表皮生長因子家族成員調控卵泡發(fā)育的分子機制研究進展

賈瓊邛，方蘭蘭

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖與遺傳專科醫(yī)院，鄭州 450052)

卵泡的生長發(fā)育過程與卵子及其周圍體細胞的相互作用密切相關，卵母細胞和顆粒細胞主要通過縫隙連接進行雙向信息交流及新陳代謝物質傳遞[1]。卵母細胞通過分泌卵源性生長因子作用于卵丘細胞、壁層顆粒細胞和卵泡膜細胞，促進其增生、分化成熟、甾體類激素生成和卵泡的生長發(fā)育等過程[2]。此外，卵丘細胞、壁層顆粒細胞和卵泡膜細胞也可通過旁分泌/自分泌途徑調控卵母細胞的功能。在調控卵泡發(fā)育的因子中，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)家族成員在卵泡中有所表達，且參與調控卵泡發(fā)育過程中多種生物學事件。本文獻綜述了EGF家族成員在卵泡生長發(fā)育各階段中的作用及其機制。

一、EGF家族與ErbB家族

(一)EGF家族成員

EGF家族成員為包含N末端延伸區(qū)、1個或多個EGF結構域、短近膜莖、疏水性跨膜結構域和羧基末端片段的I型跨膜蛋白，是一組在結構和功能上具有高度相似性的有內在酪氨酸激酶活性的蛋白質，可促進體內多種類型組織和細胞分裂增生[3-4]。EGF家族成員包含11種蛋白質：EGF、肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、雙調蛋白(AREG)、表皮生長素(EREG)、β-纖維素(BTC)、神經調節(jié)蛋白(NRG；包含NRG1、NRG2、NRG3、NRG4四個成員)和表皮細胞分裂原(Epigen)等[3]。

(二)ErbB超家族成員

EGF受體(EGFR)是一種分子量為170 kDa的細胞膜糖蛋白，是Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶受體，具有配體誘導的酪氨酸蛋白激酶活性，廣泛表達于多種細胞表面。EGFR也稱為ErbB1，屬于受體酪氨酸激酶類蛋白(RTKs)，是ErbB超家族中的一員，該家族的其它成員還包括：ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。ErbB家族成員在結構和功能上具有相似性，這些受體包含1個由四部分組成的富含半胱氨酸的細胞外結構域、單一跨膜區(qū)和1個具有酪氨酸激酶功能的細胞內結構域[5]。ErbB家族成員在卵巢中廣泛表達，在卵泡發(fā)育的整個過程中，它們在卵泡膜細胞、壁顆粒細胞、卵丘細胞及卵母細胞中均有不同程度的表達。

(三)EGF家族配體與受體相互結合及信號通路

1.EGF/ErbB結合：ErbB家族成員可單獨存在，也可以以組合形式形成同型二聚體(兩個相同類型的ErbB受體結合在一起)或異型二聚體(兩個不同的ErbB受體結合在一起)。EGF家族與ErbB家族受體結合的情況可分為3類：EGF、TGF-α、AREG與EGFR結合；BTC、HB-EGF、EREG與EGFR、ErbB4結合；NRG又可分為兩種結合情況：NRG1和NRG2主要與ErbB3、ErbB4結合，而NRG3和NRG4則與ErbB4結合[6]。

2.ErbB信號通路：每個ErbB家族成員在其C末端擁有不同位置及數量的磷酸化位點，ErbB家族成員結合的配體種類或受體間形成的二聚體類型決定了后續(xù)激活的磷酸化位點及其下游的信號通路，ErbB受體家族可激活包括Ras/Raf/絲裂原激活的蛋白激酶(MEK)/細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)通路，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT途徑和PLCγ級聯(lián)在內的多種信號網絡[6-8]。

二、EGF家族調控卵泡發(fā)育

(一)EGF在卵泡發(fā)育過程中的作用

1.EGF促進卵母細胞成熟和卵丘擴張：EGF在卵母細胞中的表達始于竇前卵泡，隨著卵泡發(fā)育其表達量逐漸增加，參與卵母細胞減數分裂的恢復、誘導生發(fā)囊泡破裂(GVBD)及卵丘擴張等一系列生殖活動[9]。

卵母細胞中cAMP通過抑制減數分裂促進因子(MPF)的產生使卵母細胞停滯于減數分裂Ⅰ期[10]；cGMP在卵丘細胞和顆粒細胞中由C型利鈉肽(CNP)通過激活鳥苷酸環(huán)化酶利鈉肽受體2(NPR2)產生，經縫隙連接傳遞至卵母細胞，抑制卵母細胞內cAMP水解酶磷酸二酯酶3A(PDE3A)活性，進而抑制cAMP降解[10]；EGF通過阻斷cGMP和cAMP進入卵母細胞解除其對卵母細胞減數分裂的阻滯，使卵母細胞減數分裂恢復[11]。此外，EGF可激活ERK1/2途徑并增加卵丘卵母細胞復合物(COC)中卵丘細胞對Ca2+的吸收，調控卵丘擴張基因透明質酸合酶2(Hyaluronan synthase 2，Has2)的表達，參與卵丘擴張[12]。在體外培養(yǎng)的小鼠COC中添加EGF證實其對卵母細胞成熟具有促進作用，并觀察到EGF刺激卵丘擴張的作用強于卵泡刺激素(FSH)[13]。此外，體外培養(yǎng)的羊COC中添加EGF可提高核成熟率[14]。

2.EGF調控甾體激素生成：甾體激素的生成需要將膽固醇運輸至線粒體膜內，這一過程由類固醇生成急性調節(jié)蛋白(StAR)調控。LH和FSH分別與位于卵泡膜細胞上的LH受體和顆粒細胞上的FSH受體結合，促進膽固醇在3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)及膽固醇側鏈裂解酶P450(P450scc)作用下合成孕激素，后者在細胞內經17α-羥化酶作用合成雄激素；通過基底膜進入到顆粒細胞的雄激素在P450芳香化酶(Aromatase)的作用下轉化為雌激素。StAR及Aromatase等作為調控甾體激素生成過程中各限速步驟的關鍵酶，在甾體激素生成中發(fā)揮重要作用[15]。

除卵母細胞外，EGF在卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞中的表達量從竇卵泡到排卵前卵泡逐漸增多，直至黃體中期，隨著黃體的退化其表達量逐漸減少。EGF一方面抑制FSH介導的人顆粒細胞內Aromatase的活性，且該作用與卵泡大小成正相關；另一方面增加FSH受體的數量并促進FSH與顆粒細胞相結合，故其最終效應為增加雌激素的生成[16]。同時，EGF上調人黃素化顆粒細胞中3β-HSD和P450scc的表達，增加孕激素的產生并調控顆粒細胞的增殖與分化[17]。在小鼠卵母細胞-顆粒細胞體外培養(yǎng)的實驗中，EGF可通過與EGFR結合促進顆粒細胞中孕激素、睪酮及雌激素表達，EGFR的特異性抑制劑AG1478可阻斷該效應[18]。

(二)AREG、EREG及BTC在卵泡發(fā)育中的作用

1.AREG、EREG、BTC促進卵母細胞成熟：前述卵母細胞內高水平cAMP和cGMP可維持卵母細胞減數分裂靜止狀態(tài)。LH誘導排卵前卵泡顆粒細胞分泌AREG、EREG 和BTC等EGF樣肽[19]，它們與位于顆粒細胞上的受體結合后使EGFR磷酸化，一方面抑制CNP基因的表達使 NPR2活性降低，并激活磷酸二酯酶5(PDE5)促進cGMP水解，使其進入卵母細胞的量減少，進而激活PDE3A使cAMP水平下降，有助于卵母細胞減數分裂恢復[20]；另一方面，EGF樣肽增強了COC的間隙連接蛋白磷酸化并促使間隙連接關閉，最終導致cGMP和cAMP進入卵母細胞的量減少，緩解了二者對卵母細胞減數分裂的阻滯，使卵母細胞減數分裂恢復[10，19]。

在包括人在內的多種哺乳動物體外實驗中證實了添加外源性EGF樣肽可加速卵母細胞減數分裂恢復。在LH作用下人卵泡液中AREG、EREG和BTC水平上調，與EGFR結合后抑制CNP/NPR2產生cGMP并關閉間隙連接從而促進卵母細胞減數分裂恢復與成熟，而抑制EGFR活性可減弱LH誘導的cGMP降低[9，11，21]。在小鼠COC中，AREG/EGFR信號傳導可減少顆粒細胞內cGMP水平；使用AG1478可阻滯AREG誘導的卵母細胞成熟和COC擴張，但培養(yǎng)前去除卵丘顆粒細胞后，未見AG1478對卵母細胞成熟的阻滯[22-23]，進一步揭示了EGF類生長因子不是直接作用于卵母細胞，而是通過作用于卵丘顆粒細胞進而影響卵母細胞成熟。

2.AREG、EREG及BTC促進卵丘擴張：卵丘擴張涉及兩個關鍵步驟，其一Has2調控促進透明質酸基質合成，其二EGFR被活化后激活下游Ca2+通路和ERK1/2通路介導的卵丘細胞脫離和運動。AREG、EREG和BTC水平上調后促進富含透明質酸的基質合成及透明質酸穩(wěn)定因子五聚蛋白3(Ptx3)、腫瘤壞死因子α誘導蛋白6(Tnfaip6)增加，同時激活ERK1/2和細胞內Ca2+信號通路上調鈣蛋白酶活性，抑制鈣蛋白酶活性則可阻止COC中卵丘細胞的脫離、突起的形成及卵丘細胞的運動[12，24]。LH激增也可刺激前列腺素-過氧化物合酶2[Ptgs2，又稱環(huán)氧合酶2(COX2)]快速表達[25]，導致前列腺素E2(PGE2)增加，PGE2通過與其受體結合維持EGF樣肽在顆粒細胞和卵丘細胞中的表達。EGF樣肽和PGE2協(xié)同刺激卵丘細胞產生透明質酸和透明質酸穩(wěn)定因子，促進卵丘擴張[12]。

在恒河猴COC中添加AG1478可降低卵母細胞成熟度及卵丘擴張[12]。Liu等[26]的小鼠實驗證實AREG、EREG和BTC通過升高G蛋白偶聯(lián)受體30(GPR30)水平來增加17β-E2介導的卵丘擴張相關基因(Has2、Ptgs2、Ptx3和Tnfaip6)表達。在小鼠COC中，AREG和EREG可增強氨基己糖通路生物代謝活性，增加透明質酸的合成，同時有增強卵丘細胞糖基化的作用[12，27]。在動物實驗中已證實了糖基化與卵母細胞的發(fā)育能力相關，但其作用機制與途徑尚不清楚[10，28]。

3.AREG、EREG及BTC促進排卵：PGE2不僅是促進卵泡壁破裂的關鍵因子，亦通過誘導排卵基因(如Areg、Ereg、Has2和Tnfaip6)的表達以及增加細胞內cAMP水平在排卵級聯(lián)反應中發(fā)揮作用[29]。COX2是動物排卵前卵泡中催化PGE2產生的關鍵酶[29]。在靈長類和其他哺乳動物中，LH激增刺激COX2的表達和顆粒細胞產生PGE2，PGE2在卵泡中的濃度于排卵前達到峰值，以調節(jié)排卵過程中卵泡基底膜破裂、卵泡壁黃素化、卵泡破裂和卵母細胞從卵巢中釋放[30]。

在人顆粒細胞中添加PGE2可激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)及cAMP/PKA、MAPK信號通路促進AREG、EREG的表達，分別使用cAMP/PKA和MAPK的抑制劑H89和U0126可降低該效應；使用COX2抑制劑尼美舒利可有效阻斷LH誘導的AREG、EREG生物合成[31]。此外，AREG、EREG和BTC激活ERK1/2途徑上調顆粒細胞中COX2表達及PGE2產生，在排卵過程中發(fā)揮作用[32]。動物研究表明使用COX2的特異性抑制劑NS398可阻斷大鼠及恒河猴排卵，且這種抑制作用在添加外源性PGE2后發(fā)生逆轉[33]。

血管內皮生長因子(VEGF)可刺激某些蛋白水解內皮酶和纖溶酶原激活劑使卵泡液迅速增多、卵泡壁變薄破裂，從而促進優(yōu)勢卵泡排卵[24]。AREG可通過激活MAPK信號通路上調人顆粒細胞中VEGF的表達量，使用EGFR特異性抑制劑AG1478或ERK1/2抑制劑U0126可減弱AREG作用下的VEGF產生[34]。

4.AREG參與甾體激素的生成：Noma等[35]發(fā)現AREG在人顆粒細胞促進孕激素水平明顯增高。我們的前期研究證實AREG在人顆粒細胞中通過激活PI3K/AKT信號通路上調Aromatase及雌激素表達，且卵泡液內AREG與雌激素呈正相關[36]；此外，AREG通過激活ERK1/2信號通路上調顆粒細胞中StAR的表達與孕激素生成[37]，表明AREG在人黃素化顆粒細胞中參與了雌孕激素的生成。

圖1 AREG、EREG和BTC調控卵泡發(fā)育進程

(三)NRG1在卵泡發(fā)育中的作用

NRG1在卵泡發(fā)育中的作用研究不多，一方面調控卵母細胞成熟及卵丘擴張，另一方面促進AREG作用下的孕激素生成。小鼠COC中外源性添加NRG1后激活PI3K/AKT途徑可延遲卵母細胞減數分裂自發(fā)性恢復的進程，但其延遲卵母細胞中GVBD的分子機制尚待明確；NRG1在COC中與AREG共同處理激活Ca2+途徑和ERK1/2途徑上調卵丘擴張基因Tnfaip6的mRNA水平，參與調控卵丘擴張[12，35]。雖然NRG1單獨作用并不促進孕激素生成，但可通過增強AREG激活的ERK1/2活性上調AREG作用下的孕激素生成[10，35]。

(四)HB-EGF在卵泡發(fā)育中的作用

HB-EGF在卵巢中以兩種形式存在：前體膜錨定形式和成熟分泌形式。使用免疫組化及半定量RT-PCR的方式并未在人卵巢中各階段卵泡中檢測到HB-EGF的表達；而在黃體中，HB-EGF在早期的顆粒細胞中明顯表達，中期時逐漸增多，晚期時其表達量開始下降，并于白體時完全消失，HB-EGF在黃體中表達的階段性變化與月經周期中雌孕激素的變化趨勢高度相似[38]。HB-EGF作為一種抗凋亡因子可抑制人黃素化顆粒細胞的凋亡[39]；此外，HB-EGF在人顆粒細胞中可激活MAPK并增加VEGF的表達量，對卵泡生長及排卵進程有促進作用[34]。

三、總結及展望

綜上所述，EGF家族成員在調控卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用。雖然不同EGF家族成員表達方式和功能存在差異，但其協(xié)調作用于女性卵巢功能調控，促進卵泡生長和成熟。目前關于EGF家族成員在改善排卵障礙、卵母細胞成熟障礙及治療不孕癥中的應用研究尚較缺乏，因此了解EGF家族在調控卵泡生長發(fā)育各階段的作用機制不僅對全面認知卵巢生理功能具有重要意義，還為尋求卵泡發(fā)育異常相關疾病的新型分子診療措施提供了思路。