一株堆肥高效解磷菌的篩選、鑒定及其溶磷特性

詹亞斌， 張磊， 丁曉艷， 馬恬恬， 魏雨泉*， 李季

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院， 北京 100193； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有機循環(huán)研究院(蘇州)， 蘇州 215100)

磷是植物生長必需的三大元素之一[1]，中國74%以上的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無效形式。為避免磷素缺乏對糧食增產(chǎn)的制約，每年大量磷肥會施入耕地；但大部分磷進入土壤后，易與Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等結(jié)合形成難溶性磷，降低了磷肥的磷素植物可利用性，導(dǎo)致作物當(dāng)季利用率較低(5%～10%)；大量施磷還會導(dǎo)致磷素在土壤中富集，并向水體中遷移，造成水體富營養(yǎng)化。因此，如何提高磷肥的磷素有效性，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題[2-4]。

常用的化學(xué)磷肥(磷酸銨、過磷酸鈣)大都是通過磷礦粉加工制作而成，制作成本較高且溶解率較低。許多科研工作者在有機廢棄物堆肥過程中添加磷礦粉，期望通過堆肥過程有機物分解和微生物分泌的有機酸，活化難溶性無機磷，增加堆肥產(chǎn)品的速效磷含量[5]。由于解磷微生物可活化難溶性磷，目前，已有大量報道將解磷菌接種于堆肥，以進一步強化堆肥磷素轉(zhuǎn)化；但是大部分是從土壤中篩選獲得解磷菌，擴大培養(yǎng)后接種至堆肥中[6-10]；土壤中篩選獲得的解磷菌，可能并不適應(yīng)堆肥生態(tài)環(huán)境。為了進一步提升解磷菌劑的適應(yīng)性及其生物安全性，應(yīng)優(yōu)先考慮從堆肥中篩選獲得高效解磷菌株，將其制備為解磷菌劑，并應(yīng)用于堆肥中。

從雞糞堆肥中篩選高效解磷菌株，通過16S rDNA進行菌種鑒定，并研究不同碳源、氮源、初始pH、難溶性磷種類、難溶性磷添加量、可溶性磷濃度對菌株溶磷效果的影響。以期為有機廢棄物堆肥提供解磷菌種資源，從而提高有機廢棄物堆肥化產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

篩菌樣品：取雞糞好氧堆肥腐熟物料500 g，放入無菌塑料袋中，封口，即刻帶回實驗室4 ℃保存，用于解磷菌株的篩選。

供試磷源：磷酸三鈣 Ca3(PO4)2(分析純，P質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.00%)；磷酸鐵 FePO4·H2O (分析純，P質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.60%)；磷酸鋁 AlPO4(分析純，P質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.00%)。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)國家植物研究所磷酸鹽培養(yǎng)基(National Botanical Research Institute’s phosphate growth medium，簡稱“NBRIY培養(yǎng)基”)葡萄糖10.00 g，CaCl22.22 g，(NH4)2SO40.50 g，MgSO40.10 g，F(xiàn)eSO40.002 g，MnSO40.002 g，KCl 0.20 g，NaCl 0.20 g，Ca3(PO4)25.00 g，瓊脂15.00 g，1% 溴甲酚紫2 mL，蒸餾水1×103mL，調(diào)節(jié)pH至7.0；主要用于解磷菌的篩選；固體培養(yǎng)基添加20.00 g瓊脂粉。

(2)蒙金娜液體培養(yǎng)基(Pikovskaya’s medium，簡稱“PVK培養(yǎng)基”)：葡萄糖10.00 g，(NH4)2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，蒸餾水1×103mL，分裝到搖瓶中，每瓶液體100 mL、Ca3(PO4)25.00 g，調(diào)節(jié)pH至7.0；主要作為無機磷基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基，進行解磷菌的研究。

(3)溶菌肉湯液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani；以下簡稱“LB培養(yǎng)基”)：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，蒸餾水1×103mL，調(diào)節(jié)pH至7.0；主要用于菌株的活化和保存。

(4)LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20.00 g瓊脂粉；主要用于菌株培養(yǎng)及形態(tài)觀察。

1.2 試驗方法

1.2.1 解磷菌株的初篩、復(fù)篩

(1)初篩。稱取采集到的新鮮樣品10 g，置于250 mL三角瓶中，倒入0.85% NaCl 90 mL，將三角瓶放入30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)30 min，進行10倍系列梯度稀釋，分別取稀釋到10-3、10-4、10-5樣品溶液100 μL，均勻涂步到改良NBRIY培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)6 d。挑選生長良好，使培養(yǎng)基由藍色變?yōu)辄S色、D/d(D為透明圈直徑，d為菌落直徑)較大的菌落，于LB固體培養(yǎng)基中純化后，置于4 ℃保存。

(2)復(fù)篩。將初篩的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，稀釋菌株的OD600為1；按照1%接種至PVK液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至7.0，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量，最終確定高效穩(wěn)定的解磷菌株。

1.2.2 解磷菌株的分子鑒定

采用煮沸法獲取高效解磷菌株的DNA，16S rDNA(27F: 5′-AGA GTTTGATC-CTGGCTCAG-3′和1492 R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)的保守型序列為引物進行擴增，擴增產(chǎn)物純化回收后，送生工生物(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果在國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中進行比對(BLAST)分析，并通過軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.2.3 菌株溶磷能力的測定

(1)不同碳源對菌株溶磷效果的影響。以PVK培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、纖維素、可溶性淀粉為碳源，其中葡萄糖、半乳糖的添加量為10.0 g/L，蔗糖、乳糖的添加量為9.5 g/L，纖維素、可溶性淀粉的添加量為9.0 g/L(保證每個處理中C含量一致)。調(diào)節(jié)pH至7.0，接種量1%，不接種的作為對照(CK)，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量、pH。

(2)不同氮源對菌株溶磷效果的影響。以PVK培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加0.50 g (NH4)2SO4、0.41 g NH4Cl、0.23 g CO(NH2)2為氮源，調(diào)節(jié)pH至7.0，接種量1%，不接種的作為CK，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量、pH。

(3)不同初始pH對菌株溶磷效果的影響。以PVK培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，調(diào)節(jié)pH至4、5、6、7，接種量1%，不接種的作為CK，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量、pH。

(4)不同難溶性磷源(磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁)對菌株溶磷效果的影響。以PVK培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以6.02 g FePO4(分析純)、4.0 g AlPO4(分析純)替換5.0 g Ca3(PO4)2(等P含量)，調(diào)節(jié)pH至7.0，接種量1%，不接種的作為CK，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量、pH。

(5)難溶性磷濃度對菌株溶磷效果及生物量的影響。以PVK培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，難溶性磷為磷酸鈣，Ca3(PO4)2添加量分別為2.5、5.0、7.5 g，調(diào)節(jié)pH至7.0，接種量1%，不接種的作為CK，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量、pH、生物量(OD600)。

(6)可溶性磷濃度對菌株溶磷效果及生物量的影響。以PVK培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，向培養(yǎng)基中加入磷濃度為0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mmol/L的KH2PO4/K2HPO4緩沖液(平衡磷酸鹽自身酸堿度對pH的影響)，調(diào)節(jié)pH至7.0，接種量1%，不接種的作為CK，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d，測定溶液中水溶性磷含量、pH、生物量(OD600)。

1.2.4 測定方法

向上述剩余的發(fā)酵液中加入2 mL H2O2，振蕩后，160 ℃滅菌120 min，以充分破壞菌體，釋放出微生物量磷，5×103r/min離心取上清液，采用鉬銻抗比色法[19]測定解磷總量；pH采用臺式pH計測定[12]。

溶磷量=溶液最終可溶性磷質(zhì)量-溶液初始可溶性磷質(zhì)量。

溶磷效率=溶磷量/溶液總磷質(zhì)量×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS、ORIGIN、MEGA對數(shù)據(jù)進行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的初篩、復(fù)篩

(1)初篩：在改良NBRIY培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后，發(fā)現(xiàn)有35株菌可以在平板上生長，使培養(yǎng)基由藍色變?yōu)辄S色、具有明顯溶磷圈的菌落7株。其中，PSB6的D/d最大，為3.32；其余處理的D/d為1.52～2.45。

(2)復(fù)篩：研究發(fā)現(xiàn)PSB6溶磷能力最強，為126.37 mg/L；其余處理的溶磷量為50.12～99.56 mg/L(均小于100.00 mg/L)。

表1 解磷菌的篩選結(jié)果

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對解磷菌株P(guān)SB6的16S rDNA基因片段進行PCR擴增，最終獲得長度約為1.5×103bp的基因序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與Bacillus_sp_hb90的序列相似度達到99%，將PSB 6初步歸于Bacillus_sp。將PSB6的基因序列提交至NCBI中的GenBank，獲得登錄號MW513386。根據(jù)結(jié)果構(gòu)建菌株P(guān)SB 6的系統(tǒng)發(fā)育分析如圖1所示。

圖1 菌株P(guān)SB6的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株溶磷能力研究

2.3.1 碳源

不同碳源對菌株解磷能力有明顯的影響(圖2)。葡萄糖和半乳糖有利于菌株解磷，溶磷量分別為123.3、111.6 mg/L；淀粉次之，溶磷量為54.8 mg/L；蔗糖、乳糖、纖維素的溶磷量最低。葡萄糖和半乳糖的發(fā)酵液pH分別為6.26和6.31(均小于6.5)；淀粉的pH較高(6.91)；蔗糖、乳糖、纖維素的發(fā)酵液的pH分別為7.62、7.82、8.41(均大于7.5)；說明整體上產(chǎn)酸能力越強，溶磷量會越大。根據(jù)以上結(jié)果，可知，菌株P(guān)SB6解磷的最適碳源為葡萄糖和半乳糖。

圖2 碳源對PSB6溶磷效果的影響

2.3.2 氮源

不同氮源對菌株的解磷能力影響不同(圖3)。以硫酸銨、氯化銨、尿素為氮源下PSB6的溶磷量分別為133.6、92.3、61.8 mg/L，培養(yǎng)液最終pH分別為6.08、6.15、7.43，研究結(jié)果表明，產(chǎn)酸能力越強，溶磷能力越大；菌株P(guān)SB6的最適溶磷N源為硫酸銨。

圖3 氮源對PSB6溶磷效果的影響

2.3.3 初始pH

不同初始pH對菌株解磷能力影響不同(圖4)。隨著初始pH的增大(4～8)，4個處理的溶磷量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。4個處理(pH為5、6、7、8)的溶磷量分別為53.5、111.2、126.37、90.3 mg/L，溶磷能力最強的是初始pH為7.0的處理，溶磷能力最弱的是初始pH為5.0的處理；可能是初始pH低的處理，不利于菌株P(guān)SB6的生長，從而不利于難溶性磷的溶解。培養(yǎng)第6天，4個處理的pH分別為6.12、6.23、6.37、6.48；可能是菌株產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液的pH呈現(xiàn)弱酸性(6.5以下)。

圖4 初始pH對PSB6溶磷效果的影響

2.3.4 難溶性磷種類

解磷菌PSB6對不同難溶性磷的解磷效果不同(圖5)，溶磷量從大到小排序為磷酸三鈣(125.6 mg/L)>磷酸鋁(35.3 mg/L)>磷酸鐵(9.6 mg/L)。3個處理的pH從小到大排序為磷酸三鈣(6.12)<磷酸鋁(6.50)<磷酸鐵(6.76)。說明雖然PSB6對不同難溶性磷都有解磷效果，但與磷酸鋁、磷酸鐵相比，對磷酸鈣的活化效果最強。

圖5 難溶性磷種類對PSB6溶磷效果的影響

2.3.5 難溶性磷添加量

難溶性磷(磷酸三鈣)含量會影響菌株的溶磷效果(圖6)。隨著磷酸三鈣含量增加，菌株P(guān)SB6的溶磷量逐漸降低；3個處理的溶磷量分別為170.5、125.6、80.3 mg/L，溶磷效率分別為34.10%、12.56%、5.35%；說明添加低含量(2.5 g/L)的磷酸鈣有利于菌株對難溶性磷的溶解，而高含量的難溶性磷含量(5.0、7.5 g/L)會抑制難溶性磷的溶解。3個處理的pH分別為6.07、6.18、6.33，說明添加磷酸鈣含量低(2.5 g/L)的處理有利于微生物的生長、產(chǎn)酸，從而有利于磷酸三鈣中難溶性磷的溶解。隨著磷酸三鈣含量的增加，菌株P(guān)SB6的OD600逐漸降低(與溶磷效率變化規(guī)律一致)，3個處理的OD600分別為0.65、0.55、0.49：說明難溶性磷含量低的處理溶磷量大，促進了PSB6的生長。

圖6 初始難溶性磷含量對PSB6溶磷效果的影響

2.3.6 可溶性磷濃度

可溶性磷濃度會影響影響菌株的溶磷效果(圖7)。隨著可溶性磷濃度的增加，菌株P(guān)SB6的溶磷量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵液中的可溶性磷濃度為0、0.5、1、5 mmol/L時，溶磷量為115.4、126.37、200.2、173.6 mg/L(均>100 mg/L)；當(dāng)發(fā)酵液的可溶性磷濃度為10～20 mmol/L時，菌株P(guān)SB6不發(fā)揮解磷效果；說明當(dāng)環(huán)境中的可溶性磷濃度達到10 mmol/L以上時，滿足了菌株P(guān)SB6生長所需的可溶性磷濃度；此時，不會激發(fā)PSB6對難溶性磷的溶解。隨著可溶性磷濃度的增加，菌株P(guān)SB6的OD600呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)第6天，6個處理的OD600分別為0.56、0.63、0.71、0.76、0.03、0.02。當(dāng)可溶性磷濃度為1、5 mmol/L時，PSB6的生物量較大，OD600分別為0.71和0.76；說明環(huán)境中存在一定量可溶性磷，會促進解磷菌株P(guān)SB6的生長。當(dāng)可溶性磷濃度為10、20 mmol/L時，PSB6的生物量較小，OD600分別為0.03、0.02；說明環(huán)境中的可溶性磷達到一定的濃度(>10 mmol/L)，會抑制菌株P(guān)SB6的生長，不會激發(fā)解磷菌對難溶性磷的溶解。

圖7 初始可溶性磷濃度對PSB6溶磷效果的影響

3 討論

碳源、氮源、初始pH、難溶性磷種類及含量會影響解磷微生物的生長代謝，從而影響難溶性磷的溶解。PSB6的最適碳源、氮源分別為葡萄糖和硫酸銨；這與鄭喜清等[14]的研究結(jié)果一致。王莉晶等[20]篩選獲得一株解磷菌最適解磷碳源為蔗糖；賀夢醒等[21]篩選獲得一株解磷最適解磷碳源為淀粉。不同解磷菌株的生長所需的最初始pH有所不同，pH過高或過低均會影響菌株的解磷能力。Xiao等[22]篩選獲得一株菌，最適解磷初始pH為6.0；鄭肖蘭等[23]篩選獲得一株菌最適解磷初始pH為8.0；高桂鳳等[15]篩選獲得一株菌，最適解磷初始pH為9.0；而本研究篩選獲得的PSB6最適解磷初始pH為7.0。當(dāng)難溶性磷源為磷酸三鈣時，菌株P(guān)SB6的溶磷效果最好；這與李豆豆等[12]的研究結(jié)果一致。當(dāng)培養(yǎng)液中可溶性磷濃度較低(0～5 mmol/L)時，PSB6具有較強的溶磷效果；當(dāng)培養(yǎng)液中可溶性磷濃度較高(≥10 mmol/L)時，PSB6幾乎不溶解難溶性磷；可能是，培養(yǎng)液中的可溶性磷可以滿足解磷菌株的PSB6的生長，不會激發(fā)解磷菌對難溶性磷的溶解；這里面存在的機制需要作進一步研究。

在后續(xù)的研究中，可以將本研究中篩選獲得的解磷菌PSB6，接種至堆肥中進行溶磷效果的驗證。若將PSB6接種至含有難溶性磷的堆肥中，可以嘗試往堆體中添加葡萄糖作為碳源、硫酸銨作為氮源，并且調(diào)節(jié)堆體pH至7.0；若堆體中需要添加難溶性磷，建議添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5‰的磷酸三鈣，以便最大限度地促進PSB6對難溶性磷的溶解。這對餐廚、污泥、畜禽糞便等有機廢棄物的資源化(堆肥)處理是極其有意義的[24-25]。

4 結(jié)論

(1)從雞糞堆肥物料中篩選獲得一株解磷細菌，命名為SPB6，根據(jù)形態(tài)觀察和16S rDNA序列比對，將該菌株歸屬于Bacillus_sp。

(2)在最適C源為葡萄糖、最適N源為硫酸銨、最適初始pH為7.0的條件下，PSB6的溶磷量為126.37 mg/L。

(3)PSB6的最適溶磷的難溶性磷為磷酸三鈣；當(dāng)磷酸三鈣為2.5 g/L時，具有最大溶磷量170.5 mg/L。

(4)PSB6的最適溶磷的可溶性磷濃度為1 mmol，溶磷量為200.2 mg/L；當(dāng)可溶性磷濃度超過10 mmol/L時，菌株P(guān)SB6不發(fā)揮解磷效果。

(5)若將PSB6應(yīng)用于好氧堆肥中，建議往堆體中添加部分葡萄糖和硫酸銨、0.25%的磷酸三鈣，以期促進堆體Olsen-P含量。