β-伴大豆球蛋白對IPEC-J2細胞損傷的作用機制研究

孫智峰，王 蕾，劉羽佳，丁紅研，王 志，李思婷，王承智，李 玉，王希春，吳金節(jié)

(安徽農業(yè)大學 動物科技學院,安徽 合肥 230036)

大豆和大豆食品因其含有高品質的蛋白質及許多其他功能物質(如酚酸和異黃酮)，在亞洲一些國家常被用作健康食品和營養(yǎng)食材[1]。同時，由于大豆優(yōu)異的功能特性、生物活性、高營養(yǎng)和低成本而被廣泛用于畜禽飼料中。但大豆中的大豆凝集素、過抗原蛋白和胰蛋白酶抑制劑[2]等抗營養(yǎng)因子會導致幼年動物發(fā)生過敏反應[3]，并引起免疫功能障礙、生長抑制和腹瀉等問題?？乖鞍资谴蠖沟闹饕旅粢蜃樱噪x心沉降速率可分為2S、7S(β-伴大豆球蛋白)、11S(大豆球蛋白)和15S 4種主要類型。其中β-伴大豆球蛋白作為一種糖蛋白，由α‘(分子質量約72 ku)、α(分子質量約68 ku)和β(分子質量約50 ku)亞基組成。β亞基的表位在仔豬、狗、魚和兔中顯示為抗原性，提示可能具有跨物種反應性，且在馬和仔豬身上觀察到對豆粕的陽性皮膚試驗結果[4]。冷兆澤[5]研究發(fā)現(xiàn)，β-伴大豆球蛋白顯著降低仔豬生長性能，影響血液生化指標和養(yǎng)分物質代謝率，使仔豬小腸黏膜絨毛長度顯著降低而隱窩深度顯著升高，并導致仔豬D-木糖吸收能力和小腸消化酶活性顯著降低。

核因子-κB(NF-κB)是一種核轉錄因子，是炎癥過程中的重要介質，廣泛參與炎癥性疾病的發(fā)生，其功能很大程度上是基于其在致炎細胞因子基因表達的中心作用，包括細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)也介導炎癥和免疫反應[6-11]。腫瘤壞死因子TNF-α可刺激體內誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的生成；高濃度的iNOS可以與細胞表面的受體結合，最終激活NF-κB；JNK和p38信號通路的激活會相應激活各種轉錄因子，而這些轉錄因子控制著炎癥相關基因(包括iNOS和COX-2)的表達[12]。因此MAPK和NF-κB/iNOS信號通路的異常激活會促進炎癥反應。大豆抗原蛋白誘導的仔豬過敏反應主要是T細胞2(Th2)型免疫反應，而TNF-α和INF-γ是Th2型免疫反應的重要產物，細胞因子IL-10主要由輔助性Th2產生，在過敏性炎癥反應中發(fā)揮重要作用。Liu等[3]通過灌胃小鼠β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，發(fā)現(xiàn)小鼠小腸組織中IL-10 mRNA 的表達量降低，IL-10 參與的免疫抑制反應是由p38 途徑介導的。因此可以用TNF-α、INF-γ、IL-10含量來衡量β-伴大豆球蛋白對豬腸上皮細胞(IPEC-J2)的損傷程度。

二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)作為一種NF-κB強效抑制劑，既能抵抗自由基的毒性作用，也能抑制促炎性細胞因子的生成[13]。Nω-硝基-L-精氨酸甲酯 (L-NAME)為一種非特異性NOS抑制劑，能同時抑制nNOS、eNOS和iNOS的表達[14]。SP600125可以抑制JNKmRNA的表達[15]。SB202190可抑制p38/MAPK信號通路，降低TNF-α濃度[16]。目前已有引起豬腸上皮細胞炎性損傷的多種信號通路的定性研究，如本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)，β-伴大豆球蛋白通過p38、JNK和NF-κB信號通路引起IPEC-J2細胞損傷[17-18]。但細胞信號轉導是多通路、多環(huán)節(jié)、多層次高度復雜的級聯(lián)反應，目前仍缺少β-伴大豆球蛋白引起豬腸上皮細胞炎性損傷的多種信號通路的比較與定量研究。本試驗在前期研究基礎上，在體外培養(yǎng)的IPEC-J2細胞中添加β-伴大豆球蛋白及PDTC、L-NAME、SP600125、SB202190 4種抑制劑，研究其對IPEC-J2細胞活性以及相關炎性因子含量、蛋白和mRNA表達量的影響，分析β-伴大豆球蛋白通過NF-κB、iNOS、JNK和p38信號通路誘導IPEC-J2細胞損傷的機制，以期為探索β-伴大豆球蛋白引發(fā)仔豬腸道黏膜損傷的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

β-伴大豆球蛋白由中國農業(yè)大學食品工程學院提供(專利號：200410029589.4，中國)。IPEC-J2細胞購自武漢農業(yè)科學院細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Thermo公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Biosharp；β-actin(MG 3)Mouse Monoclonal Antibody購自北京銳抗生物科技有限公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠二抗，均購自Biosharp；p-NF-κB抗體(Ser 536)購自Santa cruz；iNOS蛋白購自Nuvos；PDTC、L-NAME、SP600125、SB202190，均購自碧云天生物技術公司；NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒，均購自上?？婆d生物科技有限公司；CCK8購自Med Chem Express公司。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機分組設計。取對數(shù)生長期的IPEC-J2細胞, 以1×105個/mL的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)至細胞貼壁。試驗設6組：對照組T0(細胞不做處理)，試驗組T1(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白)、T2(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L PDTC)、T3(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L L-NAME)、T4(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L SP600125)和T5(加入5 mg/mL β-伴大豆球蛋白+1 μmol/L SB202190)。

1.3 試驗方法

1.3.1 IPEC-J2細胞的顯微結構觀察 各試驗組處理24 h后，將IPEC-J2細胞接種在玻片上，PBS洗滌3次；然后用體積分數(shù)4%聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，每次1 min。用蘇木精將細胞染色3 min，自來水沖洗約5 min。再將細胞置于體積分數(shù)1%冰醋酸中用自來水沖洗約1 min，在曙紅-磷脂溶液中染色1 min后，在無水乙醇中脫水。用光學顯微鏡觀察細胞。

1.3.2 IPEC-J2細胞的超微結構觀察 收集T0～T5組細胞，4 ℃環(huán)境下在體積分數(shù)2.5%戊二醛中固定1 h，二甲基苯二甲酸鹽緩沖液中稀釋。固定后，在碳酸氫鈉(0.1 mol/L，pH 7.4)和氯化鈣緩沖液(3 mmol/L)中洗滌，然后在緩沖液中用體積分數(shù)1%鋨酸固定30 min，0 ℃下用體積分數(shù)2%醋酸鈾酰染色過夜。使用 JEM-1230 TEM(JEOL,Akishima Tokyo,Japan)透射電鏡觀察細胞超微結構。

1.3.3 IPEC-J2細胞活性的CCK8檢測 將IPEC-J2細胞以2×103個/孔接種到96孔板上，每孔100 μL，37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，按試驗分組加入對應溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，直至出現(xiàn)明顯的顏色反應。用酶標儀讀取每孔的OD450 nm值，以細胞存活率表征細胞活性。細胞存活率=[(試驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.3.4 IPEC-J2細胞NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量檢測 收集T0～T5組細胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌3次。之后向每組細胞中加入500 μL含體積分數(shù)0.1% Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)，放入冰水中進行超聲裂解。將細胞裂解液以1 000 r/min離心10 min，收取上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟測定NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量。

1.3.5NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表達水平檢測 收集T0～T5組細胞，用Trizol法提取RNA，紫外分光光度計于260 nm測定吸光度值，進行RNA純度檢測。采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件，設計NF-κBp65、iNOS、JNK和p38定量PCR引物，以Actin為內參，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。引物序列及參數(shù)見表1。

表1 NF-κB p65、iNOS、JNK和p38基因的引物序列Table 1 Sequences of primer genes related NF-κB p65,iNOS,JNK,and p38

1.3.6 NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表達量檢測 收集T0～T5組細胞，加入混有蛋白酶抑制劑以及蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，漩渦振蕩器劇烈振搖5～10 s混合均勻，置于冰上20 min，使細胞充分裂解。之后14 000g離心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明進行操作，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。將提取的蛋白質樣品煮沸5 min，在SDS-PAGE凝膠中電泳后轉移到PVDF膜上。用牛血清白蛋白(BSA)在室溫下封閉膜4 h，再放入一抗4 ℃孵育過夜。將膜洗滌3次，并用HRP 標記山羊抗兔 IgG 二抗(1∶5 000稀釋)在室溫下水平振蕩孵育45 min，洗膜后放入凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)中成像。Western blot檢測NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，運用GraphPad Prism 7.0數(shù)據(jù)軟件制圖。采用Quantity One軟件對Western blot結果進行灰度值分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對IPEC-J2細胞顯微結構的影響

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制劑PDTC(T2)、iNOS抑制劑L-NAME(T3)、JNK抑制劑SP600125(T4)、p38抑制劑SB202190(T5)對細胞顯微結構的影響結果見圖1。由圖1可以看出，未經處理的T0組細胞數(shù)量密集，細胞完整，呈多邊形貼壁。T1組細胞數(shù)量大量減少，細胞質降解，細胞核皺縮。而與T1組相比，添加抑制劑后的各組細胞數(shù)量均有所增加，細胞質降解現(xiàn)象減少，整體趨于完好；其中T2組細胞核完整，無皺縮，細胞數(shù)量增多，細胞形態(tài)及完整性接近T0組細胞；T3組細胞無皺縮，細胞質降解現(xiàn)象減少，整體較完整；T4、T5組細胞核無皺縮。說明加入β-伴大豆球蛋白后IPEC-J2細胞結構受到破壞，而4種抑制劑可以不同程度抑制這種作用，且PDTC(T2)的抑制效果最好。

2.2 不同處理對IPEC-J2細胞超微結構的影響

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制劑PDTC(T2)、iNOS抑制劑L-NAME(T3)、JNK抑制劑SP600125(T4)、p38抑制劑SB202190(T5)對IPEC-J2細胞超微結構的影響結果見圖2。圖2顯示，未經處理的T0組細胞結構正常，輪廓清晰；T1組細胞線粒體出現(xiàn)空泡，線粒體結構改變，染色質邊集；T2、T3、T4、T5組細胞結構較完整，空泡減少，且T2組細胞完整性接近T0組細胞。說明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2細胞超微結構受損，線粒體出現(xiàn)空泡，而4種抑制劑可以抑制細胞超微結構受到的損傷，且PDTC(T2)的抑制效果較強。

圖2 β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞超微結構的影響(×20 000，80.0 kV)Fig.2 Effect of β-conglycinin and four inhibitors on ultrastructure of IPEC-J2 cells(×20 000，80.0 kV)

2.3 不同處理對IPEC-J2細胞活性的影響

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制劑PDTC(T2)、iNOS抑制劑L-NAME(T3)、JNK抑制劑SP600125(T4)、p38抑制劑SB202190(T5)對IPEC-J2細胞活性的影響結果見圖3。

圖柱上標不同小寫字母表示差異顯著P<0.05，不同大寫字母表示差異極顯著P<0.01。下同Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05,and different uppercase letters indicate extremely significant difference at P<0.01.The same below圖3 β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞活性的影響Fig.3 Effects of β-conglycinin and four inhibitors on activity of IPEC-J2 cells

由圖3可以看出，與未經處理的T0組相比，T1組細胞活性極顯著降低(P<0.01)。與T1組相比，T2、T3、T4、T5組細胞活性均極顯著升高(P<0.01)；其中T2組細胞活性最高，極顯著高于T4組(P<0.01)，顯著高于T3、T5組(P<0.05)。說明加入β-伴大豆球蛋白后IPEC-J2細胞活性受到抑制，而4種抑制劑可以不同程度解除這種抑制作用，且PDTC(T2)解除抑制的效果顯著強于其他抑制劑。

2.4 不同處理對IPEC-J2細胞NO、TNF-α、IL-10和IFN-γ含量的影響

β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞中NO、TNF-α、IL-10和IFN-γ含量的影響結果見圖4。由圖4可以看出，與未經處理的T0組相比，T1組細胞NO、TNF-α、IFN-γ含量都極顯著升高(P<0.01)，而IL-10含量極顯著減少(P<0.01)；與T1組相比，T2、T3、T4、T5組細胞IL-10含量均極顯著升高(P<0.01)，而NO、TNF-α、IFN-γ含量均極顯著減少(P<0.01)。說明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2細胞中細胞因子NO、TNF-α、IFN-γ的含量升高，而IL-10含量降低，4種抑制劑可以不同程度解除這種促進或抑制作用。

圖4 β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞NO、TNF-α、IL-10和IFN-γ含量的影響Fig.4 Effect of β-conglycinin and four inhibitors on contents of NO,TNF-α,IL-10 and IFN-γ in IPEC-J2 cells

2.5 不同處理對IPEC-J2細胞NF-κB p65、iNOS、JNK和p38的mRNA表達水平的影響

β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞中NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表達水平的影響結果見圖5。

圖5 β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞NF-κB p65、iNOS、JNK和p38的mRNA表達水平的影響Fig.5 Effects of β-conglycinin and four inhibitors on mRNA expression levels of NF-κB p65,iNOS,JNK and p38 in IPEC-J2 cells

由圖5可以看出，與未經處理的T0組相比，T1組細胞中NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表達量均極顯著增高(P<0.01)。與T1組相比，T2、T3、T4、T5組細胞中NF-κBp65 mRNA表達量均極顯著降低(P<0.01)，iNOS、JNK、p38 mRNA表達量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。說明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2細胞中NF-κBp65、iNOS、JNK和p38的mRNA表達水平升高，而4種抑制劑可以不同程度抑制這種作用。

2.6 不同處理對IPEC-J2細胞NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表達量的影響

β-伴大豆球蛋白(T1)和NF-κB抑制劑PDTC(T2)、iNOS抑制劑L-NAME(T3)、JNK抑制劑SP600125(T4)、p38抑制劑SB202190(T5)對IPEC-J2細胞中NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表達量的影響結果見圖6和圖7。圖6顯示，加入β-伴大豆球蛋白后，上述4種蛋白表達量均明顯減少，而加入抑制劑后，蛋白表達有所恢復。由圖7可以看出，與細胞未經處理的T0組相比，T1組細胞中的NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表達量極顯著上升(P<0.01)。與T1組相比，T2、T3、T4、T5組細胞中相關蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)。說明加入β-伴大豆球蛋白后，IPEC-J2細胞中NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表達量升高，而4種抑制劑不同程度地抑制了這種作用。

圖6 添加β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑的NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表達Fig.6 Add β-conglycinin and four inhibitors on protein bands of NF-κB,iNOS,JNK and p38

圖7 β-伴大豆球蛋白和4種抑制劑對IPEC-J2細胞NF-κB、iNOS、JNK和p38蛋白表達量的影響Fig.7 Effects of β-conglycinin and four inhibitors on expression levels of NF-κB，iNOS，JNK and p38 proteins in IPEC-J2 cells

3 討 論

NO由iNOS催化l-精氨酸產生[19-20]，但iNOS過量生產NO會形成反應性氮，導致機體周圍組織細胞死亡并破壞組織穩(wěn)態(tài)[21-22]。丁國雷等[23]通過給小鼠雙側腹股溝和腋窩皮下注射豬心肌肌凝蛋白、腹腔注射百日咳毒素制作小鼠實驗性自身免疫性心肌炎(EAM)模型，模型組小鼠血清中NO含量和iNOS蛋白表達量均上升，而注射L-NAME的小鼠心肌中iNOSmRNA表達、血清iNOS活性以及NO含量比正常組明顯降低。彭成璐等[17]在IPEC-J2細胞中添加大豆抗原蛋白后，細胞中IL-10含量極顯著降低，而NO含量極顯著增高，NF-κB p65、iNOS蛋白表達量和mRNA表達水平均極顯著增高，光鏡下觀察到大量細胞脫落，細胞形態(tài)異常；而加入PDTC提高IPEC-J2細胞活性，促進NO分泌，并抑制IL-10的分泌，同時提高了NF-κB、iNOS的蛋白表達量及NF-κBp65、iNOSmRNA表達水平，這與本試驗結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在IPEC-J2細胞中添加β-伴大豆球蛋白后引起細胞損傷，IL-10含量下降，而NO含量上升，NF-κBp65、iNOSmRNA表達水平升高，iNOS、NF-κB蛋白表達量上升，HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)胞質降解，細胞結構遭到破壞，電鏡下細胞核皺縮，出現(xiàn)大量空泡和染色質邊集現(xiàn)象；而添加L-NAME或PDTC后，NF-κBp65、iNOSmRNA表達水平，NF-κB、iNOS活性及NO含量均顯著下降，HE染色觀察細胞無皺縮，細胞降解的現(xiàn)象減少，整體較完整，說明β-伴大豆球蛋白通過NF-κB/iNOS信號通路引起IPEC-J2細胞炎性損傷，添加PDTC和L-NAME后抑制了這種作用。

Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)細胞IPEC-J2中加入脂多糖可引起細胞炎性損傷，細胞中TNF-α、IFN-γ表達增加。Peng等[25]向IPEC-J2細胞中添加大豆抗原蛋白后，TNF-α含量增加，核染色質凝結和橫向移位。彭成璐等[17]在添加了β-伴大豆球蛋白的豬腸上皮細胞(IPEC-J2)中加入SP600125和SB202190后，JNK、p38蛋白表達量極顯著降低，證明β-伴大豆球蛋白通過p38/JNK信號通路引起仔豬腸上皮細胞損傷。本試驗結果與此一致，即未加入抑制劑前，添加β-伴大豆球蛋白引起細胞活性下降，NO、TNF-α、IFN-γ含量顯著增加，JNK、p38 mRNA表達水平及蛋白表達量增加，胞質溶解，胞核皺縮，染色質邊集；而加入抑制劑后細胞活性提高，JNK、p38蛋白表達量和mRNA表達水平下降，細胞完整性恢復，空泡減少，其中加入PDTC的細胞結構和細胞器結構最完整，細胞活性顯著高于其他抑制劑。