基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探究補腎健脾方治療慢性乙型肝炎的作用機制

賀旻洋 李想 潘小平 周蓉 高思穎 邢宇鋒 童光東

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是指由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染引起的慢性炎癥性肝病，它可逐漸發(fā)展為肝硬化和肝癌[1]。盡管干擾素和核苷類藥物等能有效地抑制HBV復(fù)制，減少HBV慢性感染并發(fā)癥，在一定程度上改善患者遠期結(jié)局，但長期服藥的要求大大降低了患者的依從性，藥物不良反應(yīng)和病毒耐藥等問題限制了這些藥物的臨床應(yīng)用[2]。目前臨床上尚無能完全治愈CHB的特效藥，患者預(yù)后不佳[3]。

中醫(yī)常將CHB納入“脅痛”和“黃疸”的范疇，多數(shù)中醫(yī)學(xué)家認為CHB的病機是由機體正氣不足，濕熱毒邪入侵肝臟，肝失疏泄而導(dǎo)致肝郁脾虛和腎精虧損等[4-7]?；谶@一病因病機理論，童光東教授團隊創(chuàng)立了補腎健脾方[8]，該方共有14味藥。見表1。組方配伍合理，具有健脾補腎、清熱解毒、活血利濕等功效，臨床研究顯示其對CHB療效顯著[9-10]。研究證實，補腎健脾方能調(diào)控Th1/Th2型細胞因子水平，調(diào)節(jié)機體免疫功能，抑制體內(nèi)HBV復(fù)制[11]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)補腎健脾方與抗病毒藥物具有協(xié)同作用，該方不僅能減輕干擾素不良反應(yīng)，降低白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）水平，還能促進乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen，HBeAg）血清學(xué)轉(zhuǎn)換，改善患者臨床癥狀，增強療效[9，12]。然而，補腎健脾方治療CHB的作用機制尚未完全明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究補腎健脾方治療CHB的藥理作用機制，為臨床應(yīng)用補腎健脾方治療CHB提供理論支持。

表1 補腎健脾方的構(gòu)成Tab.1 Constitution of Bushen Jianpi Decoction

1 材料和方法

1.1 補腎健脾方的活性成分篩選 登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，搜集補腎健脾方中淫羊藿、菟絲子、杜仲、懷牛膝、黃芪、白術(shù)、茯苓、豬苓、枳殼、丹參、三七、郁金和枸杞子的化學(xué)成分，并去除部分作用靶點研究尚不明確的化合物。登錄中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）網(wǎng)站（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），以score cutoff≥20，P＜0.05為篩選參數(shù)，結(jié)合文獻[13]對葉下珠的活性成分進行選擇和補充。

1.2 補腎健脾方活性成分作用靶點收集及藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集活性成分的相關(guān)作用靶點，并在UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中將靶點名稱轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的人類基因名稱。匯總整理藥味名稱、活性成分和基因名稱，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer工具計算各活性成分節(jié)點度值，尋找補腎健脾方的核心活性成分。

1.3 補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點預(yù)測及蛋白互作（protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建登錄疾病相關(guān)的基因與突變位點數(shù)據(jù)庫DisGeNET（https://www.disgenet.org），收集CHB的疾病靶點基因。并將其與補腎健脾方活性成分的相關(guān)作用靶點共同導(dǎo)入交互式韋恩圖查看器Jvenn平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html）進行韋恩分析，兩者的交集靶點即為補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點。將潛在作用靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），以“Homo sapiens”為限定基因物種，進行PPI分析，運用Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，按節(jié)點度值的高低篩選核心靶點。

1.4 富集分析 將潛在作用靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），在數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，分別以柱狀圖和氣泡圖顯示GO和KEGG富集結(jié)果。

1.5 分子對接 在TCMSP、Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein DataBank，PDB）平臺（https://www.rcsb.org）下載藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值前10的藥物活性成分和潛在作用靶點度值排名前3的核心靶點的3D立體構(gòu)像文件。運用OpenBabe軟件轉(zhuǎn)換文件格式；運用Pymol軟件去除水和配體等進行預(yù)處理。隨后導(dǎo)入AutoDock進行結(jié)合能評分，并利用Pymol建立對接相互作用模式圖。

2 結(jié)果

2.1 補腎健脾方活性成分的篩選及藥物-活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件，在TCMSP軟件內(nèi)篩選出補腎健脾方各藥味活性成分：淫羊藿23個、菟絲子10個、杜仲26個、懷牛膝15個、葉下珠4個，黃芪17個、白術(shù)4個、茯苓6個、豬苓7個、枳殼5個、丹參59個、三七7個、郁金3個、枸杞子35個。 合并重復(fù)項后共得到188種活性成分，其中包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（Luteolin）等。應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢藥物活性成分的作用靶點，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1。圖中共含有530個節(jié)點 （包含14個藥味節(jié)點、188個活性成分節(jié)點、328個藥物作用靶點節(jié)點）和4 709條網(wǎng)絡(luò)通路。度值排名前20的活性成分見表2，這些成分可能是補腎健脾方治療CHB的核心活性成分。

圖1 補腎健脾方藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Bushen Jianpi Decoction drug-active component-target network

表2 補腎健脾方度值排名前20的活性成分基本信息表Tab.2 Basic information of the top 20 active ingredients of Bushen Jianpi Decoction

2.2 補腎健脾方對CHB的潛在作用靶點 利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集得到CHB靶點415個，通過韋恩分析得到補腎健脾方活性成分靶點與CHB的疾病靶點的交集。見圖2。共有57個藥物-疾病交集靶點基因，分別為白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血清白蛋白（albumin，ALB）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-4等，這些交集靶點是補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點。

圖2 補腎健脾方與CHB的靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets in Bushen Jianpi Decoction and CHB

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò) 將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，查詢靶點之間的相互作用關(guān)系，剔除1個孤立節(jié)點后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0，按度值大小對其進行可視化處理，構(gòu)建補腎健脾方治療CHB的潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。圖中共有56個節(jié)點和788條邊，靶點度值越高，則節(jié)點越大，顏色越藍。度值最高的靶點主要為IL-6、ALB、TNF等，這些靶點可能為補腎健脾方治療CHB的核心靶點。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

2.4 GO功能富集分析 利用DAVID網(wǎng)站對57個藥物-疾病交集靶點進行GO富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共收集到GO條目328條。見圖4。其中273條生物過程（biological process，BP）相關(guān)條目，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、炎癥反應(yīng)等；17條細胞組分（cellular component，CC）相關(guān)條目，包括細胞外間隙、胞外區(qū)等；38條分子功能（molecular function，MF）條目，主要涉及細胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。由此可見，補腎健脾方治療CHB相關(guān)的靶標(biāo)主要富集于細胞外間隙、胞外區(qū)等細胞組分及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子活性等生物功能。

圖4 補腎健脾方治療CHB潛在作用靶點的GO分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of Bushen Jianpi Decoction in the treatment of CHB

2.5 KEGG通路富集分析 以P＜0.05為篩選條件，在DAVID數(shù)據(jù)庫中共富集到63條KEGG通路，其中涉及TNF信號通路（TNF signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway，TLR signaling pathway）等。P值排名前25的KEGG通路富集結(jié)果見圖5。

圖5 補腎健脾方潛在作用靶點KEGG通路富集分析Fig.5 Pathways of potential targets of Bushen Jianpi Decoction by KEGG enrichment analysis

2.6 分子對接分析 將本研究中節(jié)點度值排名前10的核心活性成分分別與3個核心靶點（IL-6、ALB和TNF）進行分子對接。見表3。其中絕大多數(shù)分子對接的結(jié)合能都小于-5 kJ·mol-1，提示核心活性成分能與核心靶蛋白良好結(jié)合，形成較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這是藥效可以有效發(fā)揮的前提。各味中藥中核心化合物與3個核心靶點結(jié)合的最低結(jié)合能Pymol三維模式圖見圖6。

表3 補腎健脾方部分活性成分分子對接結(jié)果Tab.3 Molecular docking results of some active components in Bushen Jianpi Decoction （kJ·mol-1）

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Molecular docking patterns

3 討論

中醫(yī)藥治療CHB具有獨特的優(yōu)勢，補腎健脾方、疏肝理脾、扶正抗毒方等代表方劑治療CHB均取得了良好療效[8，14-15]。研究證實，補腎健脾方可顯著降低HBV DNA水平，提高HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，降低Knodell組織學(xué)活動指數(shù)和Ishak纖維化評分，改善預(yù)后][16-17]]。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、木犀草素等核心活性成分的潛在作用靶點多，且能與3個核心靶點良好結(jié)合，可能是治療CHB的主要成分。槲皮素、山奈酚、木犀草素同屬黃酮類化合物，皆具抗炎、抗病毒、護肝的生物活性[18]。槲皮素可以顯著降低乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）和HBeAg的表達，抑制熱休克蛋白40（heat shock protein 40，HSP40）轉(zhuǎn)錄和HBV復(fù)制。山奈酚不僅能抑制肝細胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）表達，恢復(fù)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶的活性，減輕肝細胞的氧化應(yīng)激損傷；還可顯著下調(diào)血清TNF-α和IL-6的水平，減輕肝臟炎癥反應(yīng)損傷[19]。木犀草素可抑制蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和Smad蛋白磷酸化，顯著抑制肝星狀細胞的激活，促進已活化的肝星狀細胞凋亡，發(fā)揮抗肝纖維化的作用[20]。這些結(jié)果提示，補腎健脾方可能通過抗炎、抑制HBV復(fù)制、抗氧化、抗纖維化等多途徑實現(xiàn)治療CHB的目標(biāo)。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析得到IL-6、ALB、TNF等核心靶點，分子對接結(jié)果顯示這些靶點與核心活性成分結(jié)合良好，可能是補腎健脾方治療CHB重要靶點。IL-6是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，與肝臟炎癥損傷密切相關(guān)，可作為評估和監(jiān)控CHB病情發(fā)展的敏感指標(biāo)[21]。IL-6可通過上調(diào)細胞因子信號傳導(dǎo)因子3的表達，降低干擾素-α（interferon-α，IFN-α）下游效應(yīng)因子黏病毒抗性蛋白A和雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R的表達，削弱IFN-α的抗HBV效應(yīng)，導(dǎo)致CHB患者對IFN類藥物產(chǎn)生耐藥[22]。研究還發(fā)現(xiàn)，激活I(lǐng)L-6可誘導(dǎo)IL-4基因表達，促進CD4+T細胞向Th2亞群分化，下調(diào)Th1細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ） 基因表達[23]。既往臨床研究均顯示，補腎健脾方能顯著降低IL-4、IL-10等Th2細胞因子水平，提高Th1細胞因子IFN-γ水平[9，11，24]，與文獻報道中抑制IL-6的激活所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)相似，提示補腎健脾方可通過抑制IL-6及其信號通路，從調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)、增強IFN抗病毒效應(yīng)、減少耐藥等方面增強抗病毒藥物對CHB的療效。

ALB由肝臟合成，既可上調(diào)谷胱甘肽水平，中和自由基而發(fā)揮抗氧化作用，還可抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，下調(diào)血管細胞黏附分子表達，抑制單核細胞黏附，減輕肝細胞炎癥損傷[25]。TNF-α是一種促炎細胞因子，可誘導(dǎo)肝臟炎性損傷，CHB患者血清TNF-α水平可反映肝細胞損傷程度[26]。這些結(jié)果揭示，補腎健脾方可能作用于多靶點，調(diào)控炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療CHB的作用。

GO富集結(jié)果表明，補腎健脾方治療CHB可能與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、炎癥反應(yīng)和細胞因子活性等生物功能相關(guān)，提示該方可能通過調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、抑制肝細胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫等方面影響CHB的發(fā)生發(fā)展。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路和TLR信號通路是補腎健脾方治療CHB的關(guān)鍵通路。其中TNF-α信號通路是重要的炎癥通路，抑制TNF-α通路可有效減少肝細胞壞死，抑制肝星狀細胞的激活，改善患者預(yù)后[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者體內(nèi)HBV特異性TNF-α+T細胞的細胞頻率與肝損傷的嚴重程度密切相關(guān)，而IFN-γ+T細胞的細胞頻率與病毒清除率呈正相關(guān)，TNF-α+T細胞向IFN-γ+T細胞分化將有利于HBV病毒的清除[29]。前期研究顯示，補腎健脾方能夠顯著提高IFN-γ水平[9，11，24]，提示補腎健脾方可能通過參與TNF-α+T細胞向IFN-γ+T細胞分化過程的調(diào)控，調(diào)節(jié)TNF通路。

TLR是一種模式識別受體，對于識別病原體以及啟動免疫應(yīng)答至關(guān)重要[30]，活化TLR可用于CHB的免疫治療[31]。 激活Toll樣受體7（Toll-like receptor 7，TLR7）可顯著誘導(dǎo)IFN-α生成，抑制HBV復(fù)制，降低血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平[32]。 TLR7的激活還可促進CD8+T淋巴細胞活化，啟動免疫應(yīng)答，清除HBV[33]。TLR2在增強HBV特異性CD8+T細胞功能的同時，能激活NF-κB等炎癥通路，誘導(dǎo)促炎細胞因子產(chǎn)生，介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)，抑制HBV復(fù)制[34-35]。由此可見，通過炎癥及模式受體通路減輕炎癥和抑制HBV復(fù)制是補腎健脾方治療CHB的機制之一。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法明確了補腎健脾方含槲皮素和山奈酚等活性成分，可能通過調(diào)節(jié)IL-6等靶點以及TNF和TLR等信號通路發(fā)揮治療CHB作用。該結(jié)果為補腎健脾方的臨床應(yīng)用提供了理論支持，也為相關(guān)分子機制的進一步闡明奠定了基礎(chǔ)。