T2值定量評(píng)估不同肝纖維化分期大鼠肝臟鐵沉積

金明麗，潘志華，蔣 穎，趙 琪

(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 核工業(yè)四一六醫(yī)院放射科，四川 成都 610031)

肝纖維化是慢性肝臟疾病進(jìn)展為不可逆性肝硬化、肝功能衰竭甚至肝細(xì)胞癌的必經(jīng)病理階段[1],常伴不同程度鐵沉積而加速病情進(jìn)展。肝臟穿刺活檢是評(píng)估肝臟鐵含量的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在取樣誤差及感染等風(fēng)險(xiǎn)；血清鐵、鐵蛋白等可在一定程度上反映鐵沉積，但無法直接定量肝臟鐵含量，且受全身代謝狀況影響[2]。MR T2 mapping是評(píng)估鐵含量的無創(chuàng)性方法之一，其參數(shù)T2弛豫時(shí)間(T2值)及T2弛豫率(R2值)廣泛用于定量評(píng)估腦、脾、肝及心臟鐵含量[3]。本研究觀察T2值評(píng)估不同纖維化分期大鼠肝臟鐵沉積的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠肝纖維化模型 60只2～3月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(202.0±3.2)g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證SCXK(川)2013-17，使用許可證為SCXK(川)2013-181]，常規(guī)飼養(yǎng)。分別于其腹腔及后腿內(nèi)側(cè)皮下注射濃度40%的四氯化碳食用調(diào)和油懸濁液0.3 ml/100 g體質(zhì)量，每周每處注射2次，共注射12周，建立大鼠肝纖維化模型。本研究經(jīng)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與方法 采用Philips MR Achieva 3.0T超導(dǎo)MR儀，配備16通道腕關(guān)節(jié)線圈。于造模第5～12周，每周選取1～6只體質(zhì)量偏輕、毛色較枯黃、精神萎靡的大鼠行上腹部掃描。于后腿內(nèi)側(cè)皮下注射2%戊巴比妥鈉0.2 ml/100 g體質(zhì)量麻醉大鼠，自膈頂至雙腎下緣水平進(jìn)行T2 mapping掃描，采用多回波梯度-自旋回波(multi-echo gradient and spin echo, M-GRASE)序列，回波數(shù)4，TE117 ms，TE234 ms，TE351 ms，TE468 ms，TR 1 552 ms，層厚2.5 mm，層間距1 mm，矩陣240×240。

將圖像傳導(dǎo)至Philips后處理工作站(Extended MR WorkSpace 2.6.3.4)，系統(tǒng)自動(dòng)重建T2 mapping圖像。由2名具有5年MR診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師于原始圖像(TE為17 ms，圖1A)顯示肝臟較大層面避開偽影、膽管、大血管、局灶性肝臟損傷部位等放置3個(gè)面積10 mm2的圓形ROI[4]，并將ROI復(fù)制到T2 mapping中的相同區(qū)域(圖1B)，測(cè)量其T2值；以2名醫(yī)師對(duì)3個(gè)ROI的測(cè)量結(jié)果的均值為最終結(jié)果。

1.3 病理檢查 掃描結(jié)束后處死大鼠，取肝臟組織送病理科行Masson、普魯士藍(lán)及HE染色。由2名具有8年病理診斷經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估肝纖維化S分期、鐵質(zhì)及脂肪病理分級(jí)。肝臟纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)：S0期無纖維化；S1期匯管區(qū)擴(kuò)大、纖維化；S2期匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)存在；S3期纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4期即早期肝硬化。肝臟脂肪分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)<5%肝細(xì)胞受累；1級(jí)5%～33%肝細(xì)胞受累；2級(jí)34%～66%肝細(xì)胞受累；3級(jí)>66%肝細(xì)胞受累。肝臟鐵質(zhì)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)無鐵顆粒；1級(jí)僅極少數(shù)肝細(xì)胞中可見鐵顆粒；2級(jí)指5%～10%肝細(xì)胞中可見鐵顆粒；3級(jí)為≥40%肝細(xì)胞可見鐵顆粒；4級(jí)為大多數(shù)肝細(xì)胞中見豐富鐵顆粒[5-7]。意見不一致時(shí)，提請(qǐng)上級(jí)醫(yī)師復(fù)核并裁定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩兩比較采用Nemenyi法。采用Spearman相關(guān)分析觀察大鼠鐵質(zhì)病理分級(jí)與T2值的相關(guān)性，以Kendall相關(guān)系數(shù)(tau-b)分析肝臟鐵質(zhì)病理分級(jí)與纖維化S分期間的相關(guān)性。繪制T2值診斷肝臟鐵質(zhì)病理分級(jí)的受試者工作特征(receiver operating characteristic， ROC)曲線，計(jì)算曲線下面積(area under the curve, AUC)。采用雙因素方差分析評(píng)估脂肪、鐵質(zhì)病理分級(jí)、肝纖維化分期對(duì)T2值的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 實(shí)驗(yàn)過程中20只大鼠死亡，共40只大鼠納入研究；其中肝臟纖維化S0期6只、S1期6只、S2期8只、S3期10只、S4期10只(圖2)，鐵質(zhì)病理分級(jí)0級(jí)7只、 1級(jí)9只、2級(jí)12只、3級(jí)10只、4級(jí)2只(圖3)，脂肪病理分級(jí)0級(jí)5只、1級(jí)8只、2級(jí)12只、3級(jí)15只。因鐵質(zhì)病理分級(jí)4級(jí)樣本量較少，將3級(jí)與4級(jí)合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2 相關(guān)性分析 肝纖維化分期與肝臟鐵質(zhì)病理分級(jí)呈正相關(guān)(tau-b=0.851，P<0.001)，鐵質(zhì)病理分級(jí)與T2值呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.803，P<0.001)。

2.3 不同鐵質(zhì)病理分級(jí)T2值比較 鐵質(zhì)病理分級(jí)0級(jí)大鼠肝臟T2值為59.10(60.70,57.80)ms,1級(jí)為56.50(57.25,52.05)ms，2級(jí)為53.95(56.02, 49.75)ms，≥3級(jí)為45.85(48.88,34.93)ms，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.367，P<0.001)；兩兩比較,鐵質(zhì)病理0級(jí)與1級(jí)、1級(jí)與2級(jí)肝臟T2值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，其余各鐵質(zhì)病理分級(jí)間T2值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4 ROC曲線分析 T2值鑒別肝纖維化分期大鼠肝臟有無鐵沉積及鐵質(zhì)病理分級(jí)≥3級(jí)的AUC分別為0.97、0.94，見表1。

表1 T2值診斷肝纖維化大鼠鐵質(zhì)病理分級(jí)的效能(n=40)

2.5 雙因素方差分析 對(duì)肝臟T2值行正態(tài)轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步雙因素方差分析結(jié)果顯示，不同脂肪病理分級(jí)肝臟T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.37，P>0.05)，而不同鐵質(zhì)病理分級(jí)間肝臟T2值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.10，P<0.05)，不同肝纖維化分期肝臟T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.14，P>0.05)；三者交互作用對(duì)肝臟T2值無明顯影響(F=1.43，P>0.05)。

3 討論

肝纖維化常見于病毒性肝炎、酒精性及非酒精性肝病、血色素沉著癥等急、慢性肝損傷，常伴不同程度鐵和脂肪沉積，加速芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧，嚴(yán)重破壞細(xì)胞和組織，導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展為肝硬化，發(fā)生門靜脈高壓等并發(fā)癥，甚至肝細(xì)胞癌。準(zhǔn)確評(píng)估鐵沉積對(duì)治療肝纖維化及評(píng)估預(yù)后十分重要[8]。既往研究[9]顯示，以四氯化碳灌胃建立肝纖維化小鼠模型過程中，隨造模時(shí)間延長，小鼠肝纖維化程度逐漸增加，并存在不同程度脂肪及鐵沉積，且鐵沉積隨纖維化程度加重而增加。江遠(yuǎn)等[10]發(fā)現(xiàn)正常大鼠存在輕度肝鐵沉積；隨著肝纖維化加重，肝臟庫普弗細(xì)胞及活化肝星狀細(xì)胞鐵沉積增多，且存在不同程度脂肪沉積及炎癥細(xì)胞浸潤。本研究結(jié)果與上述研究相符。

MRI是量化肝鐵沉積的無創(chuàng)性檢查方法，有助于指導(dǎo)臨床治療肝纖維化。鐵為超順磁性物質(zhì)，影響組織的易感性，使B0場(chǎng)不均勻，增加蛋白質(zhì)結(jié)合水的磁化率，致組織T2和T2*弛豫時(shí)間縮短，組織信號(hào)強(qiáng)度減低， R2及R2*值增加。T2 mapping對(duì)靜磁場(chǎng)不均勻較不敏感，圖像信噪比高于T2*mapping。目前常用組織T2及R2值評(píng)估肝臟鐵含量。既往研究[11-12]證實(shí)，組織R2與肝臟鐵含量呈顯著相關(guān)；肝鐵正常及鐵過載患者中，R2值與肝臟穿刺活檢鐵含量呈線性相關(guān)(r=0.89)[13-14]，提示其診斷鐵過載的效能相近，且R2值評(píng)估肝臟鐵沉積的重復(fù)性及準(zhǔn)確性較好。KRISTANEEPAILBOON等[15]應(yīng)用1.5T及3.0T MR儀測(cè)量20名健康者及42例肝鐵沉積患者的T2及T2*值，發(fā)現(xiàn)肝臟T2值(3.0T)及T2*值(1.5T)均能較好評(píng)估肝臟鐵質(zhì)病理分級(jí)，提示其可作為穿刺活檢的替代方法。FRANCA等[16]應(yīng)用3.0T MR多回波化學(xué)位移編碼序列圖像研究101例彌漫性肝病患者，發(fā)現(xiàn)肝臟R2*值隨鐵質(zhì)病理分級(jí)增高而增加,其鑒別0級(jí)與1～4級(jí)鐵質(zhì)病理分級(jí)的AUC為0.848[95%CI(0.776,0.919)]，鑒別0～2級(jí)與3～4級(jí)鐵質(zhì)病理分級(jí)的AUC為0.976[(95%CI(0.949,1.000)]，且R2*值評(píng)估鐵含量不受肝纖維化及脂肪沉積的影響。

本研究結(jié)果證實(shí)T2值與肝臟鐵質(zhì)病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，T2值可用于評(píng)估肝纖維化大鼠肝臟鐵沉積，且不受肝脂肪病理分級(jí)、纖維化分期的影響，其鑒別肝纖維化大鼠肝臟有無鐵沉積、肝臟鐵質(zhì)病理分級(jí)≥3級(jí)的效能較好；0級(jí)與1級(jí)、1級(jí)與2級(jí)鐵質(zhì)病理分級(jí)大鼠肝臟T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析可能原因，T2值通過弛豫時(shí)間反映組織內(nèi)鐵含量變化，而肝臟弛豫時(shí)間受鐵濃度、鐵顆粒分布及大小的影響，肝纖維化及脂肪沉積均可導(dǎo)致肝臟弛豫時(shí)間增加[17-18]，部分抵消鐵沉積T2弛豫時(shí)間的減少，且肝臟炎癥和纖維化會(huì)限制水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，降低T2值對(duì)鐵的敏感性。本研究早期肝纖維化大鼠鐵沉積較少且不均勻，存在嚴(yán)重脂肪沉積，導(dǎo)致0級(jí)與1級(jí)、1級(jí)與2級(jí)鐵質(zhì)病理分級(jí)T2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨纖維化進(jìn)展，肝臟細(xì)胞水腫及脂肪變性減輕，肝臟鐵沉積增加，S3、S4期肝細(xì)胞鐵沉積明顯，肝臟T2弛豫時(shí)間明顯縮短。

綜上，T2值對(duì)定量評(píng)估肝纖維化大鼠模型肝臟鐵沉積具有一定價(jià)值，有助于鑒別有無鐵沉積及病理分級(jí)≥3級(jí)鐵沉積。但本研究樣本量小，且未能定量檢測(cè)大鼠肝臟鐵質(zhì)及脂肪含量，有待進(jìn)一步完善。