虎杖灌胃大鼠血尿中蒽醌類代謝物的LC-MS分析

康 威,沈詠梅,鄧巧虹,余輝攀,林青華,張宏桂

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 100102;2.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠,長春 130012)

中藥虎杖系蓼科蓼屬植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根莖和根[1],具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛和止咳化痰的功效,主要含有蒽醌類化合物.目前已有的研究均利用高效液相色譜(HPLC)法測定血清或血漿等生物樣品中的蒽醌類成分,由于代謝物成分較復(fù)雜,因此干擾較多[2].液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)方法多用于單一成分試藥的代謝產(chǎn)物鑒定[3-4],本文以中藥樣品中蒽醌類代謝物的LC-MS分析為例,探討復(fù)雜樣品中某一成分代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)是否因多成分共存而改變,并建立LC-MS法測定大鼠灌胃虎杖提取物后的血漿和尿液中主要代謝產(chǎn)物的方法.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與藥品

Agilent 1100系列液質(zhì)聯(lián)用儀；Agilent LC/MSD Trap XCT Plus型質(zhì)譜;二極管陣列檢測器;高壓二元梯度泵;自動進(jìn)樣器;ChemStations工作站.

大黃素甲醚、大黃酚大黃素和蘆薈大黃素購自中國食品藥品檢定研究院；色譜級甲醇；水為二次蒸餾水并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾;虎杖提取物為自制;Wistar大鼠由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供.

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18(4.6mm×250 mm,5 μm),柱溫為室溫(25 ℃)；流動相見表1；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL.

表1 甲醇-水線性梯度洗脫流動相Table 1 Linear gradient elution mobile phase of methanol-water

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,離子源溫度350 ℃,毛細(xì)管電壓3.5 kV,霧化壓力275.8 kPa,干燥氮?dú)饬魉?0 L/min,質(zhì)譜掃描范圍m/z50～750,負(fù)離子檢出模式.

1.2.3 化學(xué)對照品溶液配置 稱取適量大黃酚、大黃素甲醚、大黃素和蘆薈大黃素對照品,置于50 mL 量瓶中,用甲醇定容,搖勻,得上述4種標(biāo)準(zhǔn)品的混合液.

1.2.4 大鼠血漿樣品的采集及處理 取健康雄性Wistar大鼠6只,平均210 g,置于代謝籠中,給藥前禁食,可自由飲水12 h.用虎杖提取物水溶液灌胃,給藥劑量為200 mg/kg.大鼠灌胃后,分別于1,3,6,12,24 h由大鼠眼底靜脈叢取血,置于1 mL肝素化的離心管中,以3 000 r/min離心10 min,取上清液即得血漿樣品.用甲醇和水各3 mL依次活化Cleanert C18SPE固相萃取柱,上樣3 mL,用2 mL水洗脫,再用2 mL甲醇洗脫,甲醇液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后用于LC-MS分析.

1.2.5 大鼠尿液的采集與處理 取健康雄性Wistar大鼠6只,給藥前禁食,可自由飲水12 h.取虎杖提取物,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基纖維素鈉制成混懸液,按200 mg/kg灌胃給藥,分別收集1,3,6,12,24 h的尿液.尿液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后萃取.用甲醇和水各3 mL依次活化Cleanert C18 SPE固相萃取柱,上樣3 mL,用2 mL水洗脫,再用2 mL甲醇洗脫,甲醇液用于LC-MS分析.

2 結(jié) 果

2.1 血漿樣品中蒽醌代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

6 h血漿樣品經(jīng)LC-MS測定所得總離子流如圖1所示.分析圖1中的峰1可得其MS2碎片離子如圖2所示.由圖2可見,其一級譜的基峰m/z269[M-H],并出現(xiàn)強(qiáng)峰m/z187和弱峰m/z225.與大黃素HPLC保留時(shí)間(46 min)及其質(zhì)譜碎片離子比較[2],鑒定其為大黃素.

24 h血漿樣品經(jīng)LC-MS測定所得總離子流如圖3所示.分析圖3中的峰2可得其MS2碎片離子如圖4所示.由圖4可見,其一級質(zhì)譜基峰為m/z253[M-H],并出現(xiàn)強(qiáng)峰m/z187和弱峰m/z87.與大黃酚HPLC保留時(shí)間(48 min)及其質(zhì)譜碎片離子比較[2],鑒定其為大黃酚.分析圖3中的峰3可得其MS2碎片離子如圖5所示.由圖5可見,其一級質(zhì)譜基峰為m/z283[M-H],并出現(xiàn)較強(qiáng)峰m/z175和m/z113.與大黃素甲醚的HPLC保留時(shí)間(53 min)及其質(zhì)譜碎片離子比較[5],鑒定其為大黃素甲醚.

圖1 6 h血漿樣品總離子流Fig.1 Total ion chromatogram of the plasma sample collected at 6 h after the last administration

圖2 圖1中峰1的MS2碎片離子Fig.2 MS2 of the fraction of peak 1 from Fig.1

圖3 24 h血漿樣品總離子流Fig.3 Total ion chromatogram of the plasma sample collected at 24 h after the last administration

圖4 圖3中峰2的碎片離子Fig.4 MS2 of the fraction of peak 2 from Fig.3

圖5 圖3中峰3的碎片離子Fig.5 MS2 of the fraction of peak 3 from Fig.3

2.2 尿液試樣蒽醌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

對尿液樣品進(jìn)行LC-MS檢測,共檢測到4種代謝產(chǎn)物,其碎片離子如圖6所示.

(A) 大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物一級質(zhì)譜;(B) 大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物二級質(zhì)譜;(C) 大黃素質(zhì)譜;

由圖6可見: 第一種蒽醌代謝產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰m/z為445,比m/z269增加了176個(gè)質(zhì)量單位,具有典型的葡萄糖醛酸化代謝途徑的質(zhì)譜特征[6],因此推測該蒽醌代謝產(chǎn)物為大黃素的葡萄糖醛酸結(jié)合物;第二種蒽醌代謝產(chǎn)物的分子量為270,與對照品比較鑒定為大黃素[5];第三種蒽醌代謝產(chǎn)物準(zhǔn)分子離子峰m/z為365,與對照品蘆薈大黃素結(jié)構(gòu)碎片比較,判斷該代謝產(chǎn)物可能為蘆薈大黃素的磺酸化結(jié)合物[6];第四種代謝產(chǎn)物準(zhǔn)分子離子峰的m/z為462,推斷其可能為蘆薈大黃素的葡萄糖醛酸結(jié)合物[6].

3 討 論

1) 在虎杖提取物以多種成分給藥的條件下,本文鑒定的蒽醌類化合物與單一蒽醌化合物給藥具有相同的代謝產(chǎn)物[6],表明虎杖提取物其他成分對這些蒽醌化合物在大鼠體內(nèi)的代謝未構(gòu)成干擾；

2) 虎杖蒽醌類提取物在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要以大黃素原形物和葡萄糖醛酸結(jié)合物及硫酸酯綴合物的形式存在;

3) 利用本文方法對血漿和尿液中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測時(shí),質(zhì)譜可給出較多的碎片離子,有利于確定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu).

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