CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽育種方面的應(yīng)用

莊重， 趙龍， 白皓， 畢瑜林， 黃應(yīng)權(quán)， 陳國宏， 常國斌*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇綠佳生態(tài)科技有限公司，江蘇 泰州 221000）

基因編輯，又稱基因組編輯或基因工程，能夠精確地對基因組中特定的目標(biāo)基因進(jìn)行修飾。近年來，隨著編輯潛能強(qiáng)大的新型基因編輯技術(shù)——規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（clustered regulatory interspersed short palindromic repeat，CRISPR）被發(fā)現(xiàn)，基因編輯效率在本質(zhì)上有了極大的提升。CRISPR技術(shù)2013、2015年連續(xù)兩次被Science評為年度十大科學(xué)突破［1-2］；Nature也于2019年將其列為10年內(nèi)最具影響力的5個(gè)重大科學(xué)事件之一［3］；2020年，埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle CHARPENTIER）和詹妮弗·杜德納（Jennifer DOUDNA）因?qū)RISPR基因編輯技術(shù)的杰出貢獻(xiàn)被授予諾貝爾化學(xué)獎。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)極大地開拓了人們對生物體研究的領(lǐng)域，為生命本質(zhì)的研究提供了更多的可能。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)簡單、成本低廉、操作方便、效率可觀，已成為目前常用的基因編輯技術(shù)。本文綜述了基因編輯的發(fā)展歷程，并剖析了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與類型以及其在家禽遺傳育種中的應(yīng)用，總結(jié)了CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽研究中存在的一些問題，并提出意見和建議，為CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽育種中的深入研究提供參考和借鑒。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

目前運(yùn)用較多的三種基因編輯技術(shù)為鋅指核酸酶（zinc finger endonuclease，ZFN）［4］、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activitor-like effector nuclease，TALEN）［5］以及CRISPR［6］，這些基因編輯技術(shù)為基因功能、基因改良以及基因治療的研究拓寬了道路。由于ZFN技術(shù)設(shè)計(jì)復(fù)雜、成本高昂，TALEN載體較大、具有高度的重復(fù)序列，難以實(shí)現(xiàn)多基因敲除，限制了它們的應(yīng)用和發(fā)展，CRISPR逐漸受到人們重視。CRISPR是一種有規(guī)律的間隔短回文重復(fù)序列，于1987年［7］被發(fā)現(xiàn)，隨后科學(xué)家們對這種重復(fù)序列進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和古細(xì)菌中普遍存在這種序列，在2002年正式將它命名為“clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）”［8］。然而，最初人們并不知道這種序列的具體作用，2005年，Bolotin 等［9］、Mojica等［10］、Pourcel等［11］在研究中發(fā)現(xiàn)，CRISPR的間隔序列與外來遺傳物質(zhì)具有非常高的相似性，他們推測CRISPR在細(xì)菌抵抗外來遺傳物質(zhì)入侵的過程中起著一定的作用。2006年，Makarova等［12］使用生物信息學(xué)手段對CRISPR進(jìn)行分析，推測其在細(xì)菌與古細(xì)菌中作為一種獲得性免疫系統(tǒng)而存在。此后，Barrangou 等［13］與Marraffini等［14］分別驗(yàn)證了CRISPR能夠在細(xì)菌中抵御噬菌體的入侵。

近年來，CRISPR/Cas技術(shù)在基因編輯中的應(yīng)用取得了長足發(fā)展，2010年，Garneau等［15］利用間隔序列引導(dǎo)Cas9蛋白對目的基因進(jìn)行切割，發(fā)生了雙鏈斷裂，首次證實(shí)CRISPR/Cas9具有基因編輯的潛力。此后不久，對哺乳動物基因的成功編輯［16］更是打開了利用CRISPR/Cas9機(jī)制進(jìn)行基因編輯的大門。2014年，Hai等［17］通過將靶向vWF（血管血友病因子）基因的sgRNA顯微注射入豬受精卵中，成功制備了首例vWF基因敲除豬，并建立起血管性血友病基因豬模型，該模型的建立對提高豬屠宰和采血的出血效率都具有較大幫助。同年，Han等［18］利用相同方法，成功獲得了兩只肌肉生長素（MSTN）基因編輯羔羊，由此證明將Cas9：sgRNA直接注射到受精卵中可以廣泛應(yīng)用于構(gòu)建大型家畜基因敲除模型。在此基礎(chǔ)上，Wang等［19］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功制備了MSTN和FGF5基因編輯山羊，并證明基因編輯后的山羊次級毛囊數(shù)量以及羊絨長度顯著增加，這為改良山羊肉品質(zhì)以及羊毛纖維品質(zhì)提供了新的思路。2015年，Heo等［20］首次將CRISPR/Cas9技術(shù)使用在牛的基因編輯中，成功獲得了經(jīng)過基因編輯的牛多能干細(xì)胞（ips）和胚胎，為之后基因編輯牛打下基礎(chǔ)。除此之外，Niu等［21］證實(shí)，在食蟹猴的單細(xì)胞胚胎中同時(shí)注射Cas9mRNA和sgRNA，可以使PPAR-γ基因與Rag1基因產(chǎn)生突變，更是讓這項(xiàng)技術(shù)在人類疾病基因治療上應(yīng)用成為了可能。截至目前，CRISPR技術(shù)已廣泛應(yīng)用在模式生物，如斑馬魚［22］、小鼠［23］、細(xì)菌［24］和農(nóng)作物玉米［25］，以及山羊［26］、牛［27］、豬［28］等家畜的基因編輯中。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的逐漸成熟，這項(xiàng)技術(shù)將對基因修飾、疾病治療以及動植物品種改良等研究有劃時(shí)代的意義。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成和作用機(jī)制

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種自適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，在許多細(xì)菌與古細(xì)菌中基本分為3個(gè)步驟發(fā)揮作用（圖1）［16，29］：第1步為適應(yīng)，從外源核酸獲得新的間隔區(qū)，插入CRISPR 5’端的兩重復(fù)序列之間；第2步是CRISPRRNA（crRNA）的生物發(fā)生，CRISPR基因座被轉(zhuǎn)錄成小的干擾型crRNA；第3步是靶向識別，crRNA引導(dǎo)Cas核酸酶進(jìn)行同源序列的特異性切割［16］。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中蛋白的種類不同以及識別機(jī)制的差異大致可以分為3類［29］，其中Ⅰ型與Ⅲ型系統(tǒng)都需要多種Cas蛋白復(fù)合體才能發(fā)揮作用，比較復(fù)雜，而Ⅱ型系統(tǒng)非常簡便，其主要由Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA組成，自身的下游沒有PAM（protospacer adjacent motifs）序列，外源DNA的間隔序列的3’端存在1個(gè)PAM序列，Cas9蛋白借此對外源DNA進(jìn)行識別，從而避免自我免疫［30］。目前，CRISPR/Cas9已成為應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能機(jī)制（根據(jù)參考文獻(xiàn)［29］修改）Fig.1 Functional characteristics of CRISPR/Cas9 system（modified on reference［29］）

CRISPR/Cas9的基因座5’端為能夠與crRNA形成crRNA-tracrRNA復(fù)合體的tracrRNA基因，其可以指導(dǎo)Cas9與crRNA-tracrRNA進(jìn)行結(jié)合；Cas蛋白編碼基因3’端為CRISPR基因座，由啟動子、spacers和重復(fù)序列組成，其中，spacers主要負(fù)責(zé)引導(dǎo)Cas9蛋白精確識別非自身DNA與自身DNA，從而實(shí)行定點(diǎn)切割并避免自我免疫。Cas9蛋白對于靶DNA的識別不僅需要crRNA-tracrRNA復(fù)合物的引導(dǎo)，靶位點(diǎn)上的PAM序列也是其區(qū)分外源和內(nèi)源DNA的重要標(biāo)識。首先，crRNA-tracrRNA復(fù)合物對外源DNA進(jìn)行掃描，只有當(dāng)crRNA與外源DNA互補(bǔ)配對且3’端具有PAM序列時(shí)，Cas9蛋白才會對外源DNA進(jìn)行切割，Cas9蛋白中包含有RuvC結(jié)構(gòu)域、HNH結(jié)構(gòu)域、識別區(qū)REC以及位于C端的PAM區(qū)，RuvC與HNH分別切割目的外源基因DNA的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈，使DNA的雙鍵斷裂。當(dāng)RuvC中的D10A失活或突變時(shí)會導(dǎo)致RuvC失活，HNH中的H840A突變同樣可使HNH失活。D10A與H840A都突變會形成dCas9（dead Cas9），而單點(diǎn)突變可使Cas9成為切口酶，切割外源DNA后會造成DNA單鏈斷裂［31-32］。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽育種中的應(yīng)用

家禽作為一種農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物，具有生長周期短、飼料報(bào)酬率高、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)，是生物學(xué)領(lǐng)域重要的蛋白質(zhì)來源［33］，也是脊椎動物發(fā)育生物學(xué)非常有價(jià)值的模型［34］。與傳統(tǒng)育種相比，CRISPR/Cas9技術(shù)可以給育種者提供更多的遺傳選擇，并通過基因組編輯快速提高后代的生產(chǎn)性能、繁殖性能和抗病性能，以滿足消費(fèi)者對家禽日益增長的需求。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽上還可以進(jìn)行性別決定，不僅降低生產(chǎn)成本，而且可以改善動物福利。因此，通過CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造，進(jìn)而推動家禽業(yè)發(fā)展具有廣闊發(fā)展前景。以下將對近些年CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽功能基因研究中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，并重點(diǎn)介紹一些具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因編輯模型。

3.1 在家禽功能基因研究中的應(yīng)用

3.1.1 在細(xì)胞中的應(yīng)用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于家禽細(xì)胞基因編輯中（表1），其中在雞成纖維細(xì)胞（DF-1）、雞胚胎干細(xì)胞（ESCs）、雞原始生殖細(xì)胞（PGCs）上應(yīng)用較多。隨著CRISPR/Cas9的快速發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠更容易地靶向不同基因，研究者在探究不同功能基因效應(yīng)的同時(shí)，也不斷證明利用CRISPR/Cas9對家禽進(jìn)行基因編輯從而進(jìn)行性狀改良與育種研究具有可行性。

表1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家禽細(xì)胞系模型上的應(yīng)用Table 1 Application of CRISPR/Cas9 system in poultry basal cell model

3.1.2 在胚胎發(fā)育模型中的應(yīng)用 與其他動物胚胎相比，雞胚發(fā)育過程清晰、來源方便、易于操作、利于大量實(shí)驗(yàn)樣本同時(shí)觀測［50］，是經(jīng)典的胚胎發(fā)育模型，其對于研究脊椎動物胚胎學(xué)的生理、病理以及毒理學(xué)等也具有重要的指導(dǎo)意義［51-52］。近年來，使用CRISPR/Cas9技術(shù)在探究胚胎相關(guān)功能基因功能方面取得了豐碩的成果。

2015 年，Véron 等［53］通過電穿孔胚胎以及CRISPR/Cas9技術(shù)得到了敲除PAX7基因的雞胚，首次證明了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對雞胚體細(xì)胞進(jìn)行基因編輯具有可行性。隨后，Abu-Bonsrah等［35］在Véron等［53］的基礎(chǔ)上再次結(jié)合兩種技術(shù)，敲除了兩個(gè)細(xì)胞系中DROSHA、DICER、MBD3、KIAA1279、CDKN1B、EZH2、HIRA、TYRP1、STMN2、RET和DGCR共計(jì)11個(gè)與胚胎發(fā)育或胚胎患病相關(guān)的基因，并將其轉(zhuǎn)染入胚胎中，結(jié)果表明，CRISPR技術(shù)能對雞胚進(jìn)行有針對性地基因改造，且所有靶基因的切割效率均在20%～68%之間，為胚胎發(fā)育過程中的疾病模型研究提供思路。此外，Zuo等［36］還將含有被PEI包裹的gRNA-3載體注射到雞胚胎中，建立了敲低效率為15%的穩(wěn)定細(xì)胞、胚胎CRISPR/Cas9基因敲低系統(tǒng)，為利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞胚胎中進(jìn)行基因改造建立基礎(chǔ)。Williams等［54］構(gòu)建并優(yōu)化了雞U6啟動子體內(nèi)介導(dǎo)sgRNA表達(dá)的微型載體系統(tǒng)，創(chuàng)建了能夠?qū)?nèi)源性增強(qiáng)子和啟動子進(jìn)行表觀基因組操作并帶有Citrine報(bào)告基因的野生型Cas9表達(dá)載體。通過觀察發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9技術(shù)可以對內(nèi)源性增強(qiáng)子起到調(diào)節(jié)作用，為接下來探究雞胚中基因間的相互調(diào)控作用提供了參考。

3.2 在家禽基因編輯模型制備中的應(yīng)用

由于難以獲得和操縱合子，傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)難以應(yīng)用到家禽上，因此對家禽的基因改造遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他動物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)合基因編輯技術(shù)與PGC體外培育技術(shù)，極大地提高了制備家禽基因編輯模型的效率。2013年，Schusser等［55］首次從雞胚胎中獲得PGC細(xì)胞，將其體外培養(yǎng)后導(dǎo)入已編輯的基因，再把處理后的PGC細(xì)胞顯微注射入受體胚胎血管中，最終完成受體孵化，生產(chǎn)出了第1只敲除JH基因的無B細(xì)胞基因編輯雞。2016年，Oishi等［56］通過嘌呤霉素和博來霉素實(shí)現(xiàn)了對雞PGC中的卵清蛋白（ovum albumin，OVA）和卵類黏蛋白（ovomucoid，OVM）基因的敲除，并將成功敲除了OVA、OVM基因的PGC細(xì)胞注入雞胚血管中，得到3個(gè)可以產(chǎn)生突變精子轉(zhuǎn)基因嵌合體的公雞種系，突變效率高達(dá)90%。此后，不同基因編輯模型的研究進(jìn)程大大加快，為開發(fā)家禽優(yōu)質(zhì)育種資源提供了更多選擇。

3.2.1 在家禽疾病中的應(yīng)用 疾病對于家禽的生產(chǎn)有較大的限制，隨著CRISPR/Cas技術(shù)在基因編輯方面日漸成熟，使用該技術(shù)對家禽抗病性能進(jìn)行品種改良便成為熱點(diǎn)課題。

禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）是生產(chǎn)中對家禽危害較大的病原之一，給家禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2017年，Lee等［57］通過將CRISPR/Cas9載體與單鏈寡脫氧核苷酸（singlestranded oligonucleotide nucleotide，SSODN）組合的同源定向修復(fù)（homology directed repair，HDR）對NHE1進(jìn)行精確地基因組編輯，致使DF-1細(xì)胞對ALV-J感染產(chǎn)生抗性，為抗病雞品種培育奠定了基礎(chǔ)。之后不久，Lee等［58］又使用相同的方法對TVA基因外顯子2進(jìn)行敲除，得到了可以增強(qiáng)ALV-A的抗性的DF-1細(xì)胞。他們還準(zhǔn)備采用相同的方法對PGC以及ECS細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，以獲得新型的多抗病基因組編輯雞。2020年，Koslová等［59］使用CRISPR/Cas9完成了對NHE1基因的精確敲除，制備出的基因編輯模型對禽白血病病毒J亞群產(chǎn)生抗性。這些研究表明，使用CRISPR/Cas9對家禽基因組進(jìn)行編輯可以培育出高抗病性的基因編輯品系，為緩解疾病對家禽生產(chǎn)的影響提供了新的思路。

火雞皰疹病毒（herpesvirus of turkeys，HVT）是一種α皰疹病毒，因其與馬立克式病毒（Marek’s disease virus，MDV）抗原相關(guān)而被廣泛用作預(yù)防馬 立 克 病（MD）的 活 疫 苗 。 Tang等［60］使 用CRISPR/Cas9技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的重組和BAC重組技術(shù)，將IBDV的VP2插入HVT的基因座，快速高效地制備了表達(dá)VP2基因的重組HVT疫苗，證明通過在病毒的不同基因座位置插入其他病毒抗原基因來開發(fā)多價(jià)重組HVT載體疫苗是可行的，為使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)平臺開發(fā)新型多價(jià)載體疫苗奠定基礎(chǔ)。2020年，Tang等［61］又在此基礎(chǔ)上使用CRISPR/Cas9技術(shù)在HVT的基因座中插入IBDV的VP2基因、ILTV的gDgI基因和H9N2流感病毒的HA基因，構(gòu)建出HVT-VP2-gDgI-HA三重插入重組HVT疫苗，為生產(chǎn)可預(yù)防多種禽類疾病的疫苗提供參考。

在鴨疾病中主要是利用CRISPR/Cas技術(shù)進(jìn)行鴨乙肝病毒［62］、禽孢疹病毒疫苗［60］及禽類流感病毒的相關(guān)研究［56］。CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽病毒方面的應(yīng)用和貢獻(xiàn)也說明了這項(xiàng)技術(shù)在家禽的致病性基因的編輯和治療方面擁有廣泛的應(yīng)用前景。

3.2.2 在家禽生長發(fā)育和性別決定中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)也廣泛地用于研究家禽生長發(fā)育和性腺分化，Myostatin（肌肉生長抑制素）于1997年被發(fā)現(xiàn)，其參與肌肉生長發(fā)育及分化的各個(gè)階段，與肌肉質(zhì)量有較高的相關(guān)性［63］。2017年，Lee等［38］對肌生成過程中抑制肌肉細(xì)胞生長和分化的雞Myostatin進(jìn)行靶向缺失和突變，通過檢測發(fā)現(xiàn)突變效率為100%，這為進(jìn)一步探討Myostatin對雞肌肉質(zhì)量的影響奠定基礎(chǔ)。邱桂如等［64］利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除雞DF-1細(xì)胞中IHH基因，并證明了該基因與雞的匍匐性狀關(guān)系密切，為解決生產(chǎn)中雞的匍匐性狀問題提供了思路。載脂蛋白B（apolipoprotein B，Apob）主要在小腸和肝臟中合成，在甘油三脂的合成和分泌中發(fā)揮重要作用，對雞的生長和脂肪沉積有較大影響［65］，吉琳等［49］通過構(gòu)建Apob基因敲除載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，得到了成功敲除Apob基因的DF-1細(xì)胞，并證明亞克隆細(xì)胞的mRNA表達(dá)量顯著降低，這為繼續(xù)研究Apob基因?qū)﹄u脂肪沉積的影響建立了平臺。

2017年，Zhang等［41］設(shè)計(jì)了3個(gè)sgRNA來完成對雞DF-1、ESCs細(xì)胞中Stra8基因的敲除，發(fā)現(xiàn)ESCs向 SSCs（spermatogonia stem cells，精原干細(xì)胞）的分化受到抑制，由此證實(shí)Stra8基因?qū)刂艵SCs向SSCs分化起著決定性的作用，這為家禽性別控制提供可能。同年，Zuo等［66］通過RNA測序發(fā)現(xiàn)C1EIS基因在SSCs優(yōu)先表達(dá)，隨后構(gòu)建了C1EIS基因敲除載體以探究其在ESCs向SSCs分化過程中所起的作用。結(jié)果表明，經(jīng)T7EI酶切和TA克隆測序檢測敲除效率為40%，當(dāng)C1EIS缺乏時(shí)，ESCs向SSCs分化受到抑制，這證明了C1EIS基因在雞性腺發(fā)育過程中起著重要的作用，為家禽性腺發(fā)育與誘導(dǎo)發(fā)育的研究拓寬了思路和視野。作為雞性腺分化和生長發(fā)育的候選基因，DMRT1一直被廣泛關(guān)注，楊秀榮等［67］利用sgRNA平臺進(jìn)行DMRT1基因敲除，成功構(gòu)建了一個(gè)DMRT1基因敲除模型，為接下來進(jìn)一步研究DMRT1基因功能奠定基礎(chǔ)。研究表明，抗繆勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH）對卵泡選擇有重要影響，黃思嘉等［48］通過靶向構(gòu)建AMRH2敲除載體，成功敲除了DF-1細(xì)胞中的AMRH2基因，為繼續(xù)研究AMHR2基因在細(xì)胞中的作用構(gòu)建了敲除模型。

4 CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽應(yīng)用中存在的問題

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)簡單、便于操作、成本低廉，且能夠高效地對目的基因進(jìn)行編輯修飾，不斷地推動著人類對生命的探究，但其也逐漸暴露出一些關(guān)鍵問題。下面分析CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家禽應(yīng)用中存在的部分問題，并總結(jié)一些具有可行性的優(yōu)化方法，以期為問題的解決提供參考。

4.1 脫靶效應(yīng)

無論是傳統(tǒng)的還是新型的基因編輯技術(shù)都存在一定的脫靶問題，雖然CRISPR的脫靶率相較傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)有所降低，但是其脫靶效應(yīng)仍然給研究工作帶來了諸多的困擾。已經(jīng)有多項(xiàng)研究表明，在使用CRISPR/Cas9技術(shù)對目的基因進(jìn)行敲除的過程中存在著較為明顯的脫靶現(xiàn)象，但是目前還未能找到有效控制脫靶效應(yīng)的方法，這是限制CRISPR技術(shù)發(fā)展的主要因素，也是目前該技術(shù)的瓶頸。CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽方面應(yīng)用的脫靶效應(yīng)尤為明顯，編輯效率僅有26%［36］，遠(yuǎn)低于在哺乳動物以及植物中的基因編輯效率，并且脫靶效應(yīng)還會對家禽隨機(jī)位點(diǎn)產(chǎn)生不利突變，這會對生產(chǎn)中轉(zhuǎn)基因家禽的安全性和有效性產(chǎn)生重大影響，因此解決脫靶效應(yīng)是當(dāng)前亟待解決的問題。為了降低脫靶效應(yīng)，研究者們已經(jīng)從各個(gè)方面對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，下面將從Cas9核酸酶優(yōu)化、載體傳遞優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化等方面進(jìn)行總結(jié)，為此后家禽基因編輯研究中最大程度降低脫靶效應(yīng)提供思路和參考。

4.1.1 Cas9核酸酶優(yōu)化 對Cas9核酸酶變異體優(yōu)化來說，目前應(yīng)用在家禽中最為廣泛的Cas9核酸酶是來源于化膿性鏈球菌（SpCas9），但是其對于全基因組會產(chǎn)生非靶標(biāo)突變。近年來人們一直努力開發(fā)Cas9變異體以及其他同源基因來代替SpCas9，使系統(tǒng)表現(xiàn)出更小的突變性以及更高的特異性，從基礎(chǔ)上改善脫靶效應(yīng)。2018年，Kumar等［68］利用金黃色葡萄球菌Cas9核酸酶（SaCas9）開發(fā)出一種AAV（腺相關(guān)病毒）載體工具包，并將其對體外細(xì)胞基因編輯后發(fā)現(xiàn)，SaCas9可以識別較長的PAM序列，相對只能識別較短PAM序列的SpCas9來說，使用SaCas9基因編輯可能會產(chǎn)生非常小的非目標(biāo)突變。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)XCas9［69］、Cas9-NG［70］和 evoCas9［71］等 SpCas9 變異體都表現(xiàn)出比SpCas9更低的脫靶效應(yīng)，并且已經(jīng)逐漸將其應(yīng)用于目前的CRISPR/Cas9技術(shù)中。

4.1.2 載體傳遞優(yōu)化 改變病毒載體傳遞方法也是降低脫靶效應(yīng)的手段，由于現(xiàn)行的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)會一直存在于目的細(xì)胞中，很容易導(dǎo)致細(xì)胞基因組改變，從而影響目標(biāo)效應(yīng)。因此，腺病毒由于其難以整合到靶細(xì)胞基因組的特點(diǎn)［72］而被逐漸用于傳遞病毒載體構(gòu)建中，通過腺病毒傳遞病毒載體可以很大程度地避免目的效應(yīng)偏離，降低脫靶效應(yīng)。使用非病毒進(jìn)行載體遞送研究近年來也逐漸興起，研究者們通過直接向靶細(xì)胞遞送核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein，RNP）發(fā)現(xiàn)，RNP隨著時(shí)間延長逐漸降解［73］，這對于利用優(yōu)化載體傳遞方法最大限度地減少基因組改變，從而減少靶外突變、降低脫靶效應(yīng)具有重要意義。

4.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 除了以上優(yōu)化方法，未來研究還可以通過對靶點(diǎn)的慎重篩選、適當(dāng)縮小sgRNA長度以及設(shè)計(jì)成對sgRNA結(jié)合單切口酶或者dcas9-fokI融合酶等來降低CRISPR技術(shù)的脫靶效應(yīng)。盡量確保CRISPR/Cas9系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，并在提高CRISPR/Cas9技術(shù)精準(zhǔn)性的同時(shí)深入探索cas9基因的特異性，在破除技術(shù)壁壘的同時(shí)逐漸完善CRISPR/Cas9在家禽基因功能以及基因組的應(yīng)用。

4.2 其他問題

除了脫靶效應(yīng)，轉(zhuǎn)染效率［74］、生殖系傳遞效率較低［75］也是限制家禽CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展的重要因素。隨著PGC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因和基因組編輯的廣泛應(yīng)用，這方面問題已經(jīng)逐漸得到解決。通過先對PGC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再將體外培養(yǎng)的PGC細(xì)胞注射到宿主體內(nèi)的方法，可以大大提升細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率以及生殖系傳遞效率（高達(dá)90%）。伴隨該技術(shù)的逐漸優(yōu)化與成熟，轉(zhuǎn)染效率以及生殖系傳遞效率在此基礎(chǔ)上還會再進(jìn)一步提升。此外，不同的物種所需要的cas9基因以及sgRNA啟動子也不盡相同，RNA聚合酶Ⅲ依賴的U6和U3便可較好地在時(shí)間和空間上表達(dá)原核生物的gRNA［76］，而非U6和U3啟動子就可能出現(xiàn)在動物中不正常表達(dá)的gRNA。所以通過尋找家禽最適啟動子這一方法來提高CRISPR技術(shù)的穩(wěn)定性和高效性也值得研究者們重視。

5 結(jié)語

CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)打破了傳統(tǒng)基因工程技術(shù)效率低、成本高、穩(wěn)定性差的局面，推動家禽基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，對家禽基因組編輯模型的發(fā)展以及生產(chǎn)性能的提高作出杰出貢獻(xiàn)。但脫靶效應(yīng)很大程度上制約了CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽中的應(yīng)用，應(yīng)盡快找到控制其脫靶效應(yīng)的突破口，大力推廣CRISPR/Cas9技術(shù)在家禽遺傳育種中的應(yīng)用，提升家禽生產(chǎn)效率，相信其在家禽的各項(xiàng)研究領(lǐng)域必然擁有很廣闊的發(fā)展空間。近幾年，能夠切割出黏性末端便于插入連接的CRISPR/cpf1系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用［77］，以及基于失活的Cas9系統(tǒng)利用FokⅠ酶進(jìn)行切割從而提高切割效率等方法的發(fā)現(xiàn)［78］，都展現(xiàn)出CRISPR/Cas9系統(tǒng)的強(qiáng)大潛力與開發(fā)和利用的空間。科學(xué)家們也在不斷努力地尋找可以控制CRISPR/Cas9系統(tǒng)的開關(guān)蛋白［79］，并且已有一些成功降低脫靶效應(yīng)的效應(yīng)蛋白得到了驗(yàn)證［80］。這些都展現(xiàn)出CRISPR技術(shù)還擁有巨大的改進(jìn)空間和廣闊的發(fā)展前景。通過人們不斷地努力探索和完善，CRISPR技術(shù)變得更加精確之后必然會得到廣泛的應(yīng)用，成為探索生命本質(zhì)的利器從而帶來更大的效益。