適合繡球?qū)僦参锏臒o菌播種技術(shù)改良

沈柏春，余磊，邱帥，孫麗娜，彭悠悠，魏建芬，高凱

(杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

繡球(Hydrangeamacrophylla)又名八仙花，為虎耳草科繡球?qū)僦参?，其花大色艷、品種繁多且花期長，是重要的園林綠化、盆花及干鮮切花資源。繡球?qū)儆?3個(gè)種，而中國就擁有53種，占所有資源的73%，是繡球?qū)俚馁Y源分布中心。其花色、花形、葉色和葉形等觀賞性狀及適應(yīng)性具有豐富的遺傳多樣性[1]，開發(fā)潛力大，但育種工作起步晚[1]，目前僅有9個(gè)品種獲得植物新品種權(quán)，新品種培育速度慢，商業(yè)化水平低。目前，歐美和日本已成為繡球?qū)僦参锏姆庇行?，已建立了完善的商業(yè)化育種體系，培育品種主要為大葉繡球(H.macrophylla)、喬木繡球(H.arborescens)、圓錐繡球(H.paniculata)和櫟葉繡球(H.quercifolia)等，形成魔幻、無盡夏和女士等系列品種[1-3]，其他種栽培品種少，開發(fā)利用程度較低。

通過高效的播種技術(shù)，能夠快速獲得大量具有豐富遺傳變異的后代，這是培育植物新品種的基礎(chǔ)。無菌播種是提高播種效率的常用技術(shù)。繡球?qū)俚墓麑?shí)為蒴果，含有大量微小種子，種子成熟時(shí)，仍為鮮嫩狀，含水量較高，從果實(shí)中分離難度大。對(duì)新鮮果實(shí)進(jìn)行表面滅菌，再分離出鮮種子進(jìn)行無菌播種，以此獲得的雜交種子數(shù)較少，且萌發(fā)率低，很難獲得較大規(guī)模的篩選群體[3-11]。此外，繡球的種皮極薄，易被滅菌劑滅活。Nesi等[4]研究表明，直接滅菌的種子，發(fā)芽率極低。

為提高繡球播種效率，本研究針對(duì)其果實(shí)和種子特點(diǎn)，改良常規(guī)無菌播種技術(shù)，降低了操作難度，提高了有效種子獲得率，能快速獲得大規(guī)模篩選群體，此法適用于繡球雜交和臘蓮繡球(H.strigosa)、柳葉繡球(H.stenophylla)、掛苦繡球(Hydrangeaxanthoneura)和中國繡球(H.chinensis)等野生資源的無菌播種，為繡球?qū)匐s交育種和野生資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以大葉繡球和喬木繡球種內(nèi)雜交果實(shí)及野外采集的繡球?qū)僖吧N果實(shí)為供試材料，人工授粉于2018年在杭州市園林綠化股份有限公司青山湖研發(fā)基地進(jìn)行。大葉繡球種內(nèi)雜交組合為帝沃力♀×塔貝♂、夢(mèng)幻藍(lán)♀×塔貝♂和塞布麗娜♀×塔貝♂，喬木繡球種內(nèi)雜交組合為貝拉安娜♀×粉色貝拉安娜♂和無敵貝拉安娜♀×粉色貝拉安娜♂，每個(gè)組合授粉500～600朵。選擇三四年生健壯無病蟲的容器苗作為母本，置于溫室中培養(yǎng)。5—6月進(jìn)行人工授粉?；ò虼笪垥r(shí)，采集花藥，去除雜質(zhì)，置于干燥器中，使用變色硅膠干燥劑進(jìn)行干燥；花藥干燥至散粉時(shí)，收集花粉于2 mL離心管中，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。在母本的花苞膨大微張時(shí)，剪去雄蕊，次日將花粉小心涂抹于柱頭。授粉后，保持溫室溫度20～28 ℃，每天早晚各澆水1次，施用A2緩釋肥20～50 g一次，每周噴施500倍濃度的50%多菌靈1次。授粉后120～150 d，果實(shí)膨大，逐漸成熟，當(dāng)萼片自然失水、變硬，果實(shí)未干燥時(shí)，采集果實(shí)保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

野生種果實(shí)于2018年8—9月在貴州雷公山自然保護(hù)區(qū)、梵凈山自然保護(hù)區(qū)、翁安縣和堯人國家森林公園等地采集，通過比對(duì)花、果、葉和莖等特征確定其種，并采集新鮮果實(shí)以冰袋保存，快遞至杭州市園林綠化股份有限公司青山湖研發(fā)基地進(jìn)行無菌播種。共采集圓錐繡球(H.paniculata)、臘蓮繡球、柳葉繡球(H.stenophylla)、掛苦繡球(H.xanthoneura)和中國繡球(H.chinensis)等5個(gè)繡球?qū)僖吧N的果實(shí)。

1.2 方法

采用4種方法進(jìn)行繡球無菌播種，其中，T1～T3為常規(guī)方法[3-7,9,12]，T4為改良無菌播種。T1是對(duì)種子進(jìn)行滅菌，將新鮮果實(shí)充分干燥后收集種子，將種子置于洗潔劑、10%次氯酸鈉混合液中磁力攪拌30 min，自來水沖洗1 h備用，在超凈工作臺(tái)上，將種子用75%乙醇浸泡10～15 s，再用0.1%升汞浸泡2～5 min，其間不斷搖動(dòng)，然后用無菌水沖洗5次，將種子均勻撒入萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。T2～T4是對(duì)新鮮果實(shí)進(jìn)行表面滅菌，果實(shí)的滅菌方法同T1，但0.1%升汞浸泡為25 min。果實(shí)滅菌后，改良無菌播種(T4)是將變色硅膠干燥劑、濾紙和培養(yǎng)皿進(jìn)行高溫滅菌，并將變色硅膠干燥劑放入烘箱中充分干燥，至變?yōu)樗{(lán)紫色后充分冷卻，平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度為培養(yǎng)皿高度的三分之一，并覆蓋濾紙；將滅菌后的果實(shí)晾干1 h，均勻平鋪于濾紙上，蓋上蓋子，用撕拉膜封口，放入干燥器中，干燥2～5 d，待果實(shí)充分干燥后，在超凈工作臺(tái)上將干燥后的果實(shí)取出，用無菌刀將果實(shí)頂部切開，用無菌鑷子輕柔的擠壓果實(shí)，將種子擠出，均勻撒入萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；T2是用無菌刀將果實(shí)縱切后放入萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；T3是在解剖鏡下用無菌刀切開果實(shí)，將種子小心挑出，放入萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

不同繡球種和雜交組合每種方法播種果實(shí)60顆，萌發(fā)培養(yǎng)基為B5基本培養(yǎng)基+0.7%卡拉膠+2.0%蔗糖，pH調(diào)至5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時(shí)間12 h/d，光強(qiáng)2 500 lx，播種后觀測統(tǒng)計(jì)不同播種方法的污染率、種子萌發(fā)情況和幼苗生長情況。種子萌發(fā)后，當(dāng)幼苗長至0.5 cm以上時(shí)，將其接入生根培養(yǎng)基MS+0.1～0.2 mg·L-1萘乙酸+0.7%卡拉膠+2.0%蔗糖，pH調(diào)至5.8。培養(yǎng)40～80 d后，幼苗主根發(fā)達(dá)，具有3～6個(gè)須根，當(dāng)75%幼苗高度達(dá)到5 cm以上時(shí)，將組培瓶苗置于溫室苗床上煉苗，進(jìn)行75%遮蔭。3～7 d后，用自來水洗凈幼苗殘留培養(yǎng)基，將根部插入基質(zhì)中，置于(25±2)℃全光照噴霧溫室中進(jìn)行煉苗，調(diào)整噴霧間隔時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，使相對(duì)濕度保持在80%～90%，每隔10 d噴灑500倍多菌靈溶液。培養(yǎng)35～60 d后，形成健壯的繡球?qū)嵣?。待幼苗高度長至3～6 cm時(shí)，移至口徑為150 cm的紅素盆中，種植于室外，夏季遮陰，進(jìn)行正常水分管理。10月移至1加侖容器中，繼續(xù)培養(yǎng)至開花年齡。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同無菌播種方法的污染率

如表1所示，T2的污染率最高，為32.4%～63.2%；其次為T1，為5.9%～17.8%；T3和T4的污染率最低，為2.7%～12.3%。滅菌方法和培養(yǎng)材料不同可能是污染率相差較大的原因。T1是對(duì)種子直接滅菌，考慮到升汞對(duì)種子的影響，升汞滅菌時(shí)間較短，僅為2～5 min，因此，污染率較高。T2～T4都是對(duì)果實(shí)外表皮進(jìn)行滅菌，雖然升汞滅菌時(shí)間達(dá)到25 min，但外表皮溝壑較多，無法充分滅菌，而果實(shí)內(nèi)部為相對(duì)無菌，因此，T2(帶外果皮播種)的污染率最高，T3和T4(果實(shí)內(nèi)部干凈種子播種)最低。此外，采用相同無菌播種方法，人工授粉的繡球雜交果實(shí)污染率遠(yuǎn)低于野生繡球果實(shí)，這可能是野外環(huán)境比溫室環(huán)境微生物較多造成。

2.2 不同無菌播種方法的萌發(fā)、生長和生根情況

大葉繡球種內(nèi)雜交、錐繡球、臘蓮繡球、柳葉繡球、掛苦繡球和中國繡球采用4種方法進(jìn)行無菌播種，種子都能萌發(fā)，但萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)率差異較大。如表1所示，T1的萌發(fā)時(shí)間最長，需要29.3～43.1 d，萌發(fā)率也最低，僅為0.03%～0.31%，表明升汞滅菌易損傷繡球種子，導(dǎo)致發(fā)芽率下降。T2萌發(fā)時(shí)間較短，但萌發(fā)率較低，僅切口處的種子能夠萌發(fā)，果實(shí)內(nèi)部的種子極少萌發(fā)。T3和T4萌發(fā)最快，10.2～17.6 d即可萌發(fā)，發(fā)芽率最高，最高可達(dá)95.6%。

表1 不同播種方法的萌發(fā)情況

從平均每顆果實(shí)萌發(fā)數(shù)來看，T4為最高，其次為T3，而T2和T1最少。雖然T1、T2和T4能獲得果實(shí)內(nèi)所有種子，但T1的滅菌方式對(duì)種子損傷大，T2僅有果實(shí)切開處種子能夠萌發(fā)，平均每顆果實(shí)萌發(fā)數(shù)較低；而T4僅對(duì)果實(shí)進(jìn)行表面滅菌，種子無損傷，干燥分離后的種子均勻播種于培養(yǎng)基上，充分吸收養(yǎng)分和水分，每顆果實(shí)萌發(fā)數(shù)高；T3雖然萌發(fā)率高，但種子分離難度高，損失較多，每顆果實(shí)萌發(fā)數(shù)較低。

喬木繡球種內(nèi)雜交果實(shí)采用T4進(jìn)行無菌播種，其種子無萌發(fā)。其他3種方法中，T1的萌發(fā)時(shí)間長，萌發(fā)率也最低；T2萌發(fā)時(shí)間短，萌發(fā)率低；T3萌發(fā)時(shí)間短，萌發(fā)率較高。3種方法平均每顆果實(shí)萌發(fā)數(shù)都較低。萌發(fā)后，4種無菌播種方法獲得的幼苗生長和生根情況無顯著差異，在30～50 d后都能正常生根，生根率在98%以上，且根系飽滿。但不同來源的幼苗差異較大，種內(nèi)雜交幼苗生長快，植株強(qiáng)健，30 d左右開始生根；野生種幼苗生長較慢，43 d左右開始生根。

2.3 煉苗移栽后生長情況及開花情況

經(jīng)過煉苗移栽后，4種無菌播種獲得的幼苗生長表現(xiàn)相似，但不同來源的幼苗差異較大。種內(nèi)雜交后代生根速度和生長速度都比野生種幼苗快。前者煉苗10 d左右開始有新根長出，后者煉苗15 d左右才開始有新根長出。煉苗45 d后，種內(nèi)雜交后代和野生種幼苗根系飽滿，但前者植株高于后者。

大葉繡球種和喬木繡球種內(nèi)雜交后代在2020年首次開花，開花率為43%和53%，在2021年全部開花。野生種中，圓錐繡球、臘蓮繡球、掛苦繡球和中國繡球在2020年首次開花，開花率為35%～47%，2021年全部開花。柳葉繡球生長較弱，未開花。

3 小結(jié)與討論

無菌播種技術(shù)是提高種子萌發(fā)率的重要手段，已成功應(yīng)用于繡球育種工作中。但繡球種子極小，分離困難，已報(bào)道的研究常采用解剖鏡下切開果實(shí)、挑出幼嫩種子的方法，效率極低，種子損失大，很難獲得大量的雜交后代[4,11]，本研究也出現(xiàn)相同問題。Nesi等[4]將收集的成熟種子進(jìn)行滅菌，以期解決無菌狀態(tài)下種子分離難的問題，但結(jié)果表明，對(duì)種子直接滅菌導(dǎo)致發(fā)芽率極低。陸乙卜等[12]采用相同的方法收集野生圓錐繡球成熟種子，滅菌后萌發(fā)率顯著降低，幼苗生長受到抑制。本研究中將種子滅菌后進(jìn)行培養(yǎng)，也出現(xiàn)種子損傷嚴(yán)重甚至褐化死亡的現(xiàn)象。Nesi等[4]將果實(shí)滅菌并切開進(jìn)行培養(yǎng)，僅切口處種子能夠萌發(fā)，果實(shí)內(nèi)部種子萌發(fā)少，本研究也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。

本研究依據(jù)繡球?qū)俟麑?shí)和種子特點(diǎn)，改良無菌播種技術(shù)，將滅菌后的果實(shí)在無菌環(huán)境中充分干燥，收集種子進(jìn)行培養(yǎng)，操作簡單、污染率低、種子損失小、萌發(fā)率高，能快速獲得大量的雜交后代，1～2 a達(dá)到開花年齡，可作為新品種培育的篩選群體，有效縮短繡球新品種選育周期，可應(yīng)用于繡球?qū)匐s交育種以及臘蓮繡球、柳葉繡球、掛苦繡球、圓錐繡球和中國繡球等野生資源的開發(fā)利用。