細葉韭花醇提物體外抗氧化及對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

李美萍，侯健，劉燕，尉立剛，郭彩霞

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

細葉韭花作為北方地區(qū)傳統(tǒng)的調(diào)味品，經(jīng)油炸后呈現(xiàn)濃郁香味，且有多種含硫化合物[1-2]，有抗菌、預(yù)防動脈硬化和心血管疾病、抗過敏等功效[3]。細葉韭花中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸等[4]。隨著餐飲業(yè)的發(fā)展以及人們崇尚“自然”、講求天然的想法，目前，細葉韭花在中國北方餐飲業(yè)家喻戶曉，尤其獨特的風(fēng)味贏得了消費者的青睞。到目前為止，國內(nèi)對其物候?qū)W、生物學(xué)特性以及栽培技術(shù)的文獻報道相對較多，而對其風(fēng)味成分、提取物化學(xué)成分以及抑菌、抗氧化能力的研究則相對較少[5-9]。近年來，天然的抗氧化劑及降血糖藥物愈發(fā)受到人們的關(guān)注[10-13]。細葉韭花作為新型的藥食同源調(diào)味品，其醇提物的抗氧化及降血糖作用研究并未見報道。在前期研究工作的基礎(chǔ)上，本實驗繼以乙醇為溶劑，用不同濃度的乙醇提取細葉韭花中有效成分，并對其抗氧化及降血糖實驗進行了研究，以期找到細葉韭花醇提物的最佳濃度，為利用細葉韭花天然的抗氧化性開發(fā)新產(chǎn)品、風(fēng)味復(fù)合調(diào)味品建立獨特的地方產(chǎn)品特色提供了數(shù)據(jù)上的支持與理論上的指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

細葉韭花：采自山西省朔州市；α-葡萄糖苷酶、PNPG：美國Sigma公司；阿卡波糖：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

UV-Probe 2550雙光束紫外光譜儀 日本島津公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀 Tecan公司。

2 實驗方法

2.1 細葉韭花醇提物的制備

參考文獻[9]，稱取一定量細葉韭花粉末，按1∶15的料液比加入不同濃度乙醇提取劑，置于250 mL具塞錐形瓶中，在40 ℃下恒溫浸提30 min，減壓抽濾得上清液，濾渣再次提取，合并所得濾液，蒸發(fā)濃縮得浸膏。用30%乙醇溶解上述浸膏即為本實驗所用的細葉韭花醇提液。

2.2 細葉韭花醇提物體外抗氧化作用

2.2.1 清除DPPH自由基能力

測定方法參照文獻[14-17]，稍作修改。準確稱取0.0015 g DPPH配制成0.1 mmol/L的標準試液，避光保存。分別移取上述不同乙醇濃度提取液2 mL于10 mL試管中，再加入2 mL DPPH溶液，避光放置30 min，于517 nm波長處測吸光度(Ai)。用Vc做陽性對照，每樣重復(fù)3次，取平均值。清除率按照公式(1)進行計算。

(1)

式中：Ai為提取液+DPPH的吸光度；Aj為乙醇+提取液的吸光度；A0為乙醇+DPPH的吸光度。

2.2.2 細葉韭花醇提物對ABTS自由基清除能力的測定

對ABTS自由基清除能力的測定參照文獻[14-18]，并適當修改。準確稱取0.0200 g ABTS于10 mL樣品瓶中，加入2.4 mmol/L的過硫酸鉀5.2 mL溶解，得到ABTS母液，避光12 h。準確移取ABTS母液1.6 mL，用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中，保存待用。分別在10 mL具塞試管中依次加入上述不同乙醇濃度提取液、ABTS溶液各2 mL，并用蒸餾水定容至刻度，避光保存30 min，在734 nm波長處測吸光度值。用Vc做陽性對照，每樣重復(fù)3次，取平均值。清除率按照公式(2)進行計算。

(2)

式中：Ai為提取液+ABTS的吸光度；A0為蒸餾水+ABTS的吸光度。

2.2.3 細葉韭花醇提物總還原力能力的測定

對總還原力能力的測定參照文獻[16]和文獻[19]，并稍作修改。取1 mL提取液于10 mL試管中，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2 mL、1%的鐵氰化鉀2 mL，混勻，于50 ℃恒溫水浴20 min，冷卻后加入10%的三氯乙酸2 mL，4000 r/min離心10 min。取離心后的上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水、0.1%的三氯化鐵0.4 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm下測其吸光度值。用Vc做陽性對照，每樣重復(fù) 3 次，取平均值。

2.3 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定參照文獻[17-20]，并適當修改。用0.1 mol/L pH 6.8磷酸鈉緩沖液配制1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L PNPG溶液。將600 μL 1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶、200 μL磷酸鈉緩沖液，以及各200 μL不同濃度樣品提取液(50，60，70 mg/mL)混勻，在37 ℃ 恒溫水浴10 min，再加入200 μL 1.0 mmol/L PNPG，恒溫反應(yīng)30 min，最后加入2 mL 0.5 mol/L的Na2CO3使反應(yīng)終止，于400 nm波長處測定吸光度。用阿卡波糖做陽性對照。抑制率按照公式(3)進行計算。

(3)

式中：A0為用磷酸緩沖溶液代替樣品的吸光度；Ai為加細葉韭花提取物的吸光度；Aj為用磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光度。

2.3.2 酶動力學(xué)的測定

對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)實驗參照文獻[17-20]的方法，稍作修改。酶濃度不變(1.0 U/mL)，設(shè)置6個底物PNPG濃度。樣品設(shè)置0，3 mg/mL兩個濃度，按上述2.3.1中的方法進行，在400 nm處測定吸光度，每隔5 min測一次。以底物濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標，以反應(yīng)速度的倒數(shù)(1/V)為縱坐標，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，確定樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

3 結(jié)果與討論

3.1 細葉韭花醇提物抗氧化

3.1.1 細葉韭花醇提物對DPPH自由基的清除作用

實驗考察了0.05，0.1，0.2，0.4 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力，并比較了不同濃度Vc與60%醇提物清除DPPH自由基能力，其清除率測定結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 細葉韭花醇提物對DPPH自由基清除率的測定Fig.1 Determination of DPPH free radical scavenging rates by ethanol extracts from Allium tenuissimum L. flowers

由圖1可知，不同的細葉韭花醇提取物在0.05～0.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除能力隨著提取物濃度的增大而增強。在測試濃度范圍內(nèi)，細葉韭花60%醇提物的抑制效果最好，0.4 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到83%。

圖2 Vc與60%醇提物對DPPH自由基清除率的測定Fig.2 Determination of DPPH free radical scavenging rates by Vc and 60% ethanol extract

由圖2可知，Vc對DPPH自由基的清除率優(yōu)于60%醇提物。當60%醇提物濃度增大到0.8 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率與0.1 mg/mL的Vc相當。

3.1.2 細葉韭花醇提物對ABTS自由基的清除作用

實驗考察了0.05，0.1，0.2，0.4 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力及不同濃度的Vc與60%醇提物對ABTS自由基清除能力的比較，其結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同提取物對ABTS自由基清除率的測定Fig.3 Determination of ABTS free radical scavenging rates by different extracts

圖4 Vc與60%醇提物對ABTS自由基清除率的測定Fig.4 Determination of ABTS free radical scavenging rates by Vc and 60% ethanol extract

由圖3可知，細葉韭花醇提物對ABTS自由基具有良好的清除能力，且隨著提取物濃度的增大其對ABTS自由基的清除能力越強，其中60%的細葉韭花醇提物對ABTS自由基的清除能力最強，在0.05～0.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率分別達到38.34%、49.55%、66.69%、78.57%。

由圖4可知，0.8 mg/mL 60%醇提液對ABTS自由基的清除能力與0.1 mg/mL的Vc能力相當。

3.1.3 細葉韭花醇提物總還原能力的測定

實驗考察了1，2，3，4 mg/mL的濃度梯度下乙醇提取物總還原力的測定及不同濃度的Vc與60%醇提物總還原力的比較，其結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 不同提取物對總還原力的測定Fig.5 Determination of total reducing ability of different extracts

圖6 Vc與60%醇提物對總還原力的測定Fig.6 Determination of total reducing ability of Vc and 60% ethanol extract

在2.2.3的條件下測定了不同提取物在不同濃度下的總還原能力，結(jié)果用吸光度值表示，吸光度值越大，其總還原能力越強。由圖5可知，隨著醇提物濃度的增加，其還原能力越強，且60%醇提物的還原能力最強。

由圖6可知，VC對總還原力的作用強于60%的醇提物，且它們均隨著濃度的升高對總還原力的作用增強。

3.2 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3.2.1 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

實驗考察了50，60，70 mg/mL濃度梯度下乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及不同濃度的阿卡波糖與60%醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的比較，其結(jié)果見圖7和圖8。

由圖7可知，當樣品質(zhì)量濃度為50～70 mg/mL時，細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯。當細葉韭花醇提物濃度為50 mg/mL時，最高抑制率可達55%。當細葉韭花醇提物濃度為70 mg/mL時，最高抑制率可達83%。

圖7 不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定Fig.7 Determination of different extracts on the inhibition rates of α-glucosidase

圖8 阿卡波糖與60%醇提物對α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

由圖8可知，阿卡波糖和60%的細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶均具有抑制效果且具有濃度依賴性，當醇提物濃度達40 mg/mL時，與6 mg/mL阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果相當，其半抑制率(IC50)分別為6.67 mg/mL(阿卡波糖)，45.95 mg/mL(60%醇提物)；IC50值表明，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制效果強于細葉韭花60%的醇提物。這可能是由于細葉韭花醇提物中主要的化學(xué)成分是紫云英苷，屬于黃酮類化合物，有研究表明黃酮類化合物的降血糖機制能促進胰島素的分泌；并且黃酮類化合物只有與其他活性組分協(xié)同作用，才能抑制α-葡萄糖苷酶的活性。因此，細葉韭花醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較阿卡波糖低，可能與提取物中其他活性成分的含量不同有關(guān)。

3.2.2 細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型

加入不同濃度的60%細葉韭花醇提物后，按照2.3.2方法繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，在未加入細葉韭花醇提物(0 mg/mL)的反應(yīng)中，所得曲線方程為y=139.89x+20.25，R2=0.995，同時計算得Vm=0.049，Km=0.069；在加入3 mg/mL細葉韭花醇提物的反應(yīng)中，得擬合曲線方程y=363.85x+147.17，R2=0.971，計算得Vm′=0.0068，Km′= 2.474。由此可見，加入低濃度細葉韭花醇提物抑制反應(yīng)后，Vm減小，α-葡萄糖苷酶的米氏常數(shù)Km增大，即低濃度細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶為反競爭性和非競爭性混合的抑制類型。另外，以抑制類型圖中的斜率對抑制劑濃度二次作圖，求得細葉韭花醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù) Ki=1.92。

圖9 不同濃度樣品與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk double reciprocal curves of α-glucosidase reaction with different concentration of samples

4 結(jié)論

本實驗對細葉韭花醇提取物體外抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制效果進行了研究。結(jié)果表明，細葉韭花醇提物能夠有效地清除DPPH和ABTS自由基，且有很強的總還原能力，并能很好地抑制α-葡萄糖苷酶，其中尤以60%乙醇提取物的效果最佳。同時，細葉韭花醇提物的抗氧化性與α-葡萄糖苷酶的抑制作用均呈濃度依賴性。前期實驗表明，60%乙醇提取物中主要成分為紫云英苷，其化學(xué)名為山奈酚-3-葡萄糖苷，具有黃酮類化合物的抗炎、抗氧化、抗菌等作用。所以，深入研究細葉韭花醇提取物的抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制效果對延緩衰老、預(yù)防糖尿病等方面具有重要意義。隨著未來食品技術(shù)、工藝的不斷提高，為地方企業(yè)開發(fā)復(fù)方調(diào)味品以滿足消費者日漸提升的烹飪需求提供一定的理論基礎(chǔ)，同時，細葉韭花提取物具有潛在的天然抗氧化性和抑菌作用，為其進一步應(yīng)用到菜肴保鮮和肉制品品質(zhì)延長均有一定的實驗依據(jù)，既可以實現(xiàn)地方獨特的產(chǎn)品特色，又可以實現(xiàn)產(chǎn)品由現(xiàn)在的單一向多元化轉(zhuǎn)變，對地方經(jīng)濟增長具有促進作用。