原核持續(xù)時間預測胚胎發(fā)育潛力的研究

李柔，周靜，2，廖宏慶，2*，周俊，2

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院，衡陽 421001；2.衡陽南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院，衡陽 421001)

自時差成像(time-lapse imaging，TLI)技術(shù)廣泛應用于胚胎觀測后，胚胎學家從中獲取了大量的形態(tài)動力學信息，為準確評估和選擇優(yōu)質(zhì)胚胎提供了新方法。如何準確有效地利用動力學參數(shù)篩選出優(yōu)質(zhì)胚胎，是當前胚胎學家研究的熱點。

受精是嚴格有序的生理過程，是指成熟的精子與次級卵母細胞相互作用并結(jié)合成為受精卵。精卵開始融合時，次級卵母細胞被激活，單倍染色體開始向細胞中央移動，核膜形成，雌原核(female pronucleus)顯現(xiàn)；同時精子核在進入卵子后，核膜發(fā)生崩解，精子核染色質(zhì)解聚，新形成的原核膜包在染色質(zhì)外周，形成雄原核(male pronucleus)，雌雄原核形成的時間對應TLI觀測下的原核出現(xiàn)時間(time of PN appearance，tPNa)。有學者指出，tPNa與精子染色質(zhì)的重塑過程息息相關[1]。伴隨著雌雄原核的發(fā)育，DNA合成和染色質(zhì)的復制同步進行，隨后兩原核的核膜消失，染色體互混，該時間點對應了原核消失時間(time of PN fading，tPNf)。研究顯示tPNf與胚胎后期的囊胚形成[2]、種植[3]、活產(chǎn)[4]和染色體異常[5]有關。配子轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ズ?，細胞周期將重新啟動[6]，從減數(shù)分裂向有絲分裂過渡。原核持續(xù)時間(原核消失時間-原核出現(xiàn)時間，即tPNf-tPNa)包含有絲分裂的分裂間期和分裂期的前期，其中分裂間期會完成DNA分子的復制和相關蛋白質(zhì)的合成，為胚胎后續(xù)的卵裂進行活躍的物質(zhì)準備。

原核的形態(tài)動力學是影響哺乳動物胚胎發(fā)生的重要因素[7]。原核持續(xù)時間可反映胚胎內(nèi)遺傳物質(zhì)的準備時長，該參數(shù)可否對胚胎發(fā)育潛力作出預測，在現(xiàn)有的研究中尚未闡明。本研究對922枚正常受精胚胎的原核持續(xù)時間及后期發(fā)育情況進行回顧性分析，旨在尋找有助于胚胎選擇的新指標。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年9月至2021年1月在衡陽南華星輝生殖健康?？漆t(yī)院行TLI系統(tǒng)觀測的922枚正常受精胚胎作為研究對象。

納入標準：新鮮取卵周期；行短時IVF、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)正常受精來源的胚胎；排除異常受精胚胎。

二、診療回顧

1.控制性促排卵、配子采集及人工授精：根據(jù)患者情況制定個性化治療方案，包括激動劑長方案、拮抗劑方案、氯米酚方案以及自然周期取卵等。結(jié)合B超及激素水平監(jiān)測卵泡生長情況，待主導卵泡直徑達18～20 mm后采用10 000 U HCG(珠海麗珠制藥)扳機，34～36 h后行陰道B超引導下卵泡穿刺取卵術(shù)。男方禁欲3～7 d，于取卵當日通過手淫法取精。根據(jù)雙方病史、精液情況選擇短時IVF或ICSI助孕。短時IVF授精時間為HCG扳機后39.5 h，將精子按1.5×106/ml的濃度與卵子共孵育，5 h后進行脫顆粒，并將其轉(zhuǎn)移至TLI系統(tǒng)中。ICSI授精時間為HCG扳機后41 h，將成熟卵母細胞行單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射，轉(zhuǎn)移至TLI系統(tǒng)中觀察培養(yǎng)。

2.受精評估與胚胎培養(yǎng)：利用時差顯微鏡觀察原核形成情況，若形成2個清晰原核視為正常受精，形成1個或2個以上原核為異常受精，未形成原核考慮為未受精。胚胎培養(yǎng)采用卵裂胚培養(yǎng)液(COOK，美國)和囊胚培養(yǎng)液(COOK，美國)，培養(yǎng)箱環(huán)境為6.0%CO2、5.0%O2、37℃。

3.TLI系統(tǒng)及形態(tài)動力學參數(shù)：本研究所采用的TLI系統(tǒng)是Primo Vision EVO+(Vitrolife，瑞典)，它將培養(yǎng)箱與倒置顯微鏡結(jié)合，通過數(shù)據(jù)線將胚胎發(fā)育過程中采集到的圖片傳輸至培養(yǎng)箱外的電腦中，每間隔10 min對胚胎進行1次拍攝，通過圖片信息來收集胚胎發(fā)育過程中的動力學參數(shù)。此培養(yǎng)系統(tǒng)使用專用16孔微孔培養(yǎng)皿(Vitrolife，瑞典)，每孔存放1枚胚胎，對應不同編號以示區(qū)分。每次觀測的胚胎數(shù)不超過16枚。

動力學參數(shù)：tPNa：至少可見1個清晰原核的時間；tPNf：兩個原核均消失的時間；原核持續(xù)時間：tPNf-tPNa。

4.胚胎評估：D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚參考Istanbul共識中的優(yōu)質(zhì)胚胎標準：受精后第3天胚胎細胞數(shù)為7～9個、細胞大小符合發(fā)育階段、碎片程度小于10%、無多核化的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。囊胚評級按Gardner評分標準，包括囊胚腔大小、內(nèi)細胞團以及外胚滋養(yǎng)層3個指標，評分≥3BB的囊胚視為優(yōu)質(zhì)囊胚。

5.結(jié)局指標及定義：優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成率=優(yōu)質(zhì)卵裂胚總數(shù)/正常受精胚胎總數(shù)×100%；囊胚形成率=總囊胚數(shù)(D5+D6)/行囊胚培養(yǎng)胚胎總數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)(D5+D6)/行囊胚培養(yǎng)胚胎總數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植(鮮胚+凍胚)周期數(shù)×100%(為保證統(tǒng)計結(jié)果的準確性，僅對單胚胎移植的周期數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析)；移植4周后B超檢查見宮內(nèi)孕囊定義為臨床妊娠。

三、分組分析

首先根據(jù)原核持續(xù)時間的長短(以15 h為界)將所有納入研究的胚胎分為兩組：≤15 h組(n=388)和>15 h組(n=534)，比較兩組胚胎的發(fā)育情況，探討該參數(shù)對胚胎發(fā)育潛力的預測意義。

再根據(jù)D5、D6胚胎的發(fā)育情況，將行囊胚培養(yǎng)的764枚胚胎分為成囊組(n=558)和未成囊組(n=206)，比較兩組胚胎的原核持續(xù)時間是否存在差異；考慮到授精方式可能對胚胎的發(fā)育動力學參數(shù)產(chǎn)生影響，根據(jù)不同原核持續(xù)時間和授精方式將胚胎進一步分為：≤15 h IVF組(n=216)和>15 h IVF組(n=317)、≤15 h ICSI組(n=103)和>15 h ICSI組(n=128)，分別比較IVF、ICSI受精胚胎在不同原核持續(xù)時間囊胚形成相關指標的差異。

進一步將原核持續(xù)時間>15 h組細分為3個亞組：>15～17 h組(n=250)、>17～19 h組(n=147)和>19 h組(n=137)，比較各組胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、不同原核持續(xù)時間胚胎的發(fā)育情況及移植結(jié)局

本研究共納入TLI系統(tǒng)觀測的922枚正常受精胚胎。原核持續(xù)時間>15 h組的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和臨床妊娠率較≤15 h組顯著下降(P<0.05)，而兩組間優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同原核持續(xù)時間組胚胎發(fā)育情況及移植結(jié)局比較(%)

二、行囊胚培養(yǎng)的胚胎發(fā)育情況比較

本研究中共有764枚正常受精胚胎在TLI系統(tǒng)觀測下行囊胚培養(yǎng)。

1.不同囊胚培養(yǎng)結(jié)局的分組分析：根據(jù)D5、D6胚胎發(fā)育情況分為成囊組(n=558)和未成囊組(n=206)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，未成囊組的原核持續(xù)時間較成囊組顯著延長(P<0.05)(表2)。

表2 成囊組與未成囊組原核持續(xù)時間比較(-±s)

2.不同原核持續(xù)時間及授精方式的分組分析：無論采用IVF或是ICSI受精，原核持續(xù)時間>15 h組胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均較≤15 h組顯著下降(P<0.05)(表3)。

表3 不同原核持續(xù)時間/授精方式的胚胎囊胚培養(yǎng)結(jié)局比較(%)

三、原核持續(xù)時間>15 h的胚胎細化分組分析

3組中，原核持續(xù)時間>19 h組的優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成率較>15～17 h組、>17～19 h組顯著下降(P<0.05)；隨著原核持續(xù)時間的延長，囊胚形成率顯著下降(P<0.05)。3組間優(yōu)質(zhì)囊胚形成率呈現(xiàn)下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；臨床妊娠率在3組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 原核持續(xù)時間>15 h的胚胎發(fā)育情況亞組分析(%)

討 論

對胚胎進行評估并篩選出具有發(fā)育潛力的胚胎是輔助生殖治療中較為關鍵和核心的步驟之一。TLI技術(shù)作為非侵入性評估系統(tǒng)，為胚胎學家準確評估和選擇優(yōu)質(zhì)胚胎提供了新方法。有研究發(fā)現(xiàn)，整倍體胚胎與非整倍體胚胎間發(fā)育速度存在差異，可將動力學參數(shù)作為胚胎優(yōu)選的候選指標，有望改善臨床結(jié)局[8]。

原核出現(xiàn)至原核消失的時間段內(nèi)，胚胎處于活躍的物質(zhì)準備階段，需要進行一系列DNA分子的復制和相關蛋白質(zhì)的合成。本研究結(jié)果顯示：與原核持續(xù)時間≤15 h組相比，>15 h組其囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和臨床妊娠率均顯著下降(P<0.05)；未成囊組的原核持續(xù)時間較成囊組顯著延長(P<0.05)；當原核持續(xù)時間>15 h，隨著時間的延長，囊胚形成率顯著下降(P<0.05)，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率也呈現(xiàn)下降趨勢，但尚無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)果提示原核持續(xù)時間對于胚胎的成囊情況有一定的預測意義。可能的機制如下：(1)原核持續(xù)時間延長可能反映胚胎存在DNA損傷或染色體異常。DNA損傷是一種常見事件，可導致染色體DNA的突變或缺失，繼而對后續(xù)的胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。胚胎發(fā)育過程中，若DNA出現(xiàn)損傷，可誘發(fā)DNA損傷應答，包括DNA修復、細胞周期檢查點激活以及觸發(fā)凋亡通路[9]，使得細胞周期進程減慢或阻滯細胞周期進程[10]。(2)DNA復制進程遲緩也可能使原核持續(xù)時間延長，與線粒體供能不足相關。線粒體產(chǎn)生的ATP是細胞的主要能量來源[11]，ATP作為卵母細胞成熟、受精及胚胎發(fā)育的能量保證[12]，對胚胎的發(fā)育起著關鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，卵母細胞線粒體是各種應激源的關鍵作用靶點，應激誘導的線粒體功能改變將導致卵母細胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛力下降[11]。

本研究中，囊胚形成率在原核持續(xù)時間>15 h的胚胎分組中隨著時間的推移出現(xiàn)顯著下降，而優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成率在原核持續(xù)時間>19 h亞組才出現(xiàn)下降趨勢。胚胎基因組激活(embryo genome activation，EGA)和轉(zhuǎn)錄活躍的開始標志著從卵母細胞到合子基因程序的轉(zhuǎn)變，這一過程在人類胚胎發(fā)生在4～8細胞階段[13]。如前所述，原核持續(xù)時間延長可能反映了胚胎存在DNA的突變或缺失，但在早期卵裂階段，胚胎在轉(zhuǎn)錄上是沉默的[14]，DNA異常對胚胎發(fā)育的影響在該時期尚未充分體現(xiàn)，僅通過D3發(fā)育情況進行胚胎選擇存在一定局限性。囊胚形成是胚胎早期發(fā)育過程的一個重要階段，多種基因參與囊胚的分化和發(fā)育[15]。Uysal等[16]將與DNA甲基化發(fā)生相關的基因Dnmt1、Dnmt3a敲除，發(fā)現(xiàn)缺乏這些關鍵基因的胚胎多數(shù)發(fā)生退化或停滯于二細胞階段，只有具備完整且正常激活的基因組，胚胎才有可能發(fā)育至囊胚。與D3優(yōu)胚率相比，原核持續(xù)時間的長短可初步判定胚胎是否具有正常的基因組成，因此，在篩選具有發(fā)育潛力的胚胎上更占優(yōu)勢。

對于不同授精方式的胚胎，當原核持續(xù)時間>15 h，后期發(fā)育為囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚的可能性均顯著下降，該時長對IVF、ICSI胚胎的囊胚發(fā)育情況的預測同樣有效。IVF中，精子需穿過卵丘細胞和透明帶，經(jīng)歷精卵識別、精卵結(jié)合以及精卵質(zhì)膜融合等復雜步驟。ICSI技術(shù)借助顯微操作系統(tǒng)，直接將單個精子注射入卵母細胞誘導其受精；然而，實施操作前需人工去除卵母細胞周圍的卵丘細胞，注射精子時會對卵母細胞產(chǎn)生損傷。與IVF相比，ICSI具有侵入性，侵入性的操作是否影響胚胎發(fā)育是胚胎學家較為關心的問題[17]。Sayed等[18]的報道中將IVF與ICSI胚胎的tPNf進行比較，發(fā)現(xiàn)IVF胚胎的tPNf較ICSI延遲0.28 h；Cruz等[19]指出，兩種授精方式的胚胎早期發(fā)育參數(shù)存在差異，但該差異是由參數(shù)的起點不同所致，與胚胎質(zhì)量無明顯關聯(lián)。我們的數(shù)據(jù)表明，原核持續(xù)時間并未受授精方式的顯著影響，與Cruz等[19]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，無論采用何種授精方式，原核持續(xù)時間≤15 h的胚胎囊胚形成率及囊胚質(zhì)量均顯著高于原核持續(xù)時間>15 h的胚胎；原核持續(xù)時間對胚胎發(fā)育潛力有一定的預測價值，有望成為胚胎優(yōu)選的新指標。本研究的不足在于移植的胚胎數(shù)量較少，以及部分隨訪資料缺失，未將活產(chǎn)率及活產(chǎn)兒后期的健康狀況作為結(jié)局指標。在未來的探索中仍需進一步擴大樣本量來加以驗證，還可以通過遺傳學分析等手段，去探究不同原核持續(xù)時間與胚胎正常核型的關系。