人參皂苷三醇型與二醇型在不同量比下對大鼠機(jī)體燥性的影響研究

李金昱，宋成，張凡，曾菁菁，倪夢璐，郭雨欣，趙欣，孫明宇

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根莖[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有大補(bǔ)元?dú)猓鏆馍?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，安神益智之功效[2]。人參雖為補(bǔ)益佳品，但由于其具有溫燥之性，因此使用不當(dāng)或用量過大會導(dǎo)致“人參中毒綜合征”，如出現(xiàn)精神高度興奮、出鼻血、血壓升高、煩躁不安、失眠、抽搐等癥狀[3]。人參所具有的溫燥之性，主要是由于人參內(nèi)部化學(xué)成分引起的，對人參化學(xué)成分的研究可探析人參溫燥之性的物質(zhì)基礎(chǔ)。人參皂苷是人參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，人參皂苷(ginsenoside)根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可分為齊墩果烷型(oleanane-type)和達(dá)瑪烷型(dammarane-type)兩種類型[4]。達(dá)瑪烷型進(jìn)一步可分為人參皂苷三醇型(panaxatriol)和人參皂苷二醇型(panaxadiol)。從構(gòu)型上分類，其中人參皂苷Rg1、Re、Rf為三醇型皂苷，人參皂苷Rb1、Rc、Rb2為二醇型皂苷(見圖1)。有學(xué)者研究推測，在高溫高壓條件下人參皂苷會發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化[5]。

A.人參皂苷三醇型；B.人參皂苷二醇型 1.人參皂苷Rg1； 2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rf；4.人參皂苷Rb1；5.人參皂苷Rc；6.人參皂苷Rb2圖1 人參皂苷三醇型與二醇型分子式構(gòu)型

人參燥性會導(dǎo)致機(jī)體明顯的致熱作用和精神高度興奮，并可能是導(dǎo)致機(jī)體氣機(jī)塞滯、產(chǎn)生動血之患的主要原因。有研究表明，人參皂苷三醇型可能與人參致熱作用相關(guān)[6-7]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷對記憶缺陷的大鼠具有改善學(xué)習(xí)和記憶的能力，并認(rèn)為人參皂苷的藥理作用可能取決于人參皂苷的組成，而不是人參皂苷的含量[8]。人參有效成分中的人參皂苷(人參二醇皂苷和人參三醇皂苷)被認(rèn)為是人參的主要藥用成分。研究顯示，人參三醇皂苷能夠使纈氨酸水平增高，這對應(yīng)激、能量和肌肉代謝的反應(yīng)至關(guān)重要[9]。有學(xué)者對人參皂苷三醇型與二醇型成分的含量比值進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該比值的變化會影響人參的整體質(zhì)量；同時，有較多學(xué)者認(rèn)為該比值與燥性相關(guān)，且該比值越小，燥性可能越低，并認(rèn)為人參皂苷不同含量和比例是人參生物活性變化的主要原因[10]。因此，通過對人參皂苷類成分不同量比變化與人參燥性的相關(guān)性進(jìn)行研究具有重要意義。本文將人參皂苷三醇型與人參皂苷二醇型的比值定義為R，即R=人參皂苷三醇型的含量(Rg1+Re+Rf)/人參皂苷二醇型的含量(Rb1+Rc+Rb2)。為了研究不同量比的人參皂苷三醇型與二醇型對機(jī)體能量代謝、物質(zhì)代謝及神經(jīng)興奮變化，本實(shí)驗(yàn)以大鼠血中與機(jī)體能量代謝及物質(zhì)代謝相關(guān)的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)，以及能反應(yīng)中樞神經(jīng)興奮的腦中膽堿酯酶(ChE)、乙酰膽堿酯酶(AchE)的含量為指標(biāo)，探討不同構(gòu)型人參皂苷量比變化對機(jī)體的燥性影響。

1 材料

1.1 儀器 Mettler AE240型分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler公司)；FA1004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FSH-2可調(diào)高速電動勻漿器(江蘇佳美儀器有限公司)；XW-80A渦旋混合器(上海青浦滬西儀器廠)；Thermo Fisher Finnpipette Steppers單道連續(xù)分配移液器(芬蘭雷勃公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SD雄性大鼠[許可證號：SCXK(遼)2010-0001]30只，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。在正式實(shí)驗(yàn)前，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，預(yù)飼養(yǎng)期間自由飲食飲水，室溫(22±2)℃，濕度60%±2%。本實(shí)驗(yàn)的動物實(shí)驗(yàn)倫理審查批件號：2019YS(DW)-029-01。

1.3 藥品與試劑 人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2對照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號分別為A0503AS、S0317AS、J0404AS、D0718AS、O0303AS、J0322AS、純度均>98%)；超純水；生理鹽水。

大鼠膽堿酯酶(ChE)試劑盒(批號：21032434N)、大鼠乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒(批號：21032435N)、Na+-K+-ATP酶試劑盒(批號：21032425N)、Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒(批號：21032438N)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：21032431N)、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒(批號：21032426N)均購自上?？婆d貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 給藥樣品的制備 人參皂苷三醇型與人參皂苷二醇型不同量比給藥液的配制：人參皂苷Rb1給藥劑量按照《中國藥典》2020年版(一部)人參用最高劑量的6.17倍等效劑量，作為R=0.5組大鼠的給藥劑量。各組人參皂苷樣品的總濃度均為0.345 6 mg·mL-1，按R=人參皂苷三醇組含量總和(Rg1+Re+Rf)/人參皂苷二醇組含量總和(Rb1+Rc+Rb2)，常規(guī)配比R=(10∶4∶1)/(5∶2∶1)計(jì)算，配制R=0.5、1.0、1.5、2.0的4組不同配比的樣品。最后將配制好的各組樣品，置于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組及給藥 動物隨機(jī)分成5組，每組6只。分別為空白組、人參皂苷三醇型與二醇型不同量比(R值=0.5、1、1.5、2)的4個實(shí)驗(yàn)組。各組大鼠灌胃給予相對應(yīng)的藥物溶液，4 mL·kg-1，每天一次，連續(xù)給藥7 d?？瞻捉M給予等容積的生理鹽水。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 血樣的處理 將取得各組大鼠全血，以3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，將各組血樣置于-80 ℃保存待測。

2.3.2 腦組織的處理 將取得的各組大鼠的腦組織進(jìn)行攪勻，稱取0.2 g，分別放入EP管中，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿后，放入離心機(jī)中以3 500 r·min-1離心5 min，取上清液，將各組腦組織樣品置于-80 ℃保存待測。

2.3.3 指標(biāo)檢測 最后一次給藥2 h后，用烏拉坦對各組大鼠進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動脈取血5 mL。取出腦組織，并用生理鹽水洗凈血污。所有指標(biāo)均用ELISA法檢測，血中檢測的指標(biāo)為Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH和SDH；腦中檢測的指標(biāo)為ChE和AchE。所有指標(biāo)檢測的操作均按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。同時觀察大鼠的肛溫、神志反應(yīng)、毛發(fā)光亮程度，并作為各組大鼠藥效學(xué)的差異考察的輔助指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 血中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH、SDH指標(biāo)的測定結(jié)果 由表1可知，與空白組進(jìn)行比較，R=1.5組及R=1.0組在Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶兩個指標(biāo)中顯著升高(P<0.01或P<0.05)。R=1.0組在LDH、SDH兩個指標(biāo)中呈升高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；R=1.5組在SDH指標(biāo)中顯著升高(P<0.01)；R=2.0組在LDH指標(biāo)中呈升高趨勢(P<0.05)。

表1 不同人參皂苷量比對大鼠血中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH、SDH指標(biāo)含量的影響

3.2 腦中ChE、AchE指標(biāo)的測定結(jié)果 如表2所示，不同人參皂苷量比對大鼠腦中ChE、AchE指標(biāo)影響的檢測中，ChE含量沒有規(guī)律性的變化，AchE含量出現(xiàn)了規(guī)律性的變化。與空白組進(jìn)行比較，R=0.5組、R=1.5組在ChE指標(biāo)中顯著降低(P<0.05或P<0.01)；R=2.0組在AchE指標(biāo)中顯著降低(P<0.05)。

表2 不同人參皂苷量比對大鼠腦中ChE、AchE指標(biāo)含量的影響

4 討論

能量代謝與物質(zhì)代謝是人體和外界環(huán)境之間的能量與物質(zhì)交換的過程，是機(jī)體生命活動的基本特征[11]，而Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH、SDH是機(jī)體能量代謝與物質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。膽堿酯酶(ChE)是一類催化?；憠A水解的酶類，由乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BuChE)兩類組成。ChE活性升高，可導(dǎo)致膽堿能突觸間隙處的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)含量降低。AChE可高效水解ACh，維持正常的神經(jīng)沖動傳導(dǎo)[12]?？梢?，ChE或AChE含量的減少，都會使ACh堆積，導(dǎo)致神經(jīng)興奮加強(qiáng)，因此ChE和AChE的含量能夠反應(yīng)機(jī)體中樞神經(jīng)的活躍程度。故本實(shí)驗(yàn)以大鼠血中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH、SDH以及腦中ChE、AchE含量為指標(biāo)，探析不同量比的人參皂苷三醇型與二醇型對機(jī)體能量代謝和腦神經(jīng)興奮的影響。

在上述各指標(biāo)中，Na+-K+-ATP酶是維持細(xì)胞正常內(nèi)外離子濃度和膜電位水平的關(guān)鍵酶[6]；Ca2+-Mg2+-ATP酶對維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Mg2+濃度水平，以及在神經(jīng)細(xì)胞動作電位的傳導(dǎo)等方面具有重要影響[12]，二者均是細(xì)胞膜上重要的酶。因此，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性是衡量線粒體功能和能量代謝水平的重要的指標(biāo)[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同人參皂苷量比給藥后，與空白組相比較，在R=2.0組、R=1.5組大鼠血中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶指標(biāo)均顯著上升，從而體現(xiàn)出在較大的R值下，這兩組大鼠的能量代謝和物質(zhì)代謝有所增加。LDH是檢測糖酵解途徑反應(yīng)強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，參與糖酵解途徑的最后一部分反應(yīng)，催化丙酮酸(PA)生成乳酸。SDH位于線粒體內(nèi)，是呼吸鏈的氧化還原酶復(fù)合體的組成成分之一，也是反應(yīng)糖氧化程度的檢測指標(biāo)之一，是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶[14]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與空白組進(jìn)行比較，R=2.0組在LDH指標(biāo)中顯著升高，R=1.5組在SDH指標(biāo)中顯著升高。說明R值越大，大鼠血中的能量代謝和物質(zhì)代謝有一定的加強(qiáng)。AChE是乙酰膽堿(ACh)的水解酶，膽堿能神經(jīng)元突觸間的信息傳遞依賴于AChE對ACh的水解，進(jìn)而對腦功能進(jìn)行調(diào)控。因AChE在膽堿能神經(jīng)元內(nèi)具有較高的活性，所以其活性可以在一定程度上代表膽堿能神經(jīng)元的活性[15]。對大鼠腦中ChE、AchE指標(biāo)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，不同R組別之間，ChE含量并無規(guī)律性變化。與空白組進(jìn)行比較，R=0.5組、R=1.5組在ChE指標(biāo)中明顯下降，R=2.0組在AchE指標(biāo)中顯著降低，可見當(dāng)R值較大時，大鼠腦中神經(jīng)中樞較活躍。

綜上所述，在R值較大的情況下，大鼠血中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH、SDH指標(biāo)含量會有不同程度的增加，腦中ChE、AchE指標(biāo)含量則有不同程度的降低。反映R值較大的人參樣品會加強(qiáng)機(jī)體的能量代謝和物質(zhì)代謝，并提高中樞神經(jīng)興奮性。實(shí)驗(yàn)過程中，在給藥第3天后，與空白組、R=0.5及R=1.0組相比，R=1.5組大鼠表現(xiàn)出反應(yīng)靈敏，活潑好動，外觀毛發(fā)光亮，并伴有立毛現(xiàn)象，該組大鼠肛溫在第6天和第7天相對較高。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及宏觀指標(biāo)的分析，R值與人參燥性有一定的關(guān)聯(lián)性，在較大的R值下，人參體現(xiàn)出一定的燥性，然而在R值較低的情況下，這種作用并不明顯。

本實(shí)驗(yàn)探析了不同量比的人參皂苷三醇型與二醇型對機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)代謝和中樞神經(jīng)興奮的影響。研究結(jié)果表明，R值大小與人參燥性具有一定關(guān)聯(lián)性。R值越大，機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)代謝增加，中樞神經(jīng)興奮性提高，進(jìn)而體現(xiàn)出人參燥性增強(qiáng)。為了能在臨床上安全合理的用藥，在使用人參時應(yīng)著重關(guān)注R值的大小，意在降低人參皂苷三醇型的含量或提高人參皂苷二醇型的含量。通過相關(guān)文獻(xiàn)的研究，部分人參皂苷三醇型在蒸制過程中易發(fā)生水解，轉(zhuǎn)化為人參皂苷二醇型[16]。通過這種方法，有目的的對人參進(jìn)行炮制加工和栽培，通過控制人參皂苷三醇型與人參皂苷二醇型含量比值大小有效降低人參燥性，使人參更適合患者用藥。