功能性聚氨酯表面層層自組裝透明質(zhì)酸和膠原

何顯運(yùn)，徐勇軍，原波

(廣東工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣州 510510)

可降解聚氨酯(PUR)材料一般由軟段和硬段構(gòu)成，可以通過(guò)改變軟硬段的構(gòu)成和比例，對(duì)PUR分子進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)材料性能、降解方式和降解速率的調(diào)控[1–2]。PUR材料己經(jīng)被應(yīng)用到血管、神經(jīng)、軟骨等組織修復(fù)中[3–5]。但和其他合成高分子材料一樣，PUR材料由于親水性，細(xì)胞黏附性較差，缺乏細(xì)胞識(shí)別信號(hào)位點(diǎn)，即生物相容性不是很好，所以其在生物醫(yī)用方面的應(yīng)用受到較大的限制。為了改善其生物相容性，通常的方法是對(duì)材料的表面進(jìn)行仿生修飾，在材料表面接枝或者沉積細(xì)胞外基質(zhì)成分，在保留PUR優(yōu)異力學(xué)性能的同時(shí)，又能提高其生物相容性[6–13]。Hsieh等[14]開(kāi)發(fā)了一種可生物降解的水性PUR/透明質(zhì)酸3D打印墨水，且3D打印制備了復(fù)合軟骨組織工程支架，與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)共培養(yǎng)，結(jié)果表明該成分能誘導(dǎo)MSCs成軟骨分化，將該支架植入兔膝蓋軟骨缺損模型可誘導(dǎo)兔軟骨再生。Lukas等[15]采用聚碳酸酯二醇制備了PUR，并用等離子體技術(shù)進(jìn)行表面處理，接枝上肝素，纖連蛋白、多肽等生物大分子，能明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與增殖，同時(shí)能夠抑制血栓的形成。Kawamoto等[16]利用等離子體技術(shù)處理PUR材料管的內(nèi)表面，將牛內(nèi)皮細(xì)胞種植在PUR管的內(nèi)表面，改善了材料的血液相容性，且促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和增殖。Fang等[17]制備了可生物降解PUR彈性體，通過(guò)用馬來(lái)酰亞胺修飾的多肽成功接枝在靜電紡絲的PUR材料上，改善了內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。Duy等[18]在靜電PUR納米纖維上通過(guò)自組裝氧化石墨烯(R-GO)，制備了可拉伸化學(xué)響應(yīng)性的納米復(fù)合物PUR/R-GO，該復(fù)合物對(duì)NO2具有出色的靈敏度，為可穿戴化學(xué)傳感的應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。筆者以自制的功能性PUR為基體，該P(yáng)UR是以賴氨酸二異氰酸乙酯為硬段，聚己內(nèi)酯為軟段，具有藥理活性的異山梨醇為擴(kuò)鏈劑，利用二步逐步合成的一種脂肪族可生物降解的聚合物，且降解產(chǎn)物呈弱堿性，沒(méi)有毒性或者毒性很小，支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[19]。通過(guò)胺解作用，在PUR材料表面接枝上氨基(—NH2)，再利用帶負(fù)電的透明質(zhì)酸(HA)和帶正電的膠原(Col)，通過(guò)靜電作用，層層自組裝(LBL)沉積到材料表面，既盡量保留了HA和Col的生物活性，又達(dá)到了對(duì)PUR材料表面的生物活性修飾，期望制得的表面修飾化PUR材料能夠應(yīng)用于組織工程支架。用自組裝方法在PUR材料表面沉積上透明質(zhì)酸和膠原的研究，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料及試劑

PUR：自制；

1，3-二氨基丙烷：生物試劑級(jí)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

Ⅰ型Col：生物試劑級(jí)，美國(guó)BD bioscience公司；

HA：生物試劑級(jí)，美國(guó)Sigma公司；

茚三酮：分析純，廣州齊云生物試劑有限公司。

1.2 主要設(shè)備及儀器

真空干燥箱：DZF-6050型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

表面接觸角分析儀：OCA20型，德國(guó)DATAPHYSICS公司；

石英微晶天平(QCM)：Q-SenseE4型，瑞典Q-Sense公司；

原子力顯微鏡(AFM)：MFP-3D-S型，美國(guó)Asylum Research公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

(1) PUR膜的制備。

將自制的PUR用少量的四氫呋喃溶劑進(jìn)行溶解，倒入到聚四氟乙烯模具中，形成薄薄的一層溶液，然后轉(zhuǎn)到40℃的鼓風(fēng)干燥箱中，靜置24 h，讓溶劑慢慢揮發(fā)，最后轉(zhuǎn)入溫度為30℃真空干燥箱中至恒重，制得PUR薄膜。

(2)氨基化PUR膜(PUR-NH2)的制備。

將上述制備的PUR膜在乙醇/水溶液(體積比1∶1)中浸泡一段時(shí)間，再用去離子水漂洗，完后用一定濃度的1，3-二氨基丙烷溶液進(jìn)行處理，然后再用去離子水充分漂洗以去除未反應(yīng)的1，3-二氨基丙烷，最后轉(zhuǎn)到溫度為30℃的真空干燥箱至恒重，制得PUR-NH2膜。圖1是PUR膜與1，3-二氨基丙烷反應(yīng)的示意圖。

圖1 PUR膜與1，3-二氨基丙烷反應(yīng)示意圖

(3) PUR-NH2膜層層自組裝HA和Col。

將上述制得的PUR-NH2膜用0.012 mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行酸化處理，接著用大量去離子水沖洗以去除表面吸附的鹽酸，然后將其浸泡到HA溶液中，使其表面吸附一層HA，再浸泡到Col溶液中，使其吸附一層Col，如此反復(fù)，使其層層沉積上HA和Col，最后轉(zhuǎn)到溫度為30℃的真空干燥箱至恒重，制得PUR-NH2/HA/Col膜。圖2是PUR-NH2自組裝HA/Col的過(guò)程示意圖。

圖2 PUR-NH2自組裝HA/Col過(guò)程示意圖

1.4 性能測(cè)試

采用表面接觸角分析儀測(cè)試PUR膜的親水性情況。

采用茚三酮分析法定量測(cè)試PUR膜表面接枝—NH2的密度。

采用QCM檢測(cè)在PUR膜表面上自組裝HA/Col的情況。

采用AFM觀察PUR自組裝HA/Col后的表面形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表面水接觸角

為表征材料表面的親水性能，通過(guò)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)試材料的親、疏水接觸角。表1是PUR，PURNH2和PUR-NH2/HA/Col三種膜測(cè)試得到的水接觸角。PUR膜接觸角為(86.5±1.1)°，接觸角較大，表示親水性能不夠好；PUR膜通過(guò)氨基化后得到的PUR-NH2的 接 觸 角 下 降 到(78.8±0.8)°，說(shuō) 明PUR-NH2的親水性能變好；而通過(guò)在PUR-NH2表面自組裝得到的PUR-NH2/HA/Col的接觸角降到(65.5±1.1)°，材料的表面親水性能得到明顯改善。其原因是在PUR-NH2表面沉積上HA和Col，使得該膜表面富集了大量的極性基團(tuán)，從而使材料的親水性能變好。而材料的親水性能變好，有利于細(xì)胞的黏附，改善細(xì)胞跟材料的親和力，提高材料的生物相容性。

表1 PUR、PUR-NH2和PUR/HA/Col膜的水接觸角 (°)

2.2 茚三酮分析法測(cè)試PUR-NH2膜表面的—NH2密度

采用茚三酮分析法對(duì)PUR-NH2膜表面—NH2密度進(jìn)行定量分析。圖3是用1，3-二氨基丙烷水溶液(9%)浸泡PUR膜，PUR膜表面—NH2密度與浸泡時(shí)間的關(guān)系曲線。PUR-NH2膜表面—NH2密度開(kāi)始隨浸泡時(shí)間增加而增大，當(dāng)接近2 h時(shí)，PUR膜表面—NH2密度達(dá)到最大值，而隨著浸泡時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，PUR膜表面—NH2的密度有所下降。其原因是PUR膜浸泡在1，3-二氨基丙烷中，發(fā)生胺解反應(yīng)，隨著時(shí)間的增加，接枝在PUR膜表面的—NH2量增，相應(yīng)的—NH2密度也增大，但隨著處理的時(shí)間繼續(xù)增加，胺解反應(yīng)會(huì)使材料的表層脫離，從而使接枝上的—NH2從材料表面脫落，相應(yīng)的—NH2密度也就下降。

圖3 PUR膜表面—NH2密度與浸泡時(shí)間的關(guān)系曲線

圖4是PUR-NH2膜表面的—NH2密度隨浸泡的1，3-二氨基丙烷水溶液濃度不同而變化的曲線。由圖4可以看到，浸泡時(shí)間同為1 h，1，3-二氨基丙烷濃度為12%時(shí)，PUR膜的—NH2密度最大，為11.4×10-7mol/cm2。假設(shè)—NH2只接枝在PUR膜表面，由此計(jì)算得到含一個(gè)—NH2的分子鏈所占的面積約為0.00014 nm2。這個(gè)計(jì)算結(jié)果顯然是不合理的，說(shuō)明PUR膜的胺解反應(yīng)不是單純發(fā)生在PUR膜的表面一層，而深入到膜的里層。

圖4 PUR膜表面—NH2密度與浸泡水溶液濃度的關(guān)系曲線

2.3 QCM檢測(cè)PUR—NH2膜表面上LBL自組裝HA/Col

為了監(jiān)測(cè)PUR—NH2膜表面層層自組裝HA/Col的過(guò)程，采用QCM進(jìn)行檢測(cè)。圖5是PURNH2膜表面自組裝HA/Col時(shí)金片振動(dòng)頻率(F)和耗散因子(D)隨時(shí)間的變化曲線圖。

圖5 金片F(xiàn)和D的變化曲線圖

從圖5可以看到，隨著HA溶液和Col溶液的通入，F(xiàn)不斷降低，而D則不斷增大。其原因就是由于HA和Col通過(guò)靜電作用吸附在金片上，從而使金片的質(zhì)量增大，相應(yīng)的振蕩頻率也就減小，而耗散因子則相應(yīng)地增大。由此說(shuō)明HA和Col沉積在PUR-NH2膜上。

2.4 AFM觀察PUR膜和PUR自組裝HA/Col膜的表面形貌

圖6是采用AFM掃描得到的PUR膜和PURNH2膜自組裝HA/Col的表面形貌圖。從圖6可以看到，單純的PUR膜表面相對(duì)比較光滑；而沉積了HA和Col的PUR-NH2膜，表面覆蓋了一層物質(zhì)，表面看起來(lái)比較粗燥，有比較多的小突起，大小在納米級(jí)，而這樣的一個(gè)表面納米結(jié)構(gòu)應(yīng)該有利于細(xì)胞的粘附，從而改善材料的生物相容性。文獻(xiàn)[20]報(bào)道了用濃NaOH溶液處理PLGA工程支架，使支架表面形成粗糙的納米結(jié)構(gòu)，用這樣的支架培養(yǎng)細(xì)胞，能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。因此，通過(guò)在PUR材料表面自組裝上HA和Col，從表面形貌上可以得到這樣的一個(gè)納米表面結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到改善材料的生物相容性。

圖6 PUR膜和PUR-NH2膜自組裝HA/Col表面形貌圖

3 結(jié)論

以功能PUR為基體，在1，3-二氨基丙烷的作用下，在PUR材料的表面引入—NH2，然后在材料的表面通過(guò)靜電作用機(jī)制層層自組裝上HA和Col。茚三酮分析法測(cè)試結(jié)果表面PUR膜成功接枝上了—NH2。QCM和AFM測(cè)試結(jié)果表明HA和Col組裝在PUR—NH2膜的表面。沉積在PUR—NH2膜上的HA和Col，使材料的親水性能得到改善，同時(shí)在材料表面形成一個(gè)粗糙的納米形貌結(jié)構(gòu)。通過(guò)這樣的表面仿生修飾，將有利于細(xì)胞的粘附及促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，為該P(yáng)UR材料應(yīng)用于組織支架奠定基礎(chǔ)。