福建省稻瘟病菌對4種殺菌劑的敏感性分析

阮宏椿，石妞妞，田佩玉,，杜宜新，陳文樂，陳巧紅，陳鳳平，陳福如

(1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室，福建 福州 350013；2福建農(nóng)林大學(xué) 植物病理學(xué)系，福建 福州350002；3三明市植保植檢站，福建 三明365000)

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一，常年發(fā)生且廣泛分布于水稻種植地區(qū)，一旦發(fā)生可減產(chǎn)10%～20%，嚴重時減產(chǎn)可達40%～50%[1-2]。我國稻瘟病年發(fā)生面積在380萬hm2以上，減產(chǎn)達10億kg，對水稻生產(chǎn)造成很大損失[3]。目前，化學(xué)防治仍然是水稻稻瘟病的主要防治措施，常用殺菌劑包括甲氧基丙烯酸酯類(QoIs)，如吡唑醚菌酯[4-5]；黑色素合成抑制劑類(MBIs)，如三環(huán)唑[6]；14α-脫甲基酶抑制劑類(DMIs)，如丙環(huán)唑、戊唑醇[7-9]；苯并咪唑類(MBCs)，如多菌靈[10-11]等。

吡唑醚菌酯是QoIs類殺菌劑，廣泛應(yīng)用在各種農(nóng)作物和果樹上，已經(jīng)成為全球銷量最高的殺菌劑之一[12]，其殺菌譜廣，對絲核菌屬[13]、曲霉屬[14]、鐮刀菌屬[15]等引發(fā)的病害均有良好防效。研究表明，吡唑醚菌酯對稻瘟病具有明顯的保護和治療作用[4-5]，其微囊懸浮劑的研發(fā)成功解決了對水生生物毒性高的問題，已登記用于水稻病害防治[16-17]。吡唑醚菌酯對稻瘟病菌具有很高的毒力活性[4,18]，但因其作用位點單一，容易產(chǎn)生抗藥性，已報道芒果蒂腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)[19]、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)[20]等病原菌對吡唑醚菌酯產(chǎn)生了較高的抗藥性。戊唑醇和丙環(huán)唑是DMIs類殺菌劑，其殺菌譜廣，單劑或復(fù)配劑能有效防治稻瘟病、稻曲病、紋枯病等多種水稻病害[7-10]。研究表明，戊唑醇和丙環(huán)唑?qū)Φ疚辆哂休^好毒力活性[7,21]，但長期使用已導(dǎo)致油茶炭疽病菌(Colletotrichumfructicola)[22]、草坪幣斑病菌(Sclerotiniahomoeocarpa)[23]等病原菌產(chǎn)生抗藥性。多菌靈屬于MBCs類殺菌劑，常用來防治稻瘟病、惡苗病、紋枯病等多種水稻病害[10-11,24]。隨著多菌靈的大量使用，其抗藥性問題已經(jīng)比較嚴重[25-26]。水稻稻瘟病在福建省常年發(fā)生，防治稻瘟病的施藥頻率較高。目前關(guān)于福建省稻瘟病菌對吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈的敏感性尚不清楚。為此，本研究采用菌絲生長速率法[27]測定了稻瘟病菌對吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈的敏感性，并分析稻瘟病菌對4種殺菌劑敏感性的相關(guān)性，旨在為稻瘟病菌的抗藥性監(jiān)測及防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 2017-2019年從福建將樂、沙縣、寧化、建陽、南靖、上杭水稻品種抗性鑒定圃未施用過吡唑醚菌酯的田塊采集水稻穗頸瘟標本，采用單孢分離法進行病原菌分離，根據(jù)形態(tài)學(xué)進行病原菌鑒定和致病性測定，獲得稻瘟病菌116株，4 ℃斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試培養(yǎng)基 可溶性淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g、酵母膏2 g、CaCO33 g、瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

1.1.3 供試藥劑 98%吡唑醚菌酯(pyrazoxystrobin)、96%多菌靈(carbendazim)，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；98%戊唑醇(tebuconazole)，江蘇豐登農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)；98%丙環(huán)唑(propiconazole)，沈陽化工研究院生產(chǎn)。將吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙環(huán)唑用二甲基亞砜溶解，多菌靈用0.10 mol/L鹽酸溶解，以上殺菌劑均配成質(zhì)量濃度為1×104μg/mL母液，存放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?9%水楊肟酸(Salicylohydroxamic，SHAM)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司生產(chǎn)，將其用二甲基亞砜溶解，配成質(zhì)量濃度為1×105μg/mL母液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 稻瘟病菌對4種殺菌劑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[27]，測定分離獲得的116株稻瘟病菌對4種殺菌劑的敏感性。將供試菌株接種到可溶性淀粉培養(yǎng)基上進行活化，28 ℃培養(yǎng)7 d，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將菌餅菌絲面朝下接種到含有不同質(zhì)量濃度殺菌劑的可溶性淀粉平板上，其中吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度為0.000 1，0.000 5，0.001，0.005和0.01 μg/mL，為防止旁路氧化，培養(yǎng)基中均含有質(zhì)量濃度100 μg/mL水楊肟酸[19,28]；戊唑醇質(zhì)量濃度為0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 μg/mL；丙環(huán)唑質(zhì)量濃度為0.05，0.10，0.50，1.00和5.00 μg/mL；以加入等體積二甲基亞砜的平板作為對照。多菌靈質(zhì)量濃度為0.05，0.08，0.10，0.60和1.00 μg/mL，以加入等體積0.10 mol/L鹽酸的平板作為對照。將接菌后的平板置于28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，之后采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，每處理重復(fù)3次。

計算殺菌劑各質(zhì)量濃度處理下菌絲生長的抑制率[29]。抑制率=(對照菌落直徑-殺菌劑菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。以殺菌劑質(zhì)量濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(x)，菌絲生長抑制率的幾率值為縱坐標(y)，進行回歸分析，求出4種殺菌劑對各供試菌株的有效抑制中濃度(EC50)值。比較分析福建省6個地區(qū)水稻稻瘟病菌群體對吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈的敏感性差異，計算不同地區(qū)菌株個體間的變異系數(shù)[30-31]。變異系數(shù)=EC50最大值/EC50最小值。

1.2.2 稻瘟病菌對4種殺菌劑敏感基線的建立 將各殺菌劑對供試稻瘟病菌的EC50值等分成幾個區(qū)間，通過統(tǒng)計每個區(qū)間的菌株數(shù)和頻率，利用等差間距法建立稻瘟病菌對其的敏感性頻率分布圖，采用Shapiro-Wilk法進行供試菌株對各殺菌劑敏感性頻率分布的正態(tài)性檢驗，若符合正態(tài)分布，將該殺菌劑對供試菌株的EC50平均值，作為福建省稻瘟病菌對該殺菌劑的敏感基線[32-33]。

1.2.3 吡唑醚菌酯與戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈對稻瘟病菌毒力的相關(guān)性 采用菌絲生長速率法，根據(jù)吡唑醚菌酯對稻瘟病菌的EC50，從116株病菌中選取具有代表性的30株病菌，其中EC50最大一端的菌株15株， EC50最小一端的菌株15株，測定其對戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈的敏感性。將吡唑醚菌酯對菌株EC50的常用對數(shù)值作為x軸，戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈對菌株EC50的常用對數(shù)值作為y軸，進行線性回歸分析，得到線性回歸方程y=bx+a，根據(jù)決定系數(shù)(R2)、b值及F檢驗的顯著水平(P值)，分析吡唑醚菌酯與戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈對稻瘟病菌毒力之間的關(guān)系：若P<0.05，F(xiàn)檢驗在P=0.05水平上差異顯著，說明2種殺菌劑間相關(guān)性顯著；若P>0.05，F(xiàn)檢驗在P=0.05水平上差異不顯著，說明2種殺菌劑間相關(guān)性不顯著。若b值為正，說明2種殺菌劑間存在正相關(guān)性；若b值為負，說明2種殺菌劑間存在負相關(guān)性。若R2>0.8，說明2種殺菌劑間有較好的相關(guān)性[34]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2011計算抑制菌絲生長的毒力回歸方程和EC50，建立稻瘟病菌對供試殺菌劑的敏感性頻率分布圖；采用Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性分析；采用IBM SPSS V21.0軟件進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌對4種殺菌劑的敏感性

由表1可知，吡唑醚菌酯對116株水稻稻瘟病菌的EC50值為0.001 2～0.012 8 μg/mL，EC50最大值是最小值的10.67倍，EC50平均值為0.004 7 μg/mL；戊唑醇對水稻稻瘟病菌的EC50值為0.209 8～0.632 3 μg/mL，EC50最大值是最小值的3.01倍，EC50平均值為0.361 9 μg/mL；丙環(huán)唑?qū)λ镜疚敛【腅C50值為0.196 8～2.273 0 μg/mL，EC50最大值是最小值的11.55倍，EC50平均值為 0.812 4 μg/mL；多菌靈對水稻稻瘟病菌的EC50值為0.217 6～0.616 1 μg/mL，EC50最大值是最小值的2.83倍，EC50平均值為 0.427 9 μg/mL。供試4種殺菌劑中，吡唑醚菌酯的EC50平均值最小，其次 為戊唑醇、多菌靈和丙環(huán)唑，表明稻瘟病菌對吡唑醚菌酯最敏感，其次為戊唑醇、多菌靈和丙環(huán)唑。

表1 福建不同稻區(qū)稻瘟病菌對4種殺菌劑的敏感性Table 1 Sensitivity of Magnaporthe oryzae to 4 fungicides in different areas in Fujian

2.2 稻瘟病菌對4種殺菌劑的敏感性差異與敏感基線

2.2.1 吡唑醚菌酯 由表1可知，吡唑醚菌酯對將樂、沙縣、寧化、建陽、南靖和上杭6個地區(qū)稻瘟病菌菌株EC50平均值分別為0.004 9，0.005 7，0.004 1，0.004 5，0.005 0和0.004 5 μg/mL，敏感性差異為1.39倍；寧化地區(qū)稻瘟病菌菌株對吡唑醚菌酯最敏感，沙縣地區(qū)稻瘟病菌菌株對吡唑醚菌酯最不敏感，二者差異顯著；同一地區(qū)稻瘟病菌菌株間對吡唑醚菌酯的敏感性存在差異，6個地區(qū)菌株間的變異系數(shù)為2.85～8.58。

由圖1可知，116株稻瘟病菌對吡唑醚菌酯的敏感性頻率分布為連續(xù)性單峰曲線，未出現(xiàn)敏感性下降的亞群體；Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，當顯著性水平為95%時，偏度(skew)=1.197，峰度(kurt)=2.538，W=0.934，P=0.000(P<0.05)，符合連續(xù)的偏正態(tài)分布。因此，可將EC50平均值0.004 7 μg/mL作為福建省稻瘟病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線。

2.2.2 戊唑醇 由表1可知，戊唑醇對將樂、沙縣、寧化、建陽、南靖和上杭6個地區(qū)稻瘟病菌菌株EC50平均值分別為0.377 9，0.329 8，0.313 5，0.363 3，0.408 7和0.353 9 μg/mL，敏感性差異為1.30倍；寧化地區(qū)稻瘟病菌菌株對戊唑醇最敏感，南靖地區(qū)稻瘟病菌菌株對戊唑醇最不敏感，二者差異極顯著；同一地區(qū)稻瘟病菌菌株間對戊唑醇的敏感性差異較小，6個地區(qū)菌株間的變異系數(shù)均低于3。

由圖2可知，116株稻瘟病菌對戊唑醇的敏感性頻率分布為連續(xù)性單峰曲線，未出現(xiàn)敏感性下降的亞群體；Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，當顯著性水平為95%時，偏度(skew)=0.609，峰度(kurt)=0.097，W=0.968，P=0.007(P<0.05)，符合連續(xù)的偏正態(tài)分布。因此，可將EC50平均值0.361 9 μg/mL作為福建省稻瘟病菌對戊唑醇的敏感基線。

2.2.3 丙環(huán)唑 由表1可知，丙環(huán)唑?qū)?、沙縣、寧化、建陽、南靖和上杭6個地區(qū)稻瘟病菌菌株EC50平均值分別為0.710 0，1.079 3，0.750 4，0.775 2，1.004 7和0.736 7 μg/mL，敏感性差異為1.52倍；將樂地區(qū)稻瘟病菌菌株對丙環(huán)唑最敏感，沙縣地區(qū)菌株對丙環(huán)唑最不敏感，二者差異顯著；同一地區(qū)稻瘟病菌菌株間對丙環(huán)唑的敏感性存在明顯差異，6個地區(qū)菌株間的變異系數(shù)為4.19～7.24。

由圖3可知，116株稻瘟病菌對丙環(huán)唑的敏感性頻率分布為連續(xù)性單峰曲線，未出現(xiàn)敏感性下降的亞群體；Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，當顯著性水平為95%時，偏度(skew)=1.101，峰度(kurt)=1.345，W=0.924，P=0.000(P<0.05)，符合連續(xù)的偏正態(tài)分布。因此，可將EC50平均值0.812 4 μg/mL作為福建省稻瘟病菌對丙環(huán)唑的敏感基線。

2.2.4 多菌靈 由表1可知，多菌靈對將樂、沙縣、寧化、建陽、南靖和上杭6個地區(qū)稻瘟病菌菌株EC50平均值分別為0.375 0，0.455 1，0.401 5，0.424 3,0.513 1和0.419 1 μg/mL，敏感性差異為1.37倍；將樂地區(qū)稻瘟病菌菌株對多菌靈最敏感，南靖地區(qū)菌株對多菌靈最不敏感，二者差異極顯著；同一地區(qū)稻瘟病菌菌株間對多菌靈的敏感性差異較小，6個地區(qū)菌株間的變異系數(shù)均低于3。

由圖4可知，116株稻瘟病菌對多菌靈的敏感性頻率分布為連續(xù)性單峰曲線，未出現(xiàn)敏感性下降的亞群體；Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示，當顯著性水平為95%時，偏度(skew)=-0.164，峰度(kurt)=0.703，W=0.982，P=0.122(P>0.05)，符合正態(tài)分布。因此，可將EC50平均值0.427 9 μg/mL作為福建省稻瘟病菌對多菌靈的敏感基線。

2.3 吡唑醚菌酯與戊唑醇、丙環(huán)唑、多菌靈對稻瘟病菌毒力的相關(guān)性

圖5顯示，吡唑醚菌酯與戊唑醇對稻瘟病菌的線性回歸方程為y=0.033 7x―0.361 8，P=0.079 4(P>0.05),可知F檢驗在P=0.05水平上差異不顯著；b值為正，但決定系數(shù)(R2)為0.006 3，小于0.8，說明稻瘟病菌對吡唑醚菌酯與其對戊唑醇的敏感性間無相關(guān)性。

圖5顯示，吡唑醚菌酯與丙環(huán)唑?qū)Φ疚敛【木€性回歸方程為y=0.402 7x+0.797 1，P=0.501 0(P>0.05)，可知F檢驗在P=0.05水平上差異不顯著；b值為正，但決定系數(shù)(R2)為0.251 0，小于0.8，說明稻瘟病菌對吡唑醚菌酯與其對丙環(huán)唑的敏感性間無相關(guān)性。

圖6顯示，吡唑醚菌酯與多菌靈對稻瘟病菌的線性回歸方程為y=-0.003 8x-0.374 7，P=0.014 6(P<0.05),可知F檢驗在P=0.05水平上差異顯著；b值為負，但決定系數(shù)(R2)為0.000 2，小于0.8，說明稻瘟病菌對吡唑醚菌酯與其對多菌靈的敏感性間不相關(guān)。

綜上所述，稻瘟病菌對吡唑醚菌酯及其對戊唑醇、丙環(huán)唑、多菌靈的敏感性之間不存在明顯的相關(guān)性。

3 討 論

監(jiān)測水稻病原菌對殺菌劑的敏感性，有助于優(yōu)化殺菌劑的使用策略[26]。吡唑醚菌酯是QoI類內(nèi)吸性殺菌劑，具有低毒、高效、廣譜及對非靶標生物安全的優(yōu)點，2017年登記用于防治稻瘟病，具有很高活性，防治效果達98.53%[18,35]。研究表明，吡唑醚菌酯對川渝地區(qū)稻瘟病菌的EC50值為0.003 13～0.024 48 μg/mL，EC50平均值為0.009 17 μg/mL[4]；吡唑醚菌酯對長江中下游地區(qū)稻瘟病菌的EC50值為0.003～0.027 μg/mL，EC50平均值為0.012 μg/mL[18]。本研究結(jié)果表明，吡唑醚菌酯對福建省稻瘟病菌的EC50值為0.001 2～0.012 8 μg/mL，EC50平均值為0.004 7 μg/mL，低于川渝和長江中下游地區(qū)[4,18],可知福建省稻瘟病菌對吡唑醚菌酯比較敏感；且敏感性頻率分布為連續(xù)性單峰曲線，符合連續(xù)的偏正態(tài)分布。本研究中的供試菌株均來源于未施用過吡唑醚菌酯的稻田，因此，可將EC50平均值0.004 7 μg/mL作為福建省水稻稻瘟病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線。目前，雖未見稻瘟病菌對吡唑醚菌酯田間抗性的報道，但吡唑醚菌酯作用位點單一，頻繁使用易產(chǎn)生抗藥性。已有多種病原菌對吡唑醚菌酯產(chǎn)生了抗藥性，賀瑞等[19]研究發(fā)現(xiàn)，海南省芒果蒂腐病菌對吡唑醚菌酯普遍產(chǎn)生了抗藥性，抗藥性最高菌株的EC50值是最敏感菌株的488倍；肖婷等[20]研究發(fā)現(xiàn)，江蘇丘陵地區(qū)田間草莓灰霉病菌對吡唑醚菌酯產(chǎn)生高水平抗藥性。由此可知，作為防治水稻稻瘟病的主要殺菌劑，吡唑醚菌酯存在較大的抗性風(fēng)險，建議將吡唑醚菌酯與不同作用機理的殺菌劑輪換使用，以避免或減緩稻瘟病菌對其抗藥性的產(chǎn)生。

戊唑醇和丙環(huán)唑均屬于DMIs類殺菌劑。魏松紅等[36]研究報道，遼寧稻瘟病菌對戊唑醇的敏感基線為0.383 3 μg/mL；鮮菲[21]研究表明，西南地區(qū)稻瘟病菌對戊唑醇的敏感基線為0.215 4 μg/mL；趙琪君等[7]研究表明，湖北、貴州稻瘟病菌對丙環(huán)唑的敏感基線為3.99 μg/mL。本研究結(jié)果表明，戊唑醇對供試稻瘟病菌的EC50平均值為0.361 9 μg/mL，丙環(huán)唑?qū)┰嚨疚敛【腅C50平均值為0.812 4 μg/mL，表明福建省稻瘟病菌對戊唑醇、丙環(huán)唑仍比較敏感。

多菌靈屬于苯并咪唑類殺菌劑，具有廣譜、低毒的優(yōu)點[37]。方敏彥[38]研究表明，多菌靈對稻瘟病菌的EC50值為0.137～0.314 μg/mL。本研究結(jié)果表明，多菌靈對供試稻瘟病菌的EC50平均值為0.427 9 μg/mL，表明福建省稻瘟病菌對多菌靈仍比較敏感。已有報道表明，稻瘟病菌和油茶炭疽病菌[22]、小麥赤霉病菌[39]等病原菌對戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈出現(xiàn)了抗藥性。鮮菲[21]發(fā)現(xiàn)，重慶涪陵和四川宣漢出現(xiàn)低抗水平的稻瘟病菌；趙琪君等[7]發(fā)現(xiàn)，湖北、貴州稻瘟病菌對丙環(huán)唑已經(jīng)出現(xiàn)敏感性下降的亞群體；李河等[22]分離到6株對多菌靈和戊唑醇均產(chǎn)生了抗性的油茶炭疽菌；王建秀等[39]在小麥產(chǎn)區(qū)已經(jīng)監(jiān)測到對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的禾谷鐮刀菌菌株；周華飛等[40]發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)小麥赤霉病菌對多菌靈的抗性頻率為26.3%～54.5%。因此，福建省稻瘟病菌對戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈雖未產(chǎn)生敏感性下降的抗藥性亞群體，但戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈具有一定的抗藥性風(fēng)險，應(yīng)注意不同作用機理殺菌劑的輪換或混配使用。

不同作用機理的殺菌劑混配或輪換使用可以降低或延緩抗藥性的出現(xiàn)[32,41]。本研究結(jié)果表明，吡唑醚菌酯、戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈對稻瘟病菌均具有較高的毒力，其對稻瘟病菌菌絲生長的抑制活性依次表現(xiàn)為吡唑醚菌酯>戊唑醇>多菌靈>丙環(huán)唑，且稻瘟病菌對吡唑醚菌酯與戊唑醇、丙環(huán)唑、多菌靈的敏感性間不存在明顯的相關(guān)性。Miao等[42]研究表明，QoI類殺菌劑肟菌酯對水稻稻瘟病菌具有較高的毒力，與吡唑醚菌酯存在交互抗性，與多菌靈、稻瘟靈、百菌清、咪鮮胺等不存在交互抗性。因此，可以選用吡唑醚菌酯作為主要殺菌劑防治水稻稻瘟病，并與戊唑醇、丙環(huán)唑和多菌靈等不同作用機理的殺菌劑混配或輪換使用。