水楊酸對干旱脅迫下桔梗幼苗生理生化指標及相關基因表達的影響

孫曉春， 黃文靜， 李鉑

（陜西中醫(yī)藥大學陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083）

桔梗（Platycodon grandiflorus（Jacq.）A.DC）為桔?？贫嗄晟荼局参?，具有祛痰止咳、抗腫瘤、降血糖等多種藥理功效［1-2］。目前，隨著桔梗越來越多的藥用價值與經(jīng)濟價值被發(fā)現(xiàn)，人們對桔梗的需求量逐年增大。干旱已成為影響植物生長的普遍存在的問題。植物通過形態(tài)變化、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累、抗氧化酶活性提高等應答機制來抵御干旱脅迫［3］。葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的物質(zhì)基礎，葉綠素的生物合成由多基因調(diào)控。葉綠素酸酯a氧化酶（chlorophyllide a oxygenase，CAO）催化葉綠素酸酯b的形成，葉綠素合酶（chlorophyll synthase，CHLG）催化葉綠素酸酯a、b合成葉綠素 a、b［4］。干旱脅迫下，植物體內(nèi)的脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)被積累，其含量的升高有利于提高植物對干旱脅迫的抗性。吡咯啉-5-羧酸還原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR）是廣泛存在于原核和真核生物中的重要看家蛋白，其主要功能是在NAD（P）H的作用下，將吡咯啉-5-羧酸（P5C）轉化為脯氨酸［5］。過氧化物酶（peroxidase，POD）催化過氧化氫參與各種還原劑的氧化反應［6］。研究表明，添加外源物質(zhì)可提高植物的抗逆能力［7-8］。水楊酸（salicylic acid，SA）是植物體內(nèi)的一種小分子酚類物質(zhì)，能調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，包括種子萌發(fā)、果實成熟、開花、衰老以及對生物和非生物脅迫的防御反應［9］。SA能有效增強紫御谷對干旱、高溫的抵抗能力［10］。馬樂元等［11］研究表明，外源添加水楊酸能夠降低干旱脅迫下小冠花葉片的活性氧水平，提高小冠花葉片抗氧化能力。蔣明敏等［12］研究表明，較低濃度水楊酸可顯著提高石蒜的抗旱性，而高濃度則發(fā)生毒害作用。

本研究室前期研究表明，20%PEG脅迫下，外源添加水楊酸可提高桔梗葉片中超氧化物歧化酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性及可溶性糖和脯氨酸含量［13］。而不同程度干旱脅迫下，水楊酸對桔梗生理生化指標的影響以及分子機制尚未見報道。因此，本研究以不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫，同時外源添加不同濃度水楊酸處理，對不同處理下桔梗葉片和根中葉綠素、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和保護酶活性進行比較；同時檢測葉綠素合成相關基因CAO、CHLG、POD和脯氨酸代謝相關基因P5CR表達量的變化，為解析外源SA提高桔?？垢珊的芰Φ姆肿訖C制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桔梗種子購自河北省保定市安國中藥材推廣站。選取顆粒飽滿、大小均一的桔梗種子播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，在14 h光照/10 h黑暗、25℃恒溫培養(yǎng)，光照強度4 000 lx；培養(yǎng)60 d后，將長勢基本一致的桔梗幼苗移栽于裝有石英砂的塑料花盆中（口徑7 cm，高8 cm），每盆移栽幼苗3棵。

1.2 試驗設計

移栽后，每天向盆中一次性澆灌10 mL Hoagland營養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d后進行PEG干旱和SA處理。PEG質(zhì)量濃度設置為0（P0）、5%（P5）、10%（P10）、15%（P15）和20%（P20），每日向盆中一次性澆灌10 mL PEG溶液。同一PEG處理下，每天上午10：00分別用噴壺向桔梗葉片噴灑0（S0）、10（S10）、20（S20）和30（S30）mg·L?1SA 溶液。每個處理3盆植株，重復3次。處理5 d后分別收取桔梗全部葉片和根，液氮冷凍后置于?80℃冰箱。葉片用于生理指標的測定和RNA的提取；根用于生理指標的測定。

1.3 指標測定

1.3.1 生理指標檢測 丙二醛（malondial-dehyde，MDA）、可溶性糖（soluble sugar，SS）、脯 氨 酸（proline，Pro）、超 氧 化 物 歧 化 酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的檢測均按照試劑盒說明書進行（蘇州科銘生物技術有限公司）。葉綠素（chlorophyll，Chl）和可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量檢測參照張以順等［14］的方法進行。

1.3.2 RNA提取和實時熒光定量PCR 將采集的桔梗葉片在液氮中研磨，按照試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）提取桔?？俁NA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，核酸濃度檢測儀測定RNA的純度及濃度，依據(jù)試劑盒說明書（日本TaKaRa有限公司）進行RNA反轉錄。然后，以各處理cDNA為模板，actin基因作為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR法檢測POD、P5CR、CAO和CHLG基因的表達量?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用 2?△△Ct法［15-16］?；蛐蛄杏杀菊n題組前期桔梗轉錄組測序結果獲得，引物采用Primer Premier 5.0設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列詳見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan法進行差異顯著性分析，采用Excel 2013軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 水楊酸對干旱脅迫下桔梗葉片葉綠素含量的影響

如圖1所示，隨干旱脅迫程度的加劇，葉綠素含量逐漸降低。未添加SA時，P20處理的葉綠素含量為對照（P0處理）的39.87%。在10%和15%PEG處理下，S10和S20處理的葉綠素含量均顯著高于S0處理，其中S20處理的葉綠素含量最高。在10%和15%PEG處理下，S20處理的葉綠素含量分別是S0處理的1.22和1.32倍；當SA達到30 mg·L?1時，葉綠素含量反而有所降低。由此表明，干旱脅迫下，外源施加20 mg·L?1SA時可有效抑制葉綠素的降解。

圖1 不同處理下桔梗葉片的葉綠素含量Fig.1 Chlorophyll contents in Platycodon grandiflorus leaves of different treatments

2.2 水楊酸對干旱脅迫下桔梗葉片和根中MDA含量的影響

對不同處理葉片中MDA含量進行分析，結果（圖2）表明，未添加SA時，葉片中MDA含量隨干旱脅迫程度的加劇逐漸增加，P5、P10、P15和P20處理的MDA含量分別為對照（P0處理）的1.45、1.76、1.87和1.99倍，表明干旱脅迫下葉片中膜脂過氧化物不斷積累，細胞氧化損傷增加。在5%、10%和15%PEG濃度下，S20處理的MDA含量較S0處理分別顯著降低了18.73%、25.76%和16.70%，表明外源添加水楊酸有效緩解了干旱脅迫下桔梗葉片的膜脂過氧化程度。在20%PEG濃度下，添加SA處理與S0處理間MDA含量無顯著差異。

圖2 不同處理下桔梗葉片和根中MDA含量Fig.2 MDA contents in Platycodon grandiflorus leaves and roots of different treatments

對不同處理下根中MDA含量進行分析，結果（圖2）表明，未添加SA時，P20處理根中MDA含量為P0處理的1.24倍；添加SA后，S20處理的MDA含量在不同質(zhì)量濃度PEG（0、5%、10%、15%和20%）脅迫下均顯著低于S0處理，分別降低了12.88%（P0）、14.78%（P5）、20.17%（P10）、34.57%（P15）和23.95%（P20）。表明水楊酸質(zhì)量濃度為20 mg·L?1時，可有效緩解干旱脅迫下桔梗根細胞的膜脂過氧化程度。

2.3 水楊酸對干旱脅迫下桔梗葉片和根中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

如圖3所示，葉片可溶性糖含量隨干旱脅迫程度增加呈上升趨勢。在10%和15%PEG脅迫下，S10和S20處理均能顯著提高葉片中可溶性糖含量，表明外源添加水楊酸可通過提高葉片可溶性糖的含量從而緩解干旱脅迫對植株造成的損傷；而添加SA對不同干旱脅迫下根中可溶性糖含量均無顯著影響。在10%和15%PEG脅迫下，S10和S20處理均能顯著提高葉片和根中可溶性蛋白含量；在15%PEG處理下，S30處理顯著提高了葉片可溶性蛋白含量，而根中可溶性蛋白含量顯著降低。在10%和15%PEG脅迫下，S20處理能顯著提高葉片和根中脯氨酸含量；在15%和20%PEG脅迫下，S30處理葉片和根中脯氨酸含量顯著降低。上述結果表明，在干旱脅迫下高質(zhì)量濃度SA會抑制脯氨酸的累積。

圖3 不同處理下桔梗葉片和根的可溶性糖和蛋白及脯氨酸含量Fig.3 Contents of SS，SP and Pro in Platycodon grandiflorus leaves and roots of different treatments

2.4 水楊酸對干旱脅迫下桔梗葉片和根中抗氧化酶活性的影響

如圖4所示，SOD活性隨PEG質(zhì)量濃度的增加逐漸升高，POD和CAT活性隨PEG質(zhì)量濃度增加呈先升高后降低趨勢。不同PEG脅迫（5%、10%、15%和20%）下，S20處理葉片和根中SOD活性顯著提高，S10和S20處理均能顯著提高葉片和根中POD和CAT活性，而S30處理的POD和CAT活性顯著降低。綜上所述，適量施用SA能提高桔梗葉片和根中抗氧化酶活性，緩解干旱脅迫造成的損傷，而高質(zhì)量濃度SA可能引起POD活性降低，以SA 質(zhì)量濃度為20 mg·L?1時效果最佳。

圖4 不同處理下桔梗葉片和根中抗氧化酶活性的影響Fig.4 Activities of antioxidant enzymes in Platycodon grandiflorus leaves and roots of different treatments

2.5 水楊酸對干旱脅迫下桔梗葉片相關基因表達的影響

如圖5所示，S0處理葉片中CAO和CHLG基因的表達量隨干旱程度的加劇呈下降趨勢，與葉綠素含量變化規(guī)律一致。在10%、15%和20%PEG脅迫下，外源添加SA處理葉片中CAO和CHLG基因的表達量均顯著提高；PEG質(zhì)量濃度為0和5%時，S20和S30處理葉片中CHLG基因表達量顯著提高，而CAO基因表達量無顯著變化。由此表明，不同干旱脅迫程度下，SA能誘導不同葉綠素合成相關基因的表達，從而抑制葉綠素的降解。

圖5 不同處理下COA、CHLG、POD和P5CR基因在葉片中的相對表達量Fig.5 Related expression of COA，CHLG，POD and P5CR genes in Platycodon grandiflorus leaves

S0處理葉片中POD基因的表達量隨干旱脅迫程度的加劇呈先增加后降低的趨勢，與POD活性變化規(guī)律一致；而P5CR基因的表達量隨干旱脅迫程度的加劇呈上升趨勢（圖5）。在不同質(zhì)量濃度PEG脅迫下，S10和S20處理葉片中POD基因的表達量均顯著提高；在10%和15%PEG脅迫下，S30處理抑制了POD基因的表達，與POD活性測定結果一致。在10%和15%PEG脅迫下，S10和S20處理葉片中P5CR基因的表達量均顯著提高，與脯氨酸含量測定結果一致。

3 討論

干旱是自然界常見的逆境脅迫因素，對植物生長具有嚴重影響。水楊酸是植物莽草酸代謝途徑中的一種酚類衍生物，對植物的種子萌發(fā)、生長、開花等一系列生理生化過程［11］有影響。在非生物脅迫下，水楊酸能夠減輕植物光合色素含量的下降程度，從而使葉片保持較高的光合速率來保證植物正常生長［17］。本研究結果表明，隨干旱脅迫程度的加劇葉綠素含量逐漸降低，在10%和15%PEG脅迫下，外源添加10和 20 mg·L?1SA可顯著提高葉片葉綠素含量，由此表明，適宜質(zhì)量濃度的水楊酸處理有利于植物保持較高的葉綠素含量。對葉綠素合成途徑中兩個關鍵酶基因CAO和CHLG的表達量進行分析表明，外源添加SA顯著提高了葉片中CAO和CHLG基因的表達量，從分子水平驗證了干旱脅迫下外源添加SA可減輕葉綠素含量的下降程度。葉綠素的生物合成是多種酶參與的過程，本文僅對其中兩種酶基因的表達量進行了檢測，對于在干旱脅迫下，添加外源水楊酸對其他葉綠素合成途徑中酶基因表達量的影響仍有待于進一步研究。

抗氧化酶類可有效清除自由基，保護膜系統(tǒng)，緩解植物受到的脅迫傷害。SA作為信號分子，可以激活多種與脅迫應答有關的基因表達，并通過調(diào)節(jié)活性氧、抗氧化酶及非酶促抗氧化體系而提高植物的抗逆性［11］，本研究表明，在干旱脅迫下對桔梗進行一定質(zhì)量濃度的水楊酸處理，可以提高桔梗幼苗葉片和根中抗氧化酶活性，減輕干旱脅迫對桔梗幼苗的危害。可溶性糖和蛋白及脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積對植物抵抗干旱脅迫具有重要意義，本研究表明，在干旱脅迫下，外源添加適宜質(zhì)量濃度的SA能夠增加桔梗葉片和根中可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸含量。由此表明，適宜質(zhì)量濃度的SA可以有效促進桔梗葉片和根中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積，從而提高植物的抗逆性，緩解逆境對植物造成的損傷。研究表明，脯氨酸不僅具有滲透調(diào)節(jié)作用，還對滲透保護動能具有重要意義，其代謝和積累有利于維持干旱脅迫下細胞內(nèi)結構和膜的穩(wěn)定性，同時具有清除超氧陰離子等自由基的作用［18-19］。OAT和P5CS分別是合成脯氨酸鳥氨酸途徑和谷氨酸途徑中的限速和調(diào)節(jié)酶［20］，而P5CR催化脯氨酸生物合成的最終反應。本研究對PEG脅迫下桔梗幼苗葉片中P5CR基因的表達量進行分析表明，在10%和15%PEG脅迫下，外源添加10或20 mg·L?1SA均能顯著提高葉片中P5CR基因的表達量，與脯氨酸含量測定結果相一致。綜上所述，外源添加適量SA可提高抗氧化酶活性，促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積，從而提高桔梗幼苗的抗干旱能力。