冬瓜枯萎病研究進(jìn)展

石 博，關(guān) 峰，張景云，萬新建，張會(huì)國(guó)，黃國(guó)東

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 南昌 330200； 2.江西省高安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 江西高安 330800）

冬 瓜[Benincasahispida（Thunb.）Cogn.]為 葫 蘆科冬瓜屬一年生蔓生植物，在我國(guó)已有2000 多年的種植史[1]。冬瓜是一種高產(chǎn)蔬菜，1 hm2產(chǎn)量可達(dá)150 t，除高產(chǎn)優(yōu)勢(shì)外，冬瓜還具有易栽培、耐貯運(yùn)、耐濕熱、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前其種植面積已超過30 萬hm2，且冬瓜已成為我國(guó)南菜北運(yùn)的主要蔬菜之一[2-3]。近年來，由于多年連作導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化，連作障礙嚴(yán)重，冬瓜枯萎病的發(fā)生也日益頻繁[4-5]，現(xiàn)已成為制約冬瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。冬瓜枯萎病是一種土傳真菌性病害，致病菌為尖孢鐮刀菌冬瓜?；停‵usarium oxysporumSchl. f. sp.benincasae）[6-9]，在冬瓜整個(gè)生育期枯萎病均可發(fā)生，特別是我國(guó)南方地區(qū)因夏季高溫多雨等氣候條件，發(fā)病尤為頻繁，發(fā)病時(shí)一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)在60%以上，制約了冬瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[5]。

因此，了解冬瓜枯萎病病源鑒定方法、發(fā)生規(guī)律、抗性種質(zhì)鑒定及抗病育種等方面的研究進(jìn)展，對(duì)挖掘抗性種質(zhì)資源和基因資源具有非常重要的意義，并可為后續(xù)開展冬瓜枯萎病研究提供參考和依據(jù)。

1 冬瓜枯萎病病原菌的鑒定

1985 年，Gertagh 等[10]首次發(fā)現(xiàn)一種導(dǎo)致冬瓜枯萎病發(fā)生的真菌?；汀怄哏牭毒蠈；停‵.oxysporumf.sp.benincasae）。1995 年孫妍芳等[11]對(duì)冬瓜枯萎病分離物進(jìn)行了?；丸b定研究，發(fā)現(xiàn)該致病菌?；洼^強(qiáng)，只嚴(yán)重侵染冬瓜，還可導(dǎo)致西瓜和瓠瓜輕度發(fā)病。已有報(bào)道表明，葫蘆科瓜類枯萎病尖孢鐮刀菌共存在7 種種下分化[10，12-14]。目前，常見尖孢鐮刀菌的鑒定一般結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、致病性檢測(cè)和分子生物學(xué)鑒定3 種方法。冬瓜枯萎病菌形態(tài)學(xué)觀察多采用PDA 培養(yǎng)基，于26 ℃真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，同時(shí)觀察菌落和菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)，并在電子顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。曾永三等[15]對(duì)冬瓜枯萎病菌的生物學(xué)特征進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌冬瓜?；偷木z呈絨毛絮狀，菌落顏色為紫色或白色稍帶粉紫色。菌絲體側(cè)生小梗，從單出的瓶狀小梗頂上長(zhǎng)出形成分生孢子。分生孢子形狀均為鐮刀形，基部有細(xì)小足細(xì)胞。厚垣孢子頂生或間生，形狀為圓形，表面光滑[16]。致病性測(cè)定可明確病原菌致病力強(qiáng)弱及具體專化型，冬瓜枯萎病菌鑒定目前多采用人工苗期接種法對(duì)幼苗接種病原菌，置于溫度為28 ℃、光照12 h 的培養(yǎng)箱中，以未接種冬瓜幼苗為對(duì)照，接菌10～15 d 后冬瓜幼苗子葉黃化、葉片逐漸枯萎，最終死亡。分子生物學(xué)鑒定則是在分子水平檢測(cè)致病菌的類別，進(jìn)一步明確其?；汀Ｒ话闶褂猛ㄓ靡颕TS1 和ITS4 擴(kuò)增分離物鑒定DNA，將菌株rD‐NA-ITS 序列在GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)。序列相似性≥99%，鑒別為同種；序列相似性在95%～99%之間，鑒別為同屬；序列相似性≤95%，鑒別為同科[17]。目前NCBI 數(shù)據(jù)庫中有大量的鐮刀菌ITS序列[5，12，18]。在試驗(yàn)中依次操作這3 種方法對(duì)病原菌進(jìn)行觀察和鑒定，其結(jié)果更為準(zhǔn)確。

2 發(fā)病規(guī)律及尖孢鐮刀菌侵染過程

尖孢鐮刀菌是土壤習(xí)居真菌，一旦成功在土壤中定殖幾乎無法消除[19]，因此連作多年的老菜地更易發(fā)病，尤其在開花期、坐果期和果實(shí)膨大期等關(guān)鍵時(shí)期，枯萎病發(fā)病率高達(dá)60%或以上[5]，甚至絕收，這對(duì)冬瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成很大影響?？菸?duì)溫度適應(yīng)性很強(qiáng)，在20～32 ℃均可發(fā)病，且溫度越高發(fā)病越重，在溫度為28～32 ℃時(shí)，病害發(fā)生最為嚴(yán)重[16]。另外，濕度也是影響枯萎病發(fā)病的一個(gè)重要因素，夏季雨后晴天會(huì)促進(jìn)病害的快速發(fā)生。此外，地塊積水、土壤酸性、多年連作、地下害蟲增多等均可促進(jìn)枯萎病發(fā)生。關(guān)峰等[20]研究發(fā)現(xiàn)病原菌是在土壤的植株病殘?bào)w內(nèi)以菌絲體、厚垣孢子或菌核越冬，且該致病菌可在土壤中存活5 年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。

枯萎病發(fā)生時(shí)，植株下部葉片從邊緣向內(nèi)開始黃化、萎蔫，后期植株上部葉片從頂葉開始逐漸萎蔫干枯，最后整株干枯死亡。嚴(yán)重時(shí)病株下部會(huì)出現(xiàn)縱向淺褐裂紋，潮濕天氣下病部會(huì)分泌膠狀物。從病株顯癥到全株枯死，一般需要7～10 d[21]。病原菌主要通過根部的傷口或根毛頂端細(xì)胞進(jìn)入寄主植物體內(nèi)[22-23]，并在寄主植物的導(dǎo)管中產(chǎn)生大量菌絲和菌核，堵塞維管束導(dǎo)管，阻斷有機(jī)質(zhì)、礦物質(zhì)和水分的運(yùn)輸[24-25]，且分泌毒素和分解酶，從而導(dǎo)致寄主植物組織分解和壞死，最終致使植株萎蔫、死亡[26-28]。謝大森等[29]研究發(fā)現(xiàn)，病原菌由根系向植株頂端擴(kuò)散，病株的萎蔫也先從下部葉片開始，逐漸向上黃化萎蔫。Zhang 等[30]認(rèn)為西瓜枯萎病菌侵染后，西瓜根部木質(zhì)部導(dǎo)管通過快速形成膜狀物、填充體及細(xì)胞壁增厚阻塞菌絲入侵，這與Mace 等[31]的觀點(diǎn)相吻合。枚貴[32]采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)研究鐮刀菌脅迫下冬瓜根部細(xì)胞壁果膠多糖的組織細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)冬瓜與枯萎病菌的互作過程存在果膠酶的參與現(xiàn)象。

3 冬瓜枯萎病防治方法

為進(jìn)一步提高冬瓜品質(zhì)與產(chǎn)量，需加大預(yù)防與防控措施，以農(nóng)業(yè)防治、生物防治為主，以化學(xué)藥劑防治為輔，及時(shí)有效地開展綠色防控工作。

3.1 農(nóng)業(yè)防治

農(nóng)業(yè)防治包括與非寄主作物輪作、加強(qiáng)水肥管理、高溫曬土等[33]。連作對(duì)冬瓜土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落等有很大的影響，使土壤微生物群落由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)化，且致病性真菌增加，最終導(dǎo)致冬瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降。前人研究表明，與大蒜、韭菜、茼蒿等輪作能夠明顯降低土壤中的鐮刀菌豐度，枯萎病的發(fā)病率可降低40%[34-35]。合理的水肥管理是減少病害必不可少的措施，精耕細(xì)作、增施有機(jī)肥和磷鉀肥、添加土壤改良劑改善土壤結(jié)構(gòu)等均是簡(jiǎn)單有效的防治手段[36]。另外，閑田時(shí)用地膜覆蓋土壤并連續(xù)高溫暴曬等方法也可以明顯降低土層中枯萎病菌含量，可減輕枯萎病的發(fā)生。

3.2 生物防治

生防菌在可持續(xù)綠色農(nóng)業(yè)中具有越來越重要的作用，目前用于植物病害防治的生防菌主要有木霉菌（Trichodermaspp.）、芽孢桿菌（Bacillus）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和盾殼霉（Coniothyri‐um minitans）等。芽孢桿菌具有抑制多種病原菌的廣譜能力，在生產(chǎn)上使用較為普遍[37]。目前，常見的生防菌芽孢桿菌主要有解淀粉芽孢桿菌（B.amylo‐liquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和多粘芽孢桿菌（B.polymyxa）等[38-39]。已有研究表明，芽孢桿菌發(fā)酵液復(fù)配蚯蚓堆肥浸提液具有良好的促根壯秧的作用，可有效減少枯萎病的發(fā)生。根際促生菌B.velezensisF21 能增強(qiáng)西瓜對(duì)枯萎病的抗性，在大棚和露地的防治效率分別為80.35%和65.81%[40]。

3.3 化學(xué)防治

化學(xué)防治是枯萎病防治中最常用的方法，主要是通過藥劑殺死病原菌從而達(dá)到減輕病害的目的，見效快、操作簡(jiǎn)單。目前，瓜類枯萎病多采用噻菌銅、多菌靈、噁霉靈、甲基硫菌靈等內(nèi)吸性殺菌劑進(jìn)行種子消毒，有研究表明，噁霉靈與澳菌睛混合復(fù)配劑對(duì)香蕉枯萎病有較好的防治效果[41]。噁霉靈與多菌靈混合使用對(duì)土壤進(jìn)行消毒處理，也可起到防治作用[42]。張曼等[43]發(fā)現(xiàn)，20%硅唑·咪鮮胺EW、70%甲基硫菌靈WP 和25%多菌靈WP 能很好地抑制鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)，抑菌率在80%以上。目前生產(chǎn)上大面積推廣的抗病品種較少，化學(xué)防治仍是目前防治枯萎病最常用的方法，但此種方法在農(nóng)藥使用不當(dāng)時(shí)會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，破壞土壤，污染水質(zhì)。

4 冬瓜枯萎病抗性種質(zhì)資源鑒定與抗病育種

選用抗病品種是防治病害最有效的措施，而抗病冬瓜種質(zhì)資源鑒定是抗病育種的重要基礎(chǔ)和必要手段。目前，苗期人工接種鑒定被廣泛用于瓜類枯萎病的抗性鑒定中，常用的接種方法有灌根法[44]、浸根法[45]、傷根法[46]等，其中前2 種方法接種菌量較容易控制，在實(shí)際操作中比較常見。謝大森等[47]從不同來源的冬瓜材料中篩選出2 個(gè)高抗枯萎病的材料，并發(fā)現(xiàn)抗病材料與防御酶之間有正相關(guān)?？档沦t等[5]在自然發(fā)病條件下，對(duì)來自國(guó)內(nèi)外的36 份冬瓜材料進(jìn)行抗性鑒定，找到7 份高抗種質(zhì)，抗性強(qiáng)弱順序依次為黑皮＞粉皮＞青皮。趙芹等[48]以黑皮冬瓜為試材，根據(jù)NBS 類抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，得到19 個(gè)抗病同源序列。冬瓜種質(zhì)資源的遺傳背景狹窄，因而通過傳統(tǒng)的圖位克隆獲得抗病基因難度較大。謝大森等[49]利用RAMP 技術(shù)，獲得了與冬瓜枯萎病抗性連鎖的分子標(biāo)記，此標(biāo)記可篩選攜帶有抗枯萎病基因的冬瓜種質(zhì)。劉文睿等[50]從冬瓜抗病材料基因組中分離獲得32 個(gè)特異抗病基因同源序列。目前市場(chǎng)上抗病品種主要有廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的鐵柱冬瓜[51]、墨寶[52]等，湖南興蔬種業(yè)有限公司的墨地龍[53]、鐵桿粉斯[54]等，其中鐵柱冬瓜在我國(guó)有較大的種植面積。

5 展 望

冬瓜在瓜類蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位，而冬瓜枯萎病嚴(yán)重威脅冬瓜的安全生產(chǎn)。今后應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注抗病資源篩選、抗性基因定位、抗病機(jī)制解析和抗性品種選育等研究方向。一是加強(qiáng)抗病種質(zhì)資源的篩選。抗病鑒定是評(píng)價(jià)冬瓜品種枯萎病抗性的基本手段，關(guān)鍵是提高抗性鑒定穩(wěn)定性。目前，尚未見關(guān)于冬瓜枯萎病抗性評(píng)價(jià)的技術(shù)規(guī)范。由于枯萎病接種與發(fā)病受多因素影響，如菌株、溫度、濕度等，明確菌株致病力，統(tǒng)一鑒定條件與標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照品種是當(dāng)務(wù)之急。隨著《第三次全國(guó)農(nóng)作物種質(zhì)資源收集與普查行動(dòng)》的實(shí)施，我國(guó)收集到千余份各地冬瓜地方老品種，其中江西省收集并保存101 份古老冬瓜種質(zhì)資源[55]，目前尚未對(duì)這些地方冬瓜種質(zhì)資源開展枯萎病抗性精準(zhǔn)鑒定。表型鑒定在抗病育種中花費(fèi)大量時(shí)間，提高枯萎病抗性表型鑒定效率也將是今后的重要研究方向。二是深入挖掘抗性基因。冬瓜枯萎病是多基因控制的性狀，不同抗性資源種的抗性位點(diǎn)聚合可提高冬瓜枯萎病抗性。2019 年冬瓜全基因組測(cè)序已完成，以此為基礎(chǔ)挖掘冬瓜種質(zhì)資源中所攜帶的優(yōu)異基因，結(jié)合表型組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)手段將優(yōu)異種質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為優(yōu)異基因資源是加快冬瓜抗枯萎病育種進(jìn)程、防治枯萎病的有效途徑。三是選育多樣化冬瓜品種。隨著人民生活水平的提高和冬瓜種植面積的擴(kuò)大，目前市場(chǎng)上對(duì)優(yōu)質(zhì)冬瓜新品種的需求日益增加，篩選抗病、耐高溫、耐強(qiáng)光、耐濕的冬瓜新品種十分必要，具有廣闊的應(yīng)用前景。