一氧化氮供體和阿霉素的共遞送系統(tǒng)用于逆轉(zhuǎn)腫瘤低氧耐藥研究

鄭云茹，陳紅，魏欣琪，褚克丹，徐偉，劉劍

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

低氧作為一種重要的微環(huán)境因子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。與正常組織氧壓(40～60 mmHg)(1 mmHg=0.133 322 kPa)相比，大多數(shù)實(shí)體瘤組織的氧中位數(shù)較低，約為10 mmHg[1-2]。腫瘤部位的低氧微環(huán)境不僅促進(jìn)了腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，而且大大降低抗腫瘤藥物的治療效果，其原因是：①藥物不太可能以毒性濃度輸送到低氧區(qū)；②低氧有助于p53抑癌蛋白的丟失，導(dǎo)致細(xì)胞自身凋亡能力的喪失；③低氧細(xì)胞可以下調(diào)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的表達(dá)，因此，阿霉素和依托泊苷等針對該蛋白或DNA的藥物將是無效的；④低氧通過上調(diào)缺氧流導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，調(diào)控與細(xì)胞增殖、藥物外排、細(xì)胞凋亡、代謝和血管生成等有關(guān)蛋白的表達(dá)或基因的合成而引起化療抗性，包括編碼藥物外流泵P-糖蛋白的多重耐藥基因[3-7]。因此，低氧也常被認(rèn)為是腫瘤治療失敗，導(dǎo)致腫瘤耐藥產(chǎn)生的重要因素之一。

為了解決腫瘤低氧耐藥性問題以及提高化療對腫瘤的治療效果，人們探索了許多方法。其中Graham課題組報道了低濃度的一氧化氮(NO)供體甘油三硝酸酯和異山梨醇二硝酸酯均能有效地解決腫瘤低氧誘導(dǎo)的耐藥，其原因是低濃度的一氧化氮供體藥物通過NO信號通路激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)，進(jìn)而使環(huán)鳥苷酸(cGMP)累積， cGMP再激活下游的蛋白激酶G(PKG) ，從而導(dǎo)致調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和基因表達(dá)的各種靶分子的磷酸化，改善腫瘤乏氧微環(huán)境[8]。隨后，Stewar等[9]對抗癌藥舒林酸進(jìn)行了硝酸酯類一氧化氮供體修飾，得到的結(jié)合物能顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但不幸的是，無論將一氧化氮供體與抗癌藥進(jìn)行簡單的混合還是通過化學(xué)鍵連接，它們均不能有效地抑制體內(nèi)腫瘤的生長，這主要因?yàn)榈头肿恿康乃幬锖鸵谎趸w具有循環(huán)半衰期短和水溶性差等缺點(diǎn)，且無法特異性識別腫瘤細(xì)胞。

二硫化鉬(molybdenum disulfide，MoS2)是由中心對稱的S-Mo-S三個原子層組成的二維材料。其中，MoS2中的S元素是生物中的一種常見元素，而Mo元素是細(xì)胞中幾種酶發(fā)揮作用的必需微量元素，且在體內(nèi)可被氧化成水溶性氧化物(如MnO42-等)，通過尿液和糞便兩種途徑有效排泄，不會造成在體內(nèi)的大量積累，避免毒副作用的發(fā)生[10]。在生物應(yīng)用方面，MoS2因其卓越的表面等離子共振特性，豐富的化學(xué)反應(yīng)位點(diǎn)，高的光熱轉(zhuǎn)換效率,強(qiáng)的組織穿透能力，以及良好的生物相容性而成為理想的光熱材料[11]。除了可作為光熱材料之外，MoS2還具有超薄的厚度，較大的表面積，豐富的化學(xué)反應(yīng)位點(diǎn)及各向異性的光學(xué)和熱學(xué)等特性，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)展現(xiàn)了獨(dú)特的開發(fā)潛質(zhì)，特別是在藥物、基因、光敏劑、造影劑等裝載和輸送方面[12]。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者積極地開發(fā)MoS2材料在生物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用，特別是在藥物輸送方面和疾病診斷方面。其中，Liu等[13]用聚乙二醇化(PEG)的MoS2納米片作為載體裝載了幾種抗癌藥物，通過對比發(fā)現(xiàn)，MoS2的載藥量遠(yuǎn)大于其他幾個常見的納米材料，如氧化石墨烯等。Yin等[14]構(gòu)建了殼聚糖修飾的MoS2藥物輸送系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了近紅外光誘導(dǎo)的藥物釋放以及對腫瘤的光熱和化療的聯(lián)合治療。與此同時，本課題組制備了透明質(zhì)酸修飾的MoS2納米片，以此作為載體，完成了表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和造影劑釓的靶向共輸送，實(shí)現(xiàn)了磁共振成像指導(dǎo)下對肺癌的光熱和藥物治療的聯(lián)合治療[15]。隨后，我們又用PEG修飾的MoS2納米片同時裝載表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼和化療藥物阿霉素，利用近紅外光控制藥物的釋放，使它們按設(shè)定順序作用于腫瘤，實(shí)現(xiàn)對肺癌的藥物協(xié)同化治療和光熱的聯(lián)合治療，取得了不錯的抑瘤效果[16]。這些證據(jù)充分說明了MoS2材料可以作為一種安全且有效的載體，實(shí)現(xiàn)單個或多個藥物的裝載，控制釋放及輸送。

因此，本研究設(shè)計(jì)了一種以MoS2納米片作為載體，利用酰胺縮合反應(yīng)將羧基化的一氧化氮供體單硝酸異山梨酯(isosorbide mononitrate，IM)與靶向配體透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)結(jié)合，再憑借硫化學(xué)作用將結(jié)合物嫁接于MoS2納米片上，最后通過疏水作用裝載抗癌藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)，構(gòu)建一氧化氮供體和抗癌藥物的共遞送系統(tǒng)(MoS2-HA-IM-DOX)。我們不僅考察了此系統(tǒng)的理化特性，而且在細(xì)胞水平上研究其抗腫瘤效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TECNAI G2F20場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；Multimode8原子力顯微鏡(德國布魯克公司)；UV-2700i紫外/可見光分光光度計(jì)(日本島津公司)；尼高力360智能型傅立葉變換紅外光譜儀(美國尼高力公司)；Zetasizer Nano ZSE馬爾文帕納科納米粒度及電位分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；MDL-N-808激光器(長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司)；BD FACS AriaIII高端分選型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；AX315紅外成像儀(美國菲利爾公司)；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡公司)；Infinite M200Pro酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)；HypoxyLab低氧細(xì)胞工作站(英國Oxford Optronix公司)。

1.3 細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC-9、人胚肺成纖維細(xì)胞HELF(中科院上海細(xì)胞庫)。

2 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 MoS2-HA-IM的制備

2.1.1 HA-IM的制備 EDC和NHS加入HA(20 mg·mL-1，10 mL)PBS溶液，攪拌1 h后，逐滴加到胱胺溶液(56 mg·mL-1，20 mL)內(nèi)，繼續(xù)攪拌24 h后，加入冷乙醇，離心，將所得沉淀復(fù)溶于水，轉(zhuǎn)置于透析袋(3.5 kDa)，除雜72 h，冷凍干燥，可得固體HA-SS-NH2。

IM(1.92 g)溶解于二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶(1.22 g)和琥珀酸酐(3 g)。無氧條件下，反應(yīng)24 h，減壓蒸發(fā)，依次加入飽和NaHCO3溶液和5%鹽酸，萃取，收集有機(jī)相，再經(jīng)硅膠柱色譜法純化(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=1∶1)，即制得固體IM-COOH。

IM-COOH(10 mg)溶解于甲酰胺溶液，加入EDC和NHS，攪拌1 h。將活化的IM-COOH逐滴加入到HA-SS-NH2溶液(1 mg·mL-1)中。反應(yīng)24 h后，加入冷乙醇，離心，將所得沉淀復(fù)溶于水，轉(zhuǎn)置于透析袋(3.5 kDa)，除雜72 h，最后冷凍干燥，即制得結(jié)合物HA-IM。

2.1.2 MoS2-HA-IM的制備 HA-IM(10 mg)溶解于水，加入等體積MoS2水溶液(0.5 mg·mL-1)。超聲20 min取出攪拌過夜后，將混合液轉(zhuǎn)入透析袋(100 kDa)內(nèi)，透析72 h除去未結(jié)合的HA-IM，即制得MoS2-HA-IM溶液。

2.2 MoS2-HA-IM的表征 傅立葉變換紅外光譜儀和紫外/可見光分光光度計(jì)分析MoS2-HA-IM的化學(xué)結(jié)構(gòu)。場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)觀察MoS2-HA-IM表面形貌。原子力顯微鏡(AFM)測定MoS2-HA-IM的尺寸和厚度。Zeta電位與納米粒度儀測定MoS2-HA-IM的粒徑和電勢電位。

企業(yè)信用管理部門在收集客戶信用資料、運(yùn)用信用評分模型等方面存在一定的局限性。然而術(shù)業(yè)有專攻，信用管理機(jī)構(gòu)則由專門的財務(wù)、法律、經(jīng)濟(jì)專家組成，他們對企業(yè)信息收集的范圍更廣，對信用評級的數(shù)據(jù)依據(jù)更加全面，對不同行業(yè)的應(yīng)收賬款風(fēng)險對應(yīng)的客戶有不同的評估系統(tǒng)，應(yīng)對應(yīng)收賬款風(fēng)險的預(yù)警機(jī)制也更加健全。

2.3 光熱特性 移取1 mL不同濃度的MoS2-HA-IM溶液(0、12.5、25、50和100 μg·mL-1)，加入比色皿中，調(diào)節(jié)808 nm激光器，使用1 W·cm-2的激光照射上述樣品10 min。光照過程中，每隔1 min使用紅外熱成像儀記錄一次樣品的溫度，收集數(shù)據(jù)并繪制光熱升溫曲線。

2.4 MoS2-HA-IM的細(xì)胞毒性 將PC-9細(xì)胞(6×103/孔)和HELF細(xì)胞(5×103/孔)分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)入20% O2的普通培養(yǎng)箱或1% O2低氧工作站中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度MoS2-HA-IM的細(xì)胞培養(yǎng)基。再孵育48 h后，使用MTT法測定細(xì)胞活性。

2.5 藥物裝載和釋放 配置不同濃度的DOX溶液，向其中加入等體積的MoS2-HA-IM溶液(0.1 mg·mL-1)，調(diào)節(jié)pH至8.0。避光攪拌24 h后，將溶液移入至超濾管(Millipore，MWCO 100 kDa)內(nèi)，其在3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下超濾離心10 min，并用去離子水反復(fù)洗滌離心至下層溶液無色，得到的MoS2-HA-IM-DOX溶液置于4 ℃冰箱保存，并根據(jù)裝載DOX前后的MoS2-HA-IM在480 nm波長處的吸收度變化來計(jì)算DOX的裝載量。

MoS2-HA-IM-DOX(1 mL)溶液封閉于透析袋內(nèi)，隨后沉浸于9 mL不同pH值的PBS溶液中。光照組樣品受到808 nm激光(1 W·cm-2)照射10 min，而其他組避光處理。在隨后46 h內(nèi)，所有樣品均避光處理。在設(shè)定的時間點(diǎn)，取出0.2 mL透析液，測定其在480 nm波長處的吸光度，隨后將其放回至原來的釋放體系中，維持該體系的體積恒定。48 h后，收集數(shù)據(jù)并繪制出藥物的累計(jì)釋放曲線。

2.6 細(xì)胞攝取 將PC-9細(xì)胞(3×105/皿)和HELF細(xì)胞(1×105/皿)分別接種于共聚焦小皿，隨后轉(zhuǎn)入1% O2的低氧工作站中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，使用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋MoS2-HA-IM-DOX溶液至設(shè)定濃度([DOX]=20 μg·mL-1)，隨后加入共聚焦小皿內(nèi)，培養(yǎng)2 h。待細(xì)胞核染色完成后，置于共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光圖像。細(xì)胞表面HA受體封閉實(shí)驗(yàn)是預(yù)先使用游離HA(4 mg·mL-1)孵育細(xì)胞2 h，然后加入MoS2-HA-IM-DOX稀釋液按相同方法處理。與此同時，采用流式細(xì)胞儀定量考察了PC-9細(xì)胞和HELF細(xì)胞對MoS2-HA-IM-DOX的攝取。

2.7 IM逆轉(zhuǎn)腫瘤低氧誘導(dǎo)的耐藥 將PC-9細(xì)胞(6×103/孔)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再轉(zhuǎn)入20% O2的普通培養(yǎng)箱或1% O2低氧工作站內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后，用細(xì)胞培養(yǎng)基將IM溶液稀釋到設(shè)定的濃度，加入培養(yǎng)孔內(nèi)。共孵育2 h后，用PBS清洗細(xì)胞3次，再加入含DOX的細(xì)胞培養(yǎng)基。另外孵育48 h后，用MTT法測定細(xì)胞的活性。

2.8 MoS2-HA-IM-DOX的細(xì)胞毒性 PC-9細(xì)胞(6×103/孔)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在低氧環(huán)境下培育24 h。隨后將含有DOX或MoS2-HA-IM-DOX的細(xì)胞培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔內(nèi)。孵育2 h后，用PBS溶液清洗細(xì)胞3次，每孔加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。再孵育48 h后，用MTT法測定細(xì)胞的活性。

2.9 近紅外光照射下MoS2-HA-IM-DOX對肺癌細(xì)胞的殺傷作用 PC-9細(xì)胞(6×103/孔)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)入1% O2低氧工作站中。待細(xì)胞貼壁之后，將細(xì)胞分為6組：①細(xì)胞培養(yǎng)基；②MoS2-HA-NH2；③MoS2-HA-IM；④DOX；⑤MoS2-HA-DOX；⑥MoS2-HA-IM-DOX([DOX]=20 μg·mL-1，[MoS2-HA-IM]=80 μg·mL-1)。待細(xì)胞與對應(yīng)的材料共孵育2 h后，用PBS溶液清洗細(xì)胞3次，每孔加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。光照組的細(xì)胞受到1 W·cm-2的808 nm激光照射10 min，而其他組的細(xì)胞避光處理。再孵育48 h后，用MTT法測定細(xì)胞的活性。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用t檢測分析兩實(shí)驗(yàn)組間的差異；采用單因素方差分析方法(ANOVA)分析兩組以上實(shí)驗(yàn)組間的差異。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 MoS2-HA-IM的制備及表征 MoS2納米片是通過化學(xué)剝離法制備的[17-18]，從圖1b透射電鏡圖(TEM)和圖1c～1d原子力顯微鏡圖(AFM)可知制備的MoS2納米片結(jié)構(gòu)為層狀，且平均厚度約為1.1 nm，表明其多為單層或少層。同時，我們也發(fā)現(xiàn)MoS2納米片可以穩(wěn)定地分散在水中，但由于電子屏蔽效應(yīng)，在生理鹽水溶液內(nèi)會產(chǎn)生聚集，這嚴(yán)重影響了MoS2材料在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。在我們之前的研究中，HA修飾的MoS2納米片(MoS2-HA)具有較好的生理穩(wěn)定性，能夠在生理鹽水內(nèi)保持穩(wěn)定達(dá)30 d以上[15]，而在這個工作的體系中，我們將IM引入到這MoS2-HA納米片內(nèi)，以制備攜一氧化氮供體納米載體MoS2-HA-IM。

從圖2a紅外譜圖可以看出，相比于IM，IM-COOH在1 720 cm-1處有明顯的C=O伸縮振動峰，說明了IM中的羥基已轉(zhuǎn)化成羧基。隨后利用EDC/NHS技術(shù)，將HA-SS-NH2和IM-COOH結(jié)合起來。如我們預(yù)期所想，一些IM-COOH的特征峰出現(xiàn)在了HA-SS-NH2的紅外圖譜上，比如-NO2的伸縮振動峰(1 320 cm-1)，說明了HA-SS-NH2和IM-COOH的成功結(jié)合。將HA-IM與MoS2反應(yīng)后，一些HA-IM的特征峰便出現(xiàn)在了MoS2的紅外光譜圖上，比如N-H伸縮振動峰(1 660 cm-1)和C-O變角彎曲振動峰(1 150 cm-1)，說明了HA-IM已成功地嫁接到了MoS2納米片上。同時，從圖2b MoS2-HA-IM的紫外-可見光-近紅外吸收光譜中可以看出，其在紫外200～250 nm范圍內(nèi)的吸光度較MoS2高，進(jìn)一步證實(shí)了HA-IM存在于MoS2納米片上。

在證實(shí)MoS2-HA-IM的成功制備后，我們考察了其形貌特征。如圖1f～1h所示，與MoS2納米片相比，MoS2-HA-IM仍具有2D層狀結(jié)構(gòu)，平均厚度上升至4 nm，間接地提供了HA-IM存在于MoS2納米片上的證據(jù)，而粒徑卻由180 nm降低至90 nm，這一結(jié)果也得到了DLS測試的證實(shí)，其原因?yàn)槌暦鬯榱思{米片，結(jié)果見圖1i。

圖1 (a)MoS2-HA-IM的制備示意圖；(b～d)MoS2納米片的TEM圖，AFM圖以及其厚度；(e)MoS2和MoS2-HA-IM在水、PBS溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基放置30 d后的光學(xué)照片;(f～h)MoS2-HA-IM納米片的TEM圖，AFM圖以及其厚度;(i)動態(tài)光散射(DLS)測試得到的MoS2和MoS2-HA-IM的水合粒徑

3.2 MoS2-HA-IM的光熱特性 由圖2b可知，HA-IM的存在不影響MoS2在近紅外區(qū)域的強(qiáng)吸收。為了研究MoS2-HA-IM的光熱性能，配制了不同濃度的MoS2-HA-IM溶液，隨后用1 W·cm-2的808 nm激光照射上述樣品10 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激光照射前后水樣的溫度只增加了6 ℃左右。相比之下，MoS2-HA-IM溶液的溫度在激光照射后出現(xiàn)明顯的升高，且樣品的濃度越大，溶液溫度的升高速率越快，最高溫度可達(dá)96 ℃，結(jié)果見圖3a、3b。相比人體的正常體溫為37 ℃而言，在近紅外光的照射下，積累在腫瘤部位的MoS2-HA-IM可以提高腫瘤區(qū)域的溫度至43 ℃以上，引起腫瘤細(xì)胞的消融和死亡，從而在一定程度上抑制腫瘤的生長[19]。

圖2 (a)MoS2-HA-IM的傅立葉變換紅外光譜圖;(b)HA-IM嫁接前后MoS2的紫外-可見-近紅外吸收光譜圖

圖3 (a)在功率密度為1 W·cm-2的激光照射下，水和不同濃度的MoS2-HA-IM溶液的光熱升溫曲線；(b)對應(yīng)(a)中樣品的熱成像圖

3.3 MoS2-HA-IM的細(xì)胞毒性 選取PC-9細(xì)胞和HELF細(xì)胞作為細(xì)胞模型，使用MTT法評估MoS2-HA-IM的細(xì)胞毒性。結(jié)果如圖4a所示，當(dāng)MoS2-HA-IM的濃度在12.5～400 μg·mL-1范圍內(nèi)時，PC-9細(xì)胞和HELF細(xì)胞的活性均保持在90%以上。同時，我們也考察了MoS2-HA-IM在低氧環(huán)境下的細(xì)胞毒性，由圖4b中可知得到了與上述相似的結(jié)果，進(jìn)一步說明MoS2-HA-IM具有較低的細(xì)胞毒性，具有在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的前景。

圖4 在常氧環(huán)境(a)或低氧環(huán)境(b)下，與不同濃度的MoS2-HA-IM溶液孵育48 h后PC-9細(xì)胞和HELF細(xì)胞的活性

3.4 藥物裝載以及雙重響應(yīng)的藥物釋放 有文獻(xiàn)報道，在弱堿(pH=8.0)環(huán)境下,DOX·HCI會脫鹽而變得疏水，進(jìn)而可通過疏水作用裝載于MoS2納米片上，實(shí)現(xiàn)藥物的有效輸送[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，為了探究MoS2-HA-IM對DOX的裝載能力，我們將MoS2-HA-IM溶液與不同濃度的DOX溶液相混合。攪拌24 h后，超濾以除去未裝載的DOX。由圖5a可知，DOX的吸收特征峰(480 nm)出現(xiàn)在了MoS2-HA-IM的紫外-可見光-近紅外吸收光譜上，說明了DOX已經(jīng)成功裝載于MoS2-HA-IM上。同時可知，MoS2-HA-IM對DOX的裝載量隨著DOX濃度的增大而增加。然而，裝載量一旦超過50%，MoS2-HA-IM-DOX在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性受到了嚴(yán)重的影響，甚至出現(xiàn)了局部聚沉的現(xiàn)象，這可能是由于DOX的大量存在改變了MoS2-HA-IM的Zeta電勢。

實(shí)驗(yàn)考察了MoS2-HA-IM-DOX的藥物釋放動力學(xué)。由圖5b可知，在pH為5.5的釋放介質(zhì)中，MoS2-HA-IM-DOX在48 h內(nèi)的藥物累計(jì)釋放百分比為25.7%，是pH為7.4條件下(9.3%)的2.6倍，表現(xiàn)出pH響應(yīng)的藥物釋放行為。這是由于DOX分子中的氨基在酸性條件下易發(fā)生質(zhì)子化，提高了DOX在水中的溶解性，減弱了DOX與MoS2載體之間的疏水作用，進(jìn)而加快DOX的釋放速率[16]。經(jīng)過近紅外光照射10 min后，pH為5.5環(huán)境下的藥物累計(jì)釋放百分比從15.4%迅速上升至41.3%，增長了25.9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未激光照射，說明了MoS2-HA-IM-DOX具有近紅外光誘導(dǎo)藥物釋放的特性，綜上所述，pH和近紅外光雙重藥物釋放特性能夠有效地促使藥物脫離載體，可增強(qiáng)MoS2-HA-IM-DOX的化療效果。

圖5 (a)MoS2-HA-IM裝載不同濃度的藥物時的紫外-可見-近紅外吸收光譜圖；(b)在有/無近紅外光照射(1 W·cm-2)和不同pH值的環(huán)境下，DOX的累計(jì)釋放曲線

3.5 低氧環(huán)境下肺癌細(xì)胞對MoS2-HA-IM-DOX的攝取 圖6a為激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光圖像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于HELF細(xì)胞而言，PC-9細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的DOX熒光，說明MoS2-HA-IM-DOX更容易進(jìn)入PC-9細(xì)胞。且經(jīng)過HA預(yù)處理的PC-9細(xì)胞顯示出非常弱的DOX熒光，與HELF細(xì)胞相仿，這主要因?yàn)橛坞x的HA與PC-9細(xì)胞表面的HA受體結(jié)合，占據(jù)了MoS2-HA-IM-DOX與細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)，使此納米復(fù)合物無法特異性識別細(xì)胞，導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的效率大大降低。

使用流式細(xì)胞儀定量分析了PC-9細(xì)胞和HELF細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖6b。流式細(xì)胞儀測試得到的胞內(nèi)量化熒光數(shù)據(jù)與激光共聚焦細(xì)胞熒光成像的結(jié)果相吻合，進(jìn)一步證實(shí)了HA修飾的MoS2材料具有對HA受體過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞特定的靶向識別能力，可將裝載的藥物有效地輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

圖6 Nano：MoS2-HA-IM-DOX注：(a)在低氧及有/無游離HA存在的條件下，PC-9細(xì)胞和HELF細(xì)胞與Nano共孵育2 h后的激光共聚焦熒光圖像；(b)用流式細(xì)胞儀定量分析(a)中胞內(nèi)DOX熒光強(qiáng)度

3.6 MoS2-HA-IM-DOX在細(xì)胞水平上的協(xié)同治療 由圖7a可知，在相同的DOX濃度下，低氧環(huán)境下PC-9細(xì)胞表現(xiàn)出較高的細(xì)胞活性，且低氧環(huán)境下DOX的IC50值是常氧環(huán)境下的3.2倍，表明腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下對DOX具有較強(qiáng)的耐受性。但當(dāng)這些細(xì)胞與IM處理后，細(xì)胞的活性顯著下降，見圖7b。為了探究細(xì)胞活性變化的原因，考察了IM的細(xì)胞毒性，由圖7c發(fā)現(xiàn)，在濃度0.01～10 μg·mL-1范圍內(nèi)，IM表現(xiàn)出無毒，且不會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果證實(shí)了IM+DOX組較低的細(xì)胞活性是因?yàn)镮M能夠有效地減弱腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下對DOX的耐受性，增強(qiáng)了DOX的細(xì)胞毒性所導(dǎo)致的。

圖7 (a)在不同的氧分壓下，與不同濃度的游離DOX孵育后PC-9細(xì)胞的活性；(b)低氧環(huán)境下，PC-9細(xì)胞經(jīng)IM處理后，再與DOX共孵育后的活性；(c)在不同的氧分壓下，與不同濃度的IM孵育48 h后PC-9細(xì)胞的活性

為了進(jìn)一步證實(shí)IM能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤在低氧環(huán)境下的耐藥性，緊接著，我們考察裝載有IM的MoS2-HA-IM-DOX能否在低氧環(huán)境下具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。由圖8a可知，游離DOX、MoS2-HA-DOX、MoS2-HA-IM-DOX 3種材料都能在一定程度上抑制PC-9細(xì)胞的增殖，且均表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。但在相同的DOX濃度下，相較于與MoS2-HA-DOX或DOX共孵育的細(xì)胞而言，與MoS2-HA-IM-DOX共孵育的細(xì)胞顯示出較低的細(xì)胞活性，說明了IM能有效地增強(qiáng)MoS2-HA-DOX的細(xì)胞毒性，提高其化療效果。

圖8 (a)在低氧環(huán)境下，與不同濃度的MoS2-HA-IM-DOX孵育后PC-9細(xì)胞的活性;(b)在低氧環(huán)境下，經(jīng)過不同方式處理后PC-9細(xì)胞的活性

考察MoS2-HA-IM-DOX對細(xì)胞的殺傷力是否在近紅外光的照射下得到進(jìn)一步的增強(qiáng)。由圖8b可知，單獨(dú)的近紅外光照射不會對腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，也不會增強(qiáng)游離DOX的細(xì)胞毒性。但給予MoS2材料處理的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過近紅外光照射后，其活性下降顯著。這主要因?yàn)镸oS2納米材料可以將吸收到的近紅外光轉(zhuǎn)換成熱能，引起腫瘤細(xì)胞的消融，并部分抑制其增殖。此外，載有DOX的MoS2材料在光照之后對腫瘤細(xì)胞殺傷能力得到顯著的增強(qiáng)，特別是MoS2-HA-IM-DOX，僅有6.4%的細(xì)胞處于存活狀態(tài)，明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是：第一，MoS2材料經(jīng)過光照之后產(chǎn)生的光熱能有效地誘導(dǎo)DOX釋放，提高細(xì)胞內(nèi)游離DOX的濃度；第二，裝載的IM削弱了腫瘤細(xì)胞對DOX的耐受性，增強(qiáng)了游離DOX的細(xì)胞毒性；第三，化療和光熱的協(xié)同效應(yīng)。

4 結(jié)論

在本研究中，我們以胱胺為連接體，利用EDC/NHS技術(shù)，將IM與HA結(jié)合，再通過硫化學(xué)作用將其嫁接到MoS2納米片上。制備的納米載體MoS2-HA-IM具有較高的生理穩(wěn)定性，優(yōu)異的光熱特性以及較低的細(xì)胞毒性，且通過疏水作用裝載抗癌藥物DOX，成功構(gòu)建一氧化氮供體和阿霉素的共遞送系統(tǒng)。此系統(tǒng)可憑借HA受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有效地將DOX輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。在近紅外光和pH雙重刺激下，藥物盡可能地從載體中脫離出來，提高了MoS2-HA-IM-DOX的藥物治療效果，且裝載的IM削弱腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下對藥物的耐受性，進(jìn)一步增強(qiáng)了藥物治療效果，再聯(lián)合近紅外光照射MoS2材料產(chǎn)生的光熱，一起有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。