非洲豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

鄂秋煦，楊婧怡

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122）

非洲豬瘟(ASF)的病原是非洲豬瘟病毒(ASFV)，該病是嚴(yán)重影響家豬與野豬的出血、熱性高度致死性傳染病，ASF 的流行對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的影響。由于市場貿(mào)易與流動性，導(dǎo)致ASFV 很容易在家豬之間傳播。ASF 嚴(yán)重威脅豬的健康、食品安全、國民經(jīng)濟和生產(chǎn)環(huán)境?？紤]到目前還沒有理想的治療手段和有效疫苗，ASF 控制主要基于嚴(yán)格的衛(wèi)生措施。這些措施包括減少接觸感染動物的數(shù)量和限制出口，但這可能會導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失?？梢哉fASF 是目前全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的最大威脅。

1 非洲豬瘟病毒與疫苗研究背景

ASFV 是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雙鏈線性DNA 病毒，基因組的大小約為170～190kb。ASFV 可編碼約200種蛋白質(zhì)，其中近1/3 為結(jié)構(gòu)蛋白，重要的結(jié)構(gòu)蛋白p30、p54、p72 等是當(dāng)前研究的熱點。ASFV 主要對單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞形成威脅，其中病毒對巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)對致病與免疫逃避機制方面尤為重要。ASFV 根據(jù)毒力的強弱可分為高致病性、中致病性、低致病性和無癥狀感染毒株。臨床上遇到的ASF 病例大多數(shù)來自高致病性病毒的感染，高發(fā)病率與高死亡率是其典型的特點。ASFV 是一種重要的跨界病原體，從東歐傳播到亞洲，進(jìn)而增加了對其他養(yǎng)豬生產(chǎn)中心的風(fēng)險。特別是從2018 年8 月從遼寧省沈陽市傳入后，ASF 開始在中國多個省份流行，為了防控該病，截至目前已經(jīng)屠宰超過百萬頭豬。

雖然非洲豬瘟病毒早在上世紀(jì)初就被發(fā)現(xiàn)，但是對于非洲豬瘟的疫苗研究卻落后了近半個世紀(jì)，這可能與ASFV 龐大且復(fù)雜的基因組所帶來的明顯的遺傳多樣性有關(guān)聯(lián)。到目前為止，宿主保護(hù)性反應(yīng)的機制還未完全確定，保護(hù)性抗原也有待確定，這對非洲豬瘟疫苗的深入研究形成阻力。缺乏針對ASF 的有效治療或疫苗使得國內(nèi)國際ASF 的防控變得復(fù)雜。而一直以來關(guān)于ASF 疫苗研究從未間斷，研制出適合豬免疫的疫苗是疫苗研發(fā)的重點，目前在科研人員不間斷的努力下，一些試驗性的疫苗開始表現(xiàn)出效果。此外，也有一些研究人員將目光鎖定在蜱用疫苗的研制上，目的是切斷軟蜱造成的ASFV 感染。關(guān)于非洲豬瘟的疫苗研究大體上可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗，其中基因工程疫苗是當(dāng)前研究的熱點，具體又可分為基因缺失疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗等。

2 非洲豬瘟滅活疫苗

滅活A(yù)SF 疫苗是研究較早的疫苗，開始于20世紀(jì)60 年代，但大量的研究表明滅活A(yù)SFV 作為疫苗基本上是不可行的策略。滅活疫苗雖具有抗原性，但缺乏刺激機體產(chǎn)生完整細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，這可能是滅活疫苗無法提供免疫保護(hù)的原因之一。

3 非洲豬瘟減毒活疫苗

連續(xù)傳代減毒的ASFV 可誘導(dǎo)針對親本毒株的保護(hù)性免疫應(yīng)答。20 世紀(jì)60 年代，減毒株開始研究，但由于ASF 的慢性感染癥狀而被放棄，這種癥狀廣泛出現(xiàn)在接種疫苗的豬身上。在后續(xù)研究中，接種ASFV 自然減毒株NH/P68 的豬對毒力株ASFV L60 具有耐藥性，而NK 細(xì)胞活性增加，表明NK細(xì)胞活性與ASFV 的保護(hù)性免疫成正相關(guān)。此外，接種自然減毒毒株OURT88/3 可誘導(dǎo)交叉保護(hù)性免疫，以抵抗非同源ASFV 毒株的攻擊，這與接種豬淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的能力有關(guān)。同樣也提示了ASFV 活疫苗免疫的特殊性。

4 非洲豬瘟基因工程疫苗

大多數(shù)疫苗在接種后能夠抵抗同源親本毒株的攻擊。但也有部分接種過疫苗的豬產(chǎn)生一定的病毒血癥和副作用。因此，基因缺失疫苗仍有一些不確定性值得考慮。不同毒株中相同的基因缺失并不一定具有相同的結(jié)果，原因在于對ASFV 的抑制和保護(hù)作用可能取決于毒株。2016 年，O” Donnell 團隊在ASFV Georgia 2007/1 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步刪除了MGF360/505-△9GL，雖然刪除的菌株高度減毒，但對同源毒株的感染沒有保護(hù)作用，當(dāng)Ramirez Medina 等人同時刪除Georgia/2007 菌株的9GL、UK 和NL 基因時，也出現(xiàn)了相同的問題。目前，對有關(guān)機制的探索還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，研究人員還需在進(jìn)一步的工作中優(yōu)化可刪除的基因組合，以填補相關(guān)毒力或免疫逃逸基因研究的空白。

絕大部分沒有ASFV 相關(guān)毒力基因的基因缺失疫苗可以提供完全保護(hù)，且由于剩余毒力的存在，容易引起毒力恢復(fù)的潛在風(fēng)險。近期的研究表明，通過刪除中國HLJ/2018 菌株的多基因家族MGF360/505 的6 個基因獲得的減毒菌株HLJ/18-6 GD 可以保護(hù)豬免受親本毒株的攻擊。但是進(jìn)一步的評估數(shù)據(jù)表明，該疫苗可能存在形成強毒株的高風(fēng)險。該研究團隊的最新的實驗表明，將CD2v 基因刪除而設(shè)計的HLJ/-18-7GD 浮出水面，目的是最大限度消除前述所帶風(fēng)險，并提供足夠的保護(hù)。

當(dāng)前，以亞單位疫苗等為代表的ASF 基因工程疫苗，在圍繞副作用以及安全性方面提供了有針對性的解決方案。一些ASFV 蛋白（p30、p54、p72、CD2v、pp62 等）是ASF 疫苗研究在主要靶點的熱門選擇。Gomez-Puertas 等人發(fā)現(xiàn)病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白p72、p54 和p30 等在中和抗體中起到關(guān)鍵作用，其中的原因在于p72 與p54 可抑制病毒吸附，而p72和p30 可激活細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，研究人員利用表達(dá)ASFV p30 和p54 的重組桿狀病毒對豬進(jìn)行疫苗接種，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，對ASFV-E75 株具有一定的免疫保護(hù)作用。隨后，重組桿狀病毒表達(dá)的嵌合蛋白p54/30 接種豬也發(fā)生了類似的結(jié)果。但是在研究的過程中也發(fā)現(xiàn)一些問題，那就是中和抗體對以上蛋白在抗體介導(dǎo)的保護(hù)方面并不完全。因此，這也引起了人們對p30、p54和p72 在免疫保護(hù)中的相關(guān)性的懷疑。

同時DNA 蛋白免疫可能有助于識別病毒抗原特異性應(yīng)答，這可以為開發(fā)更高效、更安全的ASFV亞單位疫苗提供更多潛在信息。2019 年，ASFV 重組蛋白（p15、p35、p30、p54、CD2v-E）與pcDNA3 的結(jié)合。選擇編碼ASFV 基因（CD2v、p30、p72、CP312R）的豬，用ISA25 佐劑免疫豬。結(jié)果表明，接種ASFV DNA+蛋白的豬可以激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，其中p72 是IFN-γ 的主要誘導(dǎo)劑。在目前的研究中，特異性ASFV 蛋白和編碼ASFV 基因的pcDNAs 之間協(xié)同作用的機制尚不清楚，并且pcDNAs 可能觸發(fā)一些非特異性免疫反應(yīng)，從而增強對這些蛋白的特異性反應(yīng)。影響免疫介導(dǎo)的ASFV 感染和疾病發(fā)生的主要原因在于，抗體依賴性增強（ADE）影響中和抗體的產(chǎn)生。

近年來，為了能夠在抗體與細(xì)胞介導(dǎo)的ASFV免疫反應(yīng)中間達(dá)到均衡，對豬進(jìn)行了復(fù)合ASFV 抗原制劑的免疫接種。2017 年，Lopera Madrid 等人發(fā)現(xiàn)，接種HEK 293 純化重組ASFV 蛋白（p72、p54、p12）可促進(jìn)ASFV 特異性抗體的產(chǎn)生，但并沒有增強細(xì)胞免疫。然而用改良痘苗病毒Ankara（MVA）載體抗原（p72、EP153R 和CD2v）增強免疫可補充前者，并通過細(xì)胞免疫促進(jìn)IFN-γ 的產(chǎn)生。在DNA疫苗的基礎(chǔ)上，提出了DNA 原代和重組痘苗病毒（V ACV）增強策略，以使編碼抗原定向到特定的抗原表達(dá)途徑，以增強對保護(hù)反應(yīng)的誘導(dǎo)，并廣泛應(yīng)用于ASFV 的免疫原性和潛在的保護(hù)性抗原的篩選。Jancovich 等人在2018 年通過篩選47 個病毒基因，鑒定出一個ASFV 抗原的亞群，包括p30、p72 和D117L，通過篩選47 個病毒基因，可以有效地刺激體液和細(xì)胞免疫。盡管接種豬血液和淋巴組織中的病毒負(fù)荷顯著下降，但所有接種過疫苗的豬都出現(xiàn)急性ASF，并觀察到更嚴(yán)重的臨床和病理征象。

5 總 結(jié)

ASFV 的傳播迅速，養(yǎng)殖形式的多元化與密度高、養(yǎng)殖人員缺乏足夠的生物安全意識，諸多原因使我國ASF 整體防控形勢依然嚴(yán)峻。由于目前還沒有商用疫苗，國內(nèi)的ASF 防控在很大程度上還需依靠嚴(yán)格的生物安全體系?；谇笆鯝SF 疫苗研究現(xiàn)狀分析，利用ASFV 毒力基因敲除減毒株開發(fā)的重組疫苗作為未來中短期候選疫苗具有比較樂觀的前景。ASF 基因工程疫苗也具有巨大的研究潛力，但我們必須要注意的是，這些疫苗是否能實現(xiàn)對致命ASFV 株起到完全的免疫保護(hù)。保護(hù)性潛力的抗原是需要發(fā)現(xiàn)和深入研究的重點。