血清氧化三甲胺與缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究

羅嘉欣，張傲琪，高瑞江，李自如，朱潤(rùn)秀，姚遠(yuǎn)，*，袁軍*

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是造成身體殘疾的主要原因，以急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）最為常見(jiàn)［1］。盡管近年來(lái)AIS新發(fā)率和復(fù)發(fā)率正在下降，導(dǎo)致的死亡人數(shù)也有所減少［2］，但全世界每年仍有1 500萬(wàn)人發(fā)生AIS，其中中國(guó)每年就有超過(guò)200萬(wàn)例新發(fā)病例，且患病人群趨于年輕化［3-5］。目前國(guó)內(nèi)外已有的預(yù)測(cè)AIS的方法包括十年卒中風(fēng)險(xiǎn)方程、新的《弗雷明漢卒中風(fēng)險(xiǎn)概況》和“中風(fēng)”危險(xiǎn)評(píng)分卡，但均不足以有效預(yù)測(cè)AIS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、指導(dǎo)早期干預(yù)策略的制訂。由于傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素不能完全預(yù)測(cè)AIS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［6］，越來(lái)越多的預(yù)測(cè)方法趨向于結(jié)合臨床生物標(biāo)志物評(píng)估疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［7-8］。因此，探索新的AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)進(jìn)一步減輕AIS疾病負(fù)擔(dān)［9］。

近期大量研究顯示，腸道微生物群與動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病及AIS不良功能預(yù)后之間存在密切相關(guān)性［10-12］。氧化三甲胺（TMAO）轉(zhuǎn)化為三甲氨（TMA），后者在腸道微生物作用下或再經(jīng)門(mén)靜脈循環(huán)進(jìn)入肝臟被黃素單加氧酶3（FMO3）氧化后生成 TMAO，發(fā)揮促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成、增加血小板高反應(yīng)性及促進(jìn)血栓形成的作用，同時(shí)減少膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)［13］。本課題組發(fā)現(xiàn)，TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間可能存在相關(guān)性，但尚有爭(zhēng)議［14］。為明確TMAO水平與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，本研究采用回顧性研究方法，利用《國(guó)家衛(wèi)生健康委腦卒中篩查與干預(yù)項(xiàng)目》篩查的人群資料，分析血清TMAO水平對(duì)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響，為AIS的預(yù)防及早期啟動(dòng)干預(yù)措施提供有價(jià)值的理論依據(jù)及新型靶點(diǎn)預(yù)防思路［15］。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2020年10—12月，基于腦卒中高危人群篩查和干預(yù)項(xiàng)目（https://chinasdc.cn），于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市新城區(qū)社區(qū)腦卒中篩查人群中隨機(jī)抽取500例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞40歲，男女不限；（2）身體無(wú)嚴(yán)重缺陷；（3）患者和/或其家屬知情同意，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有長(zhǎng)期服用他汀類(lèi)藥物或抗凝藥物史；（2）妊娠或哺乳期婦女。本研究遵循赫爾辛基宣言原則，研究方案通過(guò)內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：202100206L）。排除年齡＜40歲12例，既往有腦卒中疾病史56例，拒絕入組30例，長(zhǎng)期服用抗血栓藥物1例，妊娠1例，最終納入研究對(duì)象399例。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo) 收集研究對(duì)象一般資料，包括性別、年齡、腦卒中病史（既往患腦卒中或有短暫性腦缺血發(fā)作）、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、心臟病病史、缺乏運(yùn)動(dòng)（運(yùn)動(dòng)＜30 min/次、次數(shù)＜3次/周）、目前吸煙（平均每天吸煙≥1支且持續(xù)時(shí)間≥1年）、目前飲酒（平均每天飲酒≥50 g且持續(xù)時(shí)間≥1年）、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、篩查時(shí)收縮壓，收縮壓＜140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）為正常，≥140 mm Hg為血壓升高；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括：空腹血糖、糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、TMAO。采集研究對(duì)象全血樣本5 ml置入惰性分離促凝真空管，4 ℃保存，1 500 r/min離心10 min（離心半徑為13.5 cm），分離血清，應(yīng)用三諾安穩(wěn)+AIR血糖儀檢測(cè)空腹血糖，應(yīng)用卡迪克干式生化分析儀檢測(cè)糖化血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（中國(guó)酶免公司生產(chǎn)）檢測(cè)TMAO水平。

1.2.2 研究分組 依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委腦卒中防治工程委員會(huì)開(kāi)展的腦卒中高危人群篩查和干預(yù)項(xiàng)目，采用“中風(fēng)”危險(xiǎn)評(píng)分卡對(duì)40歲以上人群進(jìn)行AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，該評(píng)估中危險(xiǎn)因素共8項(xiàng)：高血壓、血脂情況、糖尿病、吸煙、心房顫動(dòng)或瓣膜性心臟病、體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)、卒中家族史。高危定義：存在3項(xiàng)及以上上述危險(xiǎn)因素或既往有腦卒中病史或既往有短暫性腦缺血發(fā)作病史；中危定義：有高血壓、糖尿病、心房顫動(dòng)任意一種。本研究依據(jù)“中風(fēng)”危險(xiǎn)評(píng)分卡將研究對(duì)象分為正常對(duì)照組（n=121）、中危組（n=141）、高危組（n=137）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)。TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析和Spearman秩相關(guān)分析。采用有序多分類(lèi)Logistic回歸分析探究AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響因素。鑒于TMAO存在于外周循環(huán)中，且其在AIS患者血清中水平較高［12，16］，為進(jìn)一步明確TMAO作為AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值，繪制TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC曲線(xiàn)），并計(jì)算靈敏度、特異度、ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)人群TMAO水平 正常對(duì)照組、中危組、高危組TMAO水平分別為（2.86±0.31）、（2.84±0.37）、（3.21±0.33）μmol/L， 三 組 TMAO水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.877，P＜0.01）；其中高危組TMAO水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；中危組TMAO水平與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.760）；中危組和高危組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的單因素分析 三組年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、缺乏運(yùn)動(dòng)情況、目前吸煙情況、目前飲酒情況、BMI、篩查時(shí)收縮壓水平、空腹血糖水平、糖化血紅蛋白水平、三酰甘油水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三組總膽固醇、低密度脂蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。三組均無(wú)腦卒中、心臟病病史者。

表1 三組研究對(duì)象一般資料及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較Table 1 Comparison of general data and laboratory examination indexes of three groups of research objects

2.3 TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，TMAO與年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、目前吸煙、目前飲酒呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與缺乏運(yùn)動(dòng)、BMI呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 TMAO與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of serum TMAO with risk factors of acute ischemic stroke

2.4 AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)影響因素的有序多分類(lèi)Logistic回歸分析 以AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分級(jí)為因變量（賦值：正常對(duì)照組=1，中危組=2，高危組=3），以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，進(jìn)行有序多分類(lèi)Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，高血壓病史、糖尿病病史、缺乏運(yùn)動(dòng)、目前吸煙、BMI、篩查時(shí)收縮壓、空腹血糖、TMAO是AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分級(jí)的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表3，且危險(xiǎn)因素間未發(fā)現(xiàn)明顯共線(xiàn)性方差膨脹因子，VIF均＜10。

表3 AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)影響因素的有序多分類(lèi)Logistic回歸分析Tabl 3 Analysis of the factors possibly associated with acute ischemic stroke using multinomial and ordinal Logistic regression

2.5 TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值 繪制TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的最佳截?cái)嘀禐?.28 μmol/L時(shí)，靈敏度為62.0%，特異度為91.6%，AUC為0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕，見(jiàn)圖1。

圖1 TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線(xiàn)Figure 1 ROC curve of serum TMAO in predicting the risk of acute ischemic stroke

3 討論

全球疾病負(fù)擔(dān)（global burden of disease，GBD）研究數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)是世界腦卒中發(fā)病率最高的國(guó)家之一，與蒙古國(guó)、俄羅斯共同構(gòu)成重要發(fā)病帶［17］，有效預(yù)判AIS的發(fā)生并予以積極、有效的干預(yù)措施對(duì)降低AIS發(fā)病率至關(guān)重要。隨著人們生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，探究腸道微生物代謝產(chǎn)物與糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病及心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后情況的相關(guān)性已成為全球熱點(diǎn)研究方向［18-21］。雖然大量研究早已證明炎性因子在AIS及心血管疾病發(fā)生中的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值［22-23］，但腸道微生物組及其代謝產(chǎn)物在AIS中的關(guān)鍵作用直到最近才被認(rèn)識(shí)到。有研究發(fā)現(xiàn)，TMAO是心房顫動(dòng)患者發(fā)生AIS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，有可能改善心房顫動(dòng)患者的卒中分層［24］。亦有報(bào)道指出較高的TMAO水平可能與高血壓患者首次AIS風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［25］。但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)直接探索TMAO水平是否為AIS發(fā)生獨(dú)立危險(xiǎn)因素的相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，高危組TMAO水平高于正常對(duì)照組、中危組，進(jìn)一步行有序多分類(lèi)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TMAO是AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分級(jí)的獨(dú)立影響因素；同時(shí)，TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線(xiàn)結(jié)果顯示，當(dāng)TMAO預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的最佳截?cái)嘀禐?.28 μmol/L時(shí)，靈敏度為62.0%，特異度為91.6%，AUC為0.790〔95%CI（0.737，0.837）〕。為進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果的可靠性，本研究團(tuán)隊(duì)目前已完成此項(xiàng)目隊(duì)列研究的臨床注冊(cè)及啟動(dòng)工作，正在進(jìn)行定期隨訪(fǎng)。

較高TMAO水平與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間呈正相關(guān)的潛在機(jī)制在于：（1）TMAO可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成及斑塊不穩(wěn)定性增加。TMAO通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞炎癥信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)，促使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，從而形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊［13，26］。GENG等［27］提出，高水平的TMAO可增加巨噬細(xì)胞聚集、CD36和促炎細(xì)胞因子表達(dá)，從而誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊活動(dòng)性，而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性可直接影響AIS事件的發(fā)生［28］。（2）升高血小板反應(yīng)性、促進(jìn)血栓形成。TMAO通過(guò)增加組織因子的表達(dá)和活性來(lái)促進(jìn)血栓形成，從而增加AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［29］。目前認(rèn)為，TMAO是動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)病機(jī)制及繼發(fā)附壁血栓所致相關(guān)疾病的潛在重要中介［12］。這表明TMAO可能作為臨床有價(jià)值的評(píng)估AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，甚至超過(guò)了目前使用的危險(xiǎn)因素和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。也有部分研究認(rèn)為，抑制TMAO的產(chǎn)生或降低其血清水平可改善由飲食引起的動(dòng)脈粥樣硬化［30］。因此，TMAO可能成為預(yù)防AIS的新型生物標(biāo)志物和AIS的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究尚存在一定的局限性，首先，本研究是單中心研究，存在一定的地域性和選擇性偏移，可能會(huì)降低研究結(jié)果的價(jià)值。其次，本研究采用“中風(fēng)”危險(xiǎn)評(píng)分卡預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，這將導(dǎo)致預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的降低。提高預(yù)測(cè)效能最直接準(zhǔn)確的方法是進(jìn)行隊(duì)列研究，追蹤高危人群AIS的真實(shí)患病率，進(jìn)而判斷TMAO預(yù)測(cè)效果，目前本研究團(tuán)隊(duì)已開(kāi)展本項(xiàng)目的隊(duì)列研究。再次，本研究未采用穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清TMAO［31］，可能與其他文獻(xiàn)略有偏差，但本研究方向是值得肯定的。最后，本研究中未評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性、凝血因子和血小板活性，需要后續(xù)研究來(lái)明確TMAO水平預(yù)測(cè)AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制。

綜上所述，血清TMAO水平升高與AIS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)，但仍需縱向研究來(lái)檢驗(yàn)和證實(shí)這些關(guān)聯(lián)，為AIS一級(jí)預(yù)防和治療策略提供新的前景。

作者貢獻(xiàn)：羅嘉欣進(jìn)行文章構(gòu)思與設(shè)計(jì)、負(fù)責(zé)文獻(xiàn)、資料收集、實(shí)驗(yàn)操作、撰寫(xiě)論文及文章質(zhì)控；張傲琪進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作及文獻(xiàn)資料的整理；高瑞江進(jìn)行篩查評(píng)估、采集血樣及數(shù)據(jù)整理；李自如進(jìn)行論文修訂；朱潤(rùn)秀進(jìn)行文章質(zhì)控；姚遠(yuǎn)進(jìn)行研究設(shè)計(jì)、方案改進(jìn)、英文修正及文章質(zhì)控；袁軍對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。