取的方法最適合放大生產(chǎn)。在醇提取工藝研究中，以總黃酮的含量為指標，設(shè)計乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)4個因素進行正交試驗，考察對總黃酮提取率的影響，最終選定了最佳的提取工藝條件。

3.2 藥材性狀的選擇 黃蜀葵花藥材醇提液濃縮靜置后，提取浸膏上層有一層油狀物，分析是由花托中的葉綠素及花蕊中的多糖、果膠等成分組成[14]。本研究通過試驗對比發(fā)現(xiàn)未開放及半開放的黃蜀葵花藥材醇提去油率較高，分析是由于未完全開放的花瓣將花蕊包裹，保留了較多的多糖及果膠成分，不利于有效部位的分離純化。因此在對黃蜀葵花總黃酮有效部位分離純化時，應(yīng)優(yōu)選完全開放的花進行提取，同時對藥材的花托比例進行限定。

3.3 含量測定指標的選擇 目前對黃蜀葵花藥材含量測定的文獻報道多為單獨測定總黃酮有效部位或單獨測定金絲桃苷、異槲皮苷等單成分含量[15-16]。本研究不僅對黃蜀葵花藥材不同部位的總黃酮總量進行了測定，同時對總黃酮中含量及活性最高的指標成分金絲桃苷、異槲皮苷進行了定量分析，結(jié)果表明黃蜀葵花中總黃酮含量較高時，金絲桃苷和異槲皮苷含量也較高，二者呈一定相關(guān)性，更全面的評價了黃蜀葵花藥材的質(zhì)量，為進一步研究有效部位與單成分之間的相關(guān)性和藥理藥效的機理提供了數(shù)據(jù)支持。

3.4 不同開放程度藥材含量分析 黃蜀葵花中總黃酮、金絲桃苷及異槲皮苷含量趨勢為：黃色全開放花>黃色半開放花>偏綠色未開放花。全開放的黃蜀葵花，顏色為亮黃色，花瓣大而舒展，有效成分含量高，提取轉(zhuǎn)移率高，去油率低；未開放的黃蜀葵花，花瓣卷曲呈螺旋狀，由于其尚未開放即進行采摘，花朵接收的陽光光照不足，其外層花瓣呈淺綠色，有效成分含量偏低，提取轉(zhuǎn)移率低；半開放的黃蜀葵花，其顏色為黃色，花瓣沒有完全展開，有效成分的含量居于前兩者之間。從上述結(jié)果可以看出，黃蜀葵花藥材的質(zhì)量與其開放程度密切相關(guān)，由于該花只有一天開放時間，因此采收時間宜在晴天的白天花朵完全開放后當天采摘，過早采摘未開放的花將影響藥材的質(zhì)量。在黃蜀葵花15個樣品中，S1～S5樣品顏色較其他樣品偏綠，同時各成分含量較其他樣品偏低，說明黃蜀葵花中黃酮類成分的含量可能與其顏色有一定的相關(guān)性，有待進一步研究。

3.5 結(jié)論 總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷作為黃蜀葵花中主要活性成分，其含量高低直接影響黃蜀葵花的內(nèi)在質(zhì)量及臨床療效。本研究以總黃酮有效部位、金絲桃苷及異槲皮苷和醇提轉(zhuǎn)移率為檢測指標，對不同開放程度的黃蜀葵花藥材進行分析研究，結(jié)果表明，黃蜀葵花藥材不同的開放程度對總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷的含量均有影響，亮黃色全開放花中總黃酮、金絲桃苷及異槲皮苷的含量最高。