食品中黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展

胡冰， 時(shí)浩楠， 胡本倫， 趙思明， 劉茹， 賈才華

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

民以食為天，食品安全問(wèn)題是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大事，其中，真菌毒素對(duì)食品的污染已成為各國(guó)高度關(guān)注的食品安全問(wèn)題［1］。食品在受到真菌毒素污染后，不僅食用價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值降低，還會(huì)對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成極大的傷害。此外，某些真菌毒素還具有致癌［2］、致畸［3］和致突變［4］作用。據(jù)FAO發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球每年被真菌毒素污染的糧食約占糧食總產(chǎn)量的1/4，不僅造成大量浪費(fèi)，還給世界農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重影響［5-7］。我國(guó)是受真菌毒素影響較為嚴(yán)重的國(guó)家之一［8］，每年因真菌毒素污染糧食造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)680億～850億元［9］，而黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是對(duì)人體危害較大且較常見(jiàn)的真菌毒素之一。鑒于此，本文概述了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)注度較高的黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，介紹了近幾年檢測(cè)技術(shù)的最新進(jìn)展，分析了這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在為各類食品中黃曲霉毒素檢測(cè)方法的選擇提供參考，為解決我國(guó)有關(guān)真菌毒素污染的食品安全問(wèn)題提供一定的技術(shù)支撐。

1 黃曲霉毒素概況

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物［10］，是一類結(jié)構(gòu)相似的化合物，可分為B系和G系兩個(gè)大類，其基本結(jié)構(gòu)都有二呋喃環(huán)和香豆素，是二呋喃香豆素的衍生物?，F(xiàn)已分離出 B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1等十幾種，其中B系為甲氧基、二呋喃環(huán)、香豆素、環(huán)戊烯酮的結(jié)合物；G系結(jié)構(gòu)與B系類似，但其中的環(huán)戊烯酮被替換為環(huán)內(nèi)酯。在自然環(huán)境下，從被AFT污染的食品中只檢測(cè)出了黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素M1（AFM1）和黃曲霉毒素M2（AFM2）6種，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

AFT對(duì)人和動(dòng)物來(lái)說(shuō)都是劇毒物，但不同種類的AFT之間毒性差異很大。AFB1的毒性最強(qiáng)［11-12］，是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，僅次于肉毒梭菌的代謝產(chǎn)物肉毒毒素，是當(dāng)今發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的真菌毒素［13］。AFB1不僅具有極強(qiáng)的急性毒性，還具有慢性毒性［14］，若在短期內(nèi)大量攝入被AFB1污染的食品，會(huì)造成嚴(yán)重的肝損傷和膽管增生，危及生命；若在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)攝入一定量的AFB1，則表現(xiàn)為生長(zhǎng)障礙和慢性肝損傷［15］。此外，AFB1還是目前已知致癌性最強(qiáng)的毒物，1993年WHO就將其列為一類致癌物［16］，主要誘發(fā)肝癌［17］。AFM1是動(dòng)物攝入被 AFB1污染的飼料后在肝臟微粒體單氧化酶催化作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物［18］，毒性僅次于 AFB1［19］。

AFT造成的食品污染在世界范圍內(nèi)相當(dāng)廣泛，其中AFB1主要污染對(duì)象為堅(jiān)果類（花生、核桃、開(kāi)心果、松子等）、谷物類（玉米、小麥、大米、高粱等）食品，尤其以花生、玉米受污染的程度最重［20］，植物油、香辛料以及一些中藥材也存在易受AFB1污染的問(wèn)題。AFM1則通常分布于動(dòng)物組織（肝臟、腎臟、肌肉）、動(dòng)物體液（乳汁、尿液）和卵中［21］，乳及乳制品受 AFM1的污染最為嚴(yán)重［22］。因此，許多國(guó)家都針對(duì)AFT制定了嚴(yán)苛的限量標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)AO發(fā)布的世界食品和飼料真菌毒素法規(guī)顯示，全球已有100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)制定了各類食品中AFT的限量標(biāo)準(zhǔn)［23］。為便于比較國(guó)內(nèi)外關(guān)于AFT限量標(biāo)準(zhǔn)的差異，表1梳理了我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017［24］，以及美國(guó)、食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）、日本和歐盟等國(guó)家、組織或地區(qū)對(duì)于AFT的限量標(biāo)準(zhǔn)［25-29］。

理化性質(zhì)上，AFT具有極強(qiáng)的耐熱性，普通的烹調(diào)方式難以將其完全破壞，280～300℃的高溫才能將其裂解。AFT在水中的溶解度很低，但能溶于油脂和多種有機(jī)溶劑，經(jīng)紫外線照射可產(chǎn)生熒光［30］。此外，AFT不耐堿，加堿處理也能使一些毒素喪失活性，若遇5%的次氯酸鈉，則可瞬間被破壞。

2 食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法

目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的食品AFT檢測(cè)方法主要有儀器分析法（高效液相色譜法［31-32］、液相色譜?質(zhì)譜法［33］）、免疫分析法（酶聯(lián)免疫吸附法［34］、時(shí)間分辨熒光免疫分析法［35］、膠體金免疫層析法［36］）、表面增強(qiáng)拉曼光譜法［37］和電化學(xué)傳感器法［38］等。

2.1 儀器分析法

2.1.1 高效液相色譜法 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）于 20世紀(jì)70年代獲得迅猛發(fā)展，成為一種常規(guī)高效分離分析技術(shù)，是目前各種色譜模式中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。HPLC分析的基本原理是以液體充當(dāng)流動(dòng)相，利用高壓輸液系統(tǒng)將流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱中，流動(dòng)相中各種不同組分經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)。AFT的檢測(cè)普遍采用HPLC法，該方法不僅具有較高的檢測(cè)分離效能，還可同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素。

表1 國(guó)內(nèi)外食品中黃曲霉毒素限量比較Table 1 Comparison of aflatoxin limits in food at home and abroad

由于食品中AFT的殘留通常極其微量，故而HPLC法常與快速穩(wěn)定的前處理方法結(jié)合使用，行之有效的前處理方法對(duì)于分析結(jié)果的準(zhǔn)確與否起著決定性作用。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，食品樣品中AFT的提取、凈化和富集方法有機(jī)溶劑用量大且操作過(guò)程較為繁瑣，因而有必要開(kāi)發(fā)出一種快速、高效的方法用于AFT的前處理。目前較為常用的是免疫親和柱（immunoaffinity chromatography，IAC）凈化法［39］，該方法具有有機(jī)溶劑消耗少、基質(zhì)干擾少、特異性強(qiáng)、靈敏度高和適用于各種復(fù)雜食品基質(zhì)等特點(diǎn)［40］。周欣等［41］采用免疫親和凈化?高效液相色譜法測(cè)定了麥麩中4種AFT（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的含量，樣 品 提 取 后經(jīng)IAC凈化進(jìn)行HPLC檢測(cè)，最低檢出限（limit of detection，LOD）分 別 為 5.6×10?4、2.3×10?4、1.08×10?3和 4.3×10?4μg·kg?1。然而 IAC 也存在一定的缺點(diǎn)，如柱子儲(chǔ)存時(shí)間有限、不能回收利用且價(jià)格昂貴等。近年來(lái)，新型吸附材料制備技術(shù)的發(fā)展為食品中AFT殘留的提取和凈化提供了全新選擇［42］。Saini等［43］基于固相萃取原理，以C18為吸附劑對(duì)飲用水中的痕量AFB1進(jìn)行濃縮和富集，然后進(jìn)行HPLC分析，樣品LOD為0.012 ng·mL?1，定量限（limit of quantitation，LOQ）為 0.039 ng·mL?1，回收率為98.01%～98.65%，可用于飲用水中AFB1的痕量水平檢測(cè)和定量。Mohammad等［44］制備了適配體功能化磁性納米粒子（aptamer functionalized magnetic nanoparticles，AMNPs）充當(dāng)吸附劑，用來(lái)提取和濃縮牛奶樣品中的痕量AFM1，然后用HPLC進(jìn)行定量分析，該方法的LOD為0.2 ng·L?1，是迄今為止所報(bào)道的最小值。

HPLC法雖具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但樣品需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的前處理且經(jīng)濟(jì)成本較高；無(wú)法較好地掌握色譜分析條件，分析方法的建立較為耗時(shí)，不能滿足大批量樣品快速檢測(cè)的需求；定性、定量分析均需要標(biāo)準(zhǔn)品作為參比；選擇性較差，在使用反相色譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)常常會(huì)受到一些保留行為類似物質(zhì)的干擾從而造成檢測(cè)誤差，梯度淋洗技術(shù)雖然可以較好地克服這個(gè)問(wèn)題，但會(huì)延長(zhǎng)樣品的分析時(shí)間［45］。

2.1.2 液相色譜?質(zhì)譜法 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatogram tandem mass spectrometry，LC-MS）將液相色譜與質(zhì)譜2種檢測(cè)儀器有效結(jié)合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，液相色譜有對(duì)復(fù)雜樣品的高效分離能力，而質(zhì)譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息，LC-MS將二者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，顯著提高了待測(cè)物定量分析的可靠性與準(zhǔn)確度，具有較好的分離性能與高通量的檢測(cè)水平［46］。鑒于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在分析之前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理（改變分析物的結(jié)構(gòu)，使其沸點(diǎn)降低而易于離子化），較為復(fù)雜［47］，在此不作介紹。

由于該方法兼具色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高效分離能力與質(zhì)譜檢測(cè)的通用性，故普遍適用于真菌毒素的檢測(cè)且具有較高的靈敏度，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于真菌毒素的篩檢中［10］，亦可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種真菌毒素的定性和定量分析。LC-MS在分析前，通常需要將樣品中的待檢組分提取出來(lái)，較為常用的方法是溶劑一步提取法。Deng等［48］采用LC-MS對(duì)海產(chǎn)品中的4種真菌毒素（AFB1、T-2毒素、赭曲霉毒素A和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）進(jìn)行了同步測(cè)定，樣品經(jīng)乙腈?水（85/15，體積分?jǐn)?shù)）溶液提取后，用正己烷脫脂凈化，隨后進(jìn)入儀器，該方法對(duì)4種真菌毒素的LOD為0.1～2.0 μg·kg?1，LOQ 為 0.3～5.0 μg·kg?1，回收率為72.2%～98.4%。Varga等［49］用乙腈?水?甲酸（79/20/1，體積分?jǐn)?shù)）處理小麥樣品中的12種真菌毒素，LCMS定量，LOQ為0.02～161 μg·kg?1，回收率為88%～120%。傳統(tǒng)的一步提取法雖然具有處理簡(jiǎn)單、目標(biāo)成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一定的局限性，其在提取過(guò)程中有機(jī)溶劑用量相對(duì)較大，同時(shí)在對(duì)于一些成分復(fù)雜的食品基質(zhì)進(jìn)行提取時(shí)，樣品中其他成分可能會(huì)被一并提取出來(lái)，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性并造成質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)樣口的污染［50］。QuEChERS法很好地克服了以上問(wèn)題，它不僅大大降低了有機(jī)溶劑的使用，節(jié)約了時(shí)間和成本，而且具有較強(qiáng)的抗干擾能力和更高的回收率［51］。Miro-Abella等［52］用植物性飲料樣品測(cè)試了其提取回收率，結(jié)果在80%～91%，樣品提取后經(jīng)LC-MS分析，植物性飲料中AFB1和AFG1的LOQ分別為15和0.05 μg·L?1。 Ouakhssase 等［53］采 用 改 進(jìn) 的QuEChERS方法對(duì)玉米樣品中4種AFT（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）進(jìn)行提取，該方法溶劑用量少且無(wú)需純化步驟，提取完成后進(jìn)行LC-MS分析，LOD為0.11～0.36 μg·kg?1，LOQ為0.36～1.19 μg·kg?1，均低于歐盟規(guī)定的最高允許水平，除AFB2外回收率均在70%～110%。

LC-MS法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生處理，具有分離能力強(qiáng)、靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，能較好滿足食品中AFT檢測(cè)的要求，但要求測(cè)試人員必需掌握一定的專業(yè)知識(shí)，否則難以操作；高昂的儀器成本；分析測(cè)試通常只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求等制約了其進(jìn)一步推廣。因此，開(kāi)發(fā)易操作、低成本、可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)真菌毒素的LC-MS技術(shù)已成為未來(lái)研究的熱點(diǎn)。表2列舉了不同方法的特點(diǎn)和應(yīng)用效果，以便更加直觀地對(duì)比每組方法。

2.2 免疫分析法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是將待測(cè)物的抗原（或抗體）吸附于固相載體表面，加入酶標(biāo)記的抗體（或抗原），使其在固相載體表面發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，再添加酶反應(yīng)的底物，顯色后即可根據(jù)顏色的深淺、有無(wú)進(jìn)行定性或定量分析。為了進(jìn)一步提高ELISA的靈敏度以滿足痕量檢測(cè)的需要，Zhan等［54］開(kāi)發(fā)了一種動(dòng)態(tài)光散射?直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（dynamic light scattering-direct competitive ELISA，DLS-dcELISA），用于超靈敏檢測(cè)玉米中的AFB1。該方法采用基于散射的DLS信號(hào)來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的基于吸收的比色信號(hào)作為免疫分析信號(hào)輸出，利用葡萄糖氧化酶（glucos oxidase，GOx）氧化葡萄糖生成過(guò)氧化氫（H2O2）的特點(diǎn)，將GOx作為AFB1的載體制備了GOx-AFB1競(jìng)爭(zhēng)抗原，生成的H2O2可在辣根過(guò)氧化物酶（horseradish reroxidase，HRP）和酪胺（TYR）存在的條件下觸發(fā)膠體金納米粒子（gold nanoparticle，AuNP）聚集，從而顯著放大AuNP的散射信號(hào)，再將散射信號(hào)整合到dcELISA中進(jìn)行 AFB1的檢測(cè)（圖 2）。LOD 為 0.12 pg·mL?1，比傳統(tǒng)的比色ELISA法低約385倍，樣品平均回收率為90.6%～107.0%。由于傳統(tǒng)ELISA法在測(cè)定時(shí)常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象，為了避免這一現(xiàn)象的發(fā)生，Xu等［55］建立了一種基于金屬?有機(jī)框架（metal-organic framework，MOF）的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。該方法將傳統(tǒng)ELISA法中的天然酶替換為功能性MOF，以催化生色 系 統(tǒng) ，LOD 為 9×10?3ng·mL?1。 與 傳 統(tǒng) 的ELISA相比，針對(duì)AFB1開(kāi)發(fā)的MOFLISA法的LOD值提高了20倍，樣品回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為86.41%～99.74%和2.38%～9.04%，有效降低了假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)頻率。

圖2 DLS-dcELISA法結(jié)合H2O2介導(dǎo)的TYR信號(hào)放大系統(tǒng)［54］Fig.2 DLS-dcELISA method combined with H2O2-mediated tyramine signal amplification system［54］

近年來(lái)，ELISA憑借靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于各學(xué)科的分析測(cè)試中，成為我國(guó)谷物、糧油和其他食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的真菌毒素篩選和檢測(cè)方法。但仍存在一些不足，如測(cè)定時(shí)緩沖溶液的性質(zhì)（pH、離子強(qiáng)度等）［56］、溫度等因素會(huì)顯著影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要準(zhǔn)確把控；標(biāo)記物酶穩(wěn)定性差、易失活；檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差且無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素；自動(dòng)化程度低及假陽(yáng)性頻率高等。

2.2.2 時(shí)間分辨熒光免疫分析法 時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是一種新型超微量檢測(cè)技術(shù)，其利用具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物作為示蹤物來(lái)標(biāo)記抗原（抗體），再結(jié)合高靈敏度的時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，對(duì)波長(zhǎng)和時(shí)間2個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可較大程度地減少背景干擾，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［57］。在食品真菌毒素的檢測(cè)中，常用的反應(yīng)體系有抗原抗體免疫反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)和靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等，測(cè)試物經(jīng)反應(yīng)體系作用后進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度測(cè)定，進(jìn)而在標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線上查出反應(yīng)體系中測(cè)試物的濃度，實(shí)現(xiàn)精確定量［58］。Guo等［59］開(kāi)發(fā)了牛乳中AFM1的間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA法：首先，將AFM1與牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶聯(lián)，形成AFM1-BSA結(jié)合物抗原，加入抗AFM1抗體進(jìn)行孵育，AFM1-BSA結(jié)合物抗原與抗AFM1抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成AFM1-BSA-抗AFM1抗體復(fù)合物；再加入銪（Eu）標(biāo)記的羊抗兔抗體（goat anti rabbit IgG-Eu）進(jìn)行二次孵育，孵育完成加入增強(qiáng)液，用全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析（圖3）。此方法對(duì)AFM1的LOD為6×10?3μg·kg?1，LOQ為0.022 μg·kg?1。盧迪莎等［60］開(kāi)發(fā)了一種基于TRFIA的試紙，可同時(shí)篩檢玉米樣品中的AFB1和赭曲霉毒素A：首先以Eu系時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記AFB1和赭曲霉毒素A單克隆抗體制備熒光探針，而后與免疫層析試紙條進(jìn)行組裝；組裝后的試紙條對(duì)2種真菌毒素的肉眼LOD分別為 3.70、5.55 μg·kg?1，整個(gè)測(cè)試過(guò)程約為 20 min且開(kāi)發(fā)的試紙條性質(zhì)穩(wěn)定可在4℃保存5個(gè)月以上，能較好滿足大批量樣品現(xiàn)場(chǎng)篩檢的要求，應(yīng)用前景廣闊。目前該方法僅限適用于玉米樣品的篩檢，對(duì)AFT類似物也存在較高的交叉反應(yīng)，還需進(jìn)一步深入研究來(lái)克服這些問(wèn)題。

表2 儀器分析法檢測(cè)食品中的黃曲霉毒素Table2 Determination of aflatoxin in food by instrumental analysis

圖3 間接競(jìng)爭(zhēng)TRFIA法檢測(cè)AFM1原理［59］Fig.3 AFM1detection by indirect competitive TRFIA［59］

TRFIA是超微量分析領(lǐng)域中的一項(xiàng)新興技術(shù)，它將酶標(biāo)記技術(shù)、放射性標(biāo)記技術(shù)以及同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合［61］，具有分析速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展?jié)摿薮?。但TRFIA所使用的同位素的半衰期及其產(chǎn)生的放射性會(huì)對(duì)人體造成傷害并可能導(dǎo)致環(huán)境污染。此外，大多數(shù)螯合劑為有毒物質(zhì)，對(duì)測(cè)試人員的身體健康有潛在威脅，且螯合劑的熒光壽命較短，產(chǎn)生的背景信號(hào)也容易受到干擾。

2.2.3 膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析技術(shù)（immune colloidal gold technique，GICT）是20世紀(jì)90年代興起的一種免疫分析技術(shù)，其以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，硝酸纖維膜充當(dāng)固相載體，基于抗原和抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)，利用毛細(xì)管作用使得含有待測(cè)物的液體從膜條一端向另一端緩慢滲移，其間待測(cè)物與金標(biāo)試劑發(fā)生一系列特異性結(jié)合反應(yīng)而被截留，聚集于檢測(cè)帶上并顯現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，通過(guò)觀察可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性或半定量分析。陳宗倫［62］基于GICT開(kāi)發(fā)了一款用于檢測(cè)谷物中AFB1的檢測(cè)卡。檢測(cè)卡對(duì)谷物中AFB1的肉眼判斷靈敏度為0.2 ng·mL?1，儀器判斷靈敏度為0.05 ng·mL?1，檢測(cè)可在15 min內(nèi)完成，且檢測(cè)卡在25℃常溫條件下可保存1～2年。曹德康等［63］應(yīng)用GICT制得一種可同時(shí)對(duì)谷物類食品中AFB1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素進(jìn)行檢測(cè)的三聯(lián)檢測(cè)卡。檢測(cè)卡對(duì)3種毒素的LOD分別為5～10、60、1 000 ng·g?1，且該檢測(cè)卡特異性良好，與待檢物的結(jié)構(gòu)類似物、其他真菌毒素均無(wú)交叉反應(yīng)，15 min內(nèi)可完成測(cè)試，于常溫下可保存12個(gè)月。

GICT以其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到檢測(cè)人員的青睞，它具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于在田間地頭、倉(cāng)庫(kù)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、商場(chǎng)等場(chǎng)所對(duì)原料或成品進(jìn)行大批量篩查檢測(cè)。但GICT在制備抗體時(shí)成本較高，樣品提取時(shí)效率較低，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，這些不足制約了GICT的推廣應(yīng)用，需進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 其他檢測(cè)方法

2.3.1 表面增強(qiáng)拉曼光譜法 拉曼光譜是基于印度科學(xué)家拉曼在1928年所發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應(yīng)發(fā)展起來(lái)的光譜分析技術(shù)，在分析樣品時(shí)具有對(duì)試樣非接觸性、不破壞試樣的特點(diǎn)［64］，同時(shí)也擁有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，可在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)試樣的分析，但傳統(tǒng)拉曼光譜的強(qiáng)度和靈敏度較低。表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）克服了傳統(tǒng)拉曼光譜的低靈敏度缺點(diǎn)，它利用納米結(jié)構(gòu)表面現(xiàn)象來(lái)增強(qiáng)吸附在銀、金和銅等金屬顆粒上的弱非彈性散射拉曼效應(yīng)，且保持了常規(guī)拉曼光譜實(shí)時(shí)與快速的特性，已廣泛應(yīng)用于食品安全［65］、生物醫(yī)藥［66］、環(huán)境監(jiān)測(cè)［67］等諸多領(lǐng)域。He等［68］基于SRES開(kāi)發(fā)了一種可用于檢測(cè)花生制品中AFB1的免疫傳感器。傳感器以SH-cDNA（short hairpin-cDNA）修飾的Fe3O4@Au粒子作為捕獲探針，以SH-Apt（short hairpin-適配體）修飾的Au@Ag粒子和Cy3-Apt（Cy3熒光標(biāo)記的適配體）為報(bào)告探針，在AFB1存在的條件下，Apt與AFB1的特異性結(jié)合可以使報(bào)告探針從捕獲探針中釋放出來(lái)，導(dǎo)致SERS強(qiáng)度隨AFB1濃度的增加而線性下降，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的痕量檢測(cè)（圖4）。該方法對(duì)AFB1的LOD為0.40 pg·mL?1，回收率為96.6%～115.0%。在納米溶膠由濕態(tài)向干態(tài)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)SERS采集的技術(shù)稱為動(dòng)態(tài)SERS（dynamic SERS，DSERS），與常規(guī)SERS信號(hào)相比增加了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)?；诖?，任菲等［69］采用D-SERS對(duì)薏苡仁中的AFG1進(jìn)行檢測(cè)。該方法采用擦拭法提取樣品表面的AFG1，以AuNP作為SERS的增強(qiáng)基底進(jìn)行D-SERS分析，對(duì)AFG1的LOD為5.5 μg·kg?1，具有低成本、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，適用于大批量樣品的快速篩檢。

圖4 基于SERS免疫傳感器檢測(cè)原理［68］Fig.4 Detection principle based on SERS immunosensor［68］

近年來(lái)，SERS技術(shù)憑借其熒光背景低、圖譜信息量豐富、簡(jiǎn)便靈敏、快速無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。但目前SERS多作為一種輔助性檢測(cè)手段使用，仍有一些問(wèn)題亟待解決：①儀器成本較高，難以商業(yè)化推廣；②制備重現(xiàn)性好、靈敏度高的基底較為困難，且性能可觀的基底材料多為貴金屬，如Au（金）、Ag（銀）等與其他材料的復(fù)合物，進(jìn)一步增加了檢測(cè)成本；③自然界中真菌毒素的種類繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前還尚未建立起針對(duì)各種真菌毒素的SERS拉曼譜圖庫(kù)導(dǎo)致許多毒素?zé)o法檢測(cè)。

2.3.2 電化學(xué)傳感器法 電化學(xué)傳感器是一種利用電化學(xué)分析對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)的裝置。其工作原理為：對(duì)目標(biāo)物具有特異性識(shí)別的原件被修飾于電極上，通過(guò)與目標(biāo)物相互作用對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行識(shí)別而引起信號(hào)的改變，信號(hào)轉(zhuǎn)換器再將這種信號(hào)變化轉(zhuǎn)換成電化學(xué)信號(hào)。在一定范圍內(nèi)，目標(biāo)物的濃度與電化學(xué)信號(hào)之間存在一定的比例關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量分析。Yuan等［70］研制了一種靈敏度高、可選擇性地對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)的電化學(xué)傳感器。其首先將AFB1適配體（aptamer，Apt）的巰基化cDNA通過(guò)硫?金鍵固定在AuNPs修飾的玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面，再通過(guò)特定的堿基配對(duì)方式讓Apt與cDNA互補(bǔ)配對(duì)而附著于GCE表面；在AFB1存在的情況下，通過(guò)AFB1和Apt之間的特異性識(shí)別，Apt從電極表面分離，在溶液中形成Apt-AFB1偶聯(lián)物；偶聯(lián)物在外切酶Ⅰ（ExoⅠ）的作用下以觸發(fā)AFB1循環(huán)；最后，DNA-AuNPs-HRP納米探針通過(guò)特異性堿基配對(duì)與電極表面的cDNA結(jié)合，HRP可以催化H2O2將對(duì)苯二酚（hydroquinone，HQ）氧化為苯醌（benzoquinone，BQ），產(chǎn)生強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào)（圖5），信號(hào)隨AFB1濃度的增加而增大，最低LOD為3.3×10?4ng·mL?1，回收率為88.5%～110.2%，已成功應(yīng)用于花生和玉米樣品中 AFB1的測(cè)定。Wang等［71］制備了一種無(wú)試劑適配體電化學(xué)傳感器，可用于快速、靈敏檢測(cè)多種食品中的AFB1。在對(duì)AFB1具有較高親和力的短鏈26-mer DNA適配體5’端引入一個(gè)硫醇基團(tuán)，并在其T18位點(diǎn)偶聯(lián)一個(gè)亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）標(biāo)記，通過(guò)硫?金鍵合將適配體固定在金電極上。對(duì)于T18位點(diǎn)有MB標(biāo)記的適配體，AFB1的結(jié)合引起MB電流信號(hào)顯著增加，從而可以根據(jù)電信號(hào)的變化檢測(cè)AFB1。傳感器的檢測(cè)極限為 6 pmol·L?1，且具有較好的穩(wěn)定性，經(jīng)去離子水漂洗再生后可重復(fù)使用。

圖5 基于DNA-AuNPs-HRP納米探針和ExoⅠ輔助信號(hào)放大的電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè)原理［70］Fig.5 Detection principle of electrochemical aptamer sensor based on DNA-AuNPs-HRP nanoprobe and ExoⅠ auxiliary signal amplification［70］

近年來(lái)，電化學(xué)傳感器因其具有較高的檢測(cè)靈敏度、操作簡(jiǎn)便、便于攜帶且較為經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)而被廣泛用于食品中污染物的檢測(cè)。其中核酸適配體和電極修飾材料的開(kāi)發(fā)是電化學(xué)傳感器制備的關(guān)鍵，直接影響著傳感器的檢測(cè)性能和使用壽命。因此，探索性能優(yōu)越的新型電極修飾材料，篩選、修飾親和力更強(qiáng)、成本更低的核酸適配體將成為未來(lái)構(gòu)建性能穩(wěn)定的電化學(xué)傳感器的研究重點(diǎn)［72］。

3 結(jié)語(yǔ)

AFT對(duì)食品的污染嚴(yán)重危害著消費(fèi)者的身體健康，食品中AFT檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展日益受到人們的關(guān)注，高效檢測(cè)各類食品中AFT的殘留對(duì)我國(guó)食品行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和更好踐行“健康中國(guó)”戰(zhàn)略、保障我國(guó)食品安全事業(yè)行穩(wěn)致遠(yuǎn)至關(guān)重要。

就目前來(lái)看，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，各種檢測(cè)技術(shù)在靈敏度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等方面都取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步，但對(duì)于大批量樣品的快速檢測(cè)仍然沒(méi)有方法可以同時(shí)滿足靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)便、低成本的要求，已然成為本領(lǐng)域所面臨的一項(xiàng)難題。儀器分析技術(shù)雖然在檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性上有著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，但由于其本身的局限性，分析測(cè)試只能在實(shí)驗(yàn)室中由專業(yè)人員執(zhí)行，樣品在測(cè)試前需要經(jīng)歷較為繁瑣的前處理過(guò)程，測(cè)試后也不能立即獲取檢測(cè)結(jié)果，且有著較高的測(cè)試成本，不適合大批量樣品的快速篩查。免疫技術(shù)的興起在一定程度上彌補(bǔ)了儀器分析技術(shù)的不足，它具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)，各種免疫試劑盒、試紙條的出現(xiàn)使得大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查成為可能。更重要的是，它對(duì)操作人員的知識(shí)儲(chǔ)備要求不高，經(jīng)過(guò)一定的培訓(xùn)即可快速上手。但目前免疫技術(shù)在測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性上與儀器分析技術(shù)仍有差距，假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果不能完全避免，且抗原抗體不易制備，還有待繼續(xù)探索并不斷完善。SERS、電化學(xué)傳感器技術(shù)是當(dāng)前真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。SERS具有定量精確、快速無(wú)損的特點(diǎn)，電化學(xué)傳感器則以其低成本和便攜性備受青睞，但作為新興檢測(cè)技術(shù)還尚未發(fā)展成熟。未來(lái)，AFT的檢測(cè)將更傾向于從實(shí)驗(yàn)室走向現(xiàn)場(chǎng)，從儀器分析走向快速分析，研發(fā)集提取、分離、富集、檢測(cè)于一體的檢測(cè)設(shè)備用于AFT的現(xiàn)場(chǎng)大批量、快速、精準(zhǔn)定量將成為AFT檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。