miR-3175/SIX5軸調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移

呂旭陽 孫江川 董玥 胡林峰 錢穎 范春雷 田男

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所 杭州 310053

神經(jīng)膠質(zhì)瘤（以下簡稱膠質(zhì)瘤）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見和最具破壞性的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率約占惡性腦腫瘤的80%[1]。目前治療以手術(shù)切除為主，術(shù)后配合放化療，但患者預(yù)后仍不理想，5年生存率僅為10%[2]?；蛑委?、免疫治療等雖然表現(xiàn)出良好前景[3-4]，但是分子標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)的篩選是其影響臨床應(yīng)用的關(guān)鍵前提。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由21～23個核苷酸組成的小分子非編碼單鏈RNA，通常經(jīng)由下游靶基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。miR-3175定位于人類15染色體長臂的26.1區(qū)，研究顯示其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括前列腺癌[7]、胃癌[8]和肺癌[9]等。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-3175在膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異常。生物信息學(xué)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-3175可能通過調(diào)控sineoculis同源異型盒同源物5（sineoculis homeobox homologue 5，SIX5）的表達(dá)來干預(yù)膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為。SIX5是SIX家族蛋白的一個成員，該家族是一組進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子[10]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SIX5在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常肺組織。然而，目前膠質(zhì)瘤中miR-3175與SIX5的靶向調(diào)控機(jī)制尚未明確。因此，本研究旨在進(jìn)一步研究miR-3175調(diào)控SIX5表達(dá)，從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的可能機(jī)制，為診斷及治療膠質(zhì)瘤提供新的研究方向。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251和人正常膠質(zhì)細(xì)胞系HA-1800購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于北京四季青生物科技有限責(zé)任公司（批號：19030603）；青-鏈霉素溶液購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號：70091000）；杜爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eagle medium，DMEM）和0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA）溶液均購于天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司（批號：2021060102、20210428）；β-actin抗體購于杭州華安生物技術(shù)有限公司（批號：HM1127）；SIX5抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（批號：00017408）；脂質(zhì)體（Lipofetamine）2000轉(zhuǎn)染試劑和總RNA提取試劑（total RNA extraction reagent，TRIzol） 均購于美國Invitrogen公司（批號：2067406、135404）；噻唑藍(lán)（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）粉末購于北京索萊寶科技有限公司（批號：715F05029）；RNaseA、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Ultra SYBR均購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號：50423、30251、30237）；Transwell小室購于美國Corning Costar公司（批號：01020023）；細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：C1062L）。

TE2000型熒光倒置顯微鏡購于日本Nikon公司；Fresco 21高速冷凍離心機(jī)和3111型二氧化碳培養(yǎng)箱均購于美國Thermo Fisher公司；Guava easyCyte 8型流式細(xì)胞儀為美國EMD Millipore公司產(chǎn)品；qTOWER3G IVD型熒光定量PCR儀購于德國耶拿分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)選用含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，所有細(xì)胞均置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-3175 mimics和inhibitors均由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。序列如下：miR-3175 mimics：5'-ACGUCACUGCGUUCUCUCUCCCCG-3'，inhibitors：5'-CGGGGAGAGAACGCAGUGACGU-3'。 將 細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至40%～50%密度，并根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。A172與U251細(xì)胞均分別設(shè)置對照組（control）、miR-3175 mimics組（轉(zhuǎn)染miR-3175 mimics）、miR-3175 inhibitors組 （轉(zhuǎn) 染miR-3175 inhibitors）、pCDNA3.4-SIX5 組 （轉(zhuǎn) 染pCDNA3.4-SIX5），pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.4-SIX5和miR-3175 mimics）。

1.3.2 RNA提取和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）檢測 使用TRIzol試劑提取總RNA，并按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Ultra SYBR混合物進(jìn)行Real-time qPCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s，1個循環(huán)。 最后通過2-ΔΔCt法分析靶基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 免疫印跡法檢測 裂解細(xì)胞并提取總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)膜。室溫下封閉2 h，4℃下一抗（稀釋比例：1:2 000）孵育過夜，以含有Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline and Tween，TBST）洗滌3次。 添加二抗（稀釋比例：1:2 000），室溫下孵育2 h，以TBST洗滌3次后，采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測試劑盒檢測。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 MTT法檢測 細(xì)胞增殖能力轉(zhuǎn)染48 h后，將各組細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種到96孔板中，每組包含6個平行孔。37℃下孵育24～72 h后，各孔中加入5 mg·mL-1的MTT溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），以酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力 將孔徑為8 μm的小室放入24孔板中。每組以1×104個細(xì)胞的密度接種在含有無血清DMEM培養(yǎng)基的上室中，下室中填充有含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)36 h后，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗3次，光鏡下觀察，隨機(jī)挑選4個視野，20倍光鏡下拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集細(xì)胞，70%乙醇中固定過夜，離心后棄去上清液，加入PBS洗滌2次，37℃下以含RNase A的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色30 min。200 μm篩網(wǎng)過濾后，以流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，以300 μL結(jié)合緩沖液重懸，分別進(jìn)行Annexin-Ⅴ和PI染色。200 μm篩網(wǎng)過濾后，以流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 雙熒光素酶檢測報告基因 使用生物信息學(xué)分析軟件miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html） 和TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/），預(yù)測得出miR-3175的下游靶基因可能為SIX5。構(gòu)建SIX5野生型 （SIX5WT-Luc）與突變型（SIX5MUT-Luc）熒光素酶報告基因質(zhì)粒，分別以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SIX5WT-Luc和共轉(zhuǎn)染SIX5MUT-Luc與miR-3175 mimics到A172和U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，檢測熒光素酶相對活性，以二者的比值作為相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9 基因表達(dá)譜動態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA） 從基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，選擇臨床信息完善的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。在癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載基因系列（gene series，GSE）4290 和GSE16011膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集。通過GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析以上數(shù)據(jù)，并對SIX5在膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析并比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組均數(shù)比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-3175在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)及對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移的影響 Real-time qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-3175在膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172和U251中的表達(dá)水平明顯低于人正常膠質(zhì)細(xì)胞HA-1800（P＜0.01）。見圖1A。

圖1 miR-3175在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)和對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移的影響Fig.1 Expression of miR-3175 in glioma cells and effect of the proliferation and migration of glioma cells

為了探索miR-3175在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用，分別在A172和U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-3175 mimics和miR-3175 inhibitors。MTT結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-3175 mimics 72 h后，A172和U251細(xì)胞存活率分別較各自對照組明顯下降（P＜0.05），而miR-3175 inhibitors組細(xì)胞存活率明顯上升（P＜0.01，P＜0.05）。 見圖1B。以上結(jié)果提示，miR-3175的表達(dá)能夠調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-3175 mimics的膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過小室的數(shù)量較少，而miR-3175 inhibitors組膠質(zhì)瘤細(xì)胞穿過小室的數(shù)量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1C。上述結(jié)果表明，miR-3175的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。

2.2 miR-3175對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，經(jīng)miR-3175 mimics轉(zhuǎn)染后，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少；而miR-3175 inhibitors顯著降低了G0/G1期細(xì)胞比例，并增加了G2/M期細(xì)胞比例（P＜0.05）。見圖2A。以上結(jié)果提示，過表達(dá)miR-3175可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

圖2 miR-3175對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of miR-3175 on cycle distribution and apoptosis of glioma cells

為了研究miR-3175對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，檢測了各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率。轉(zhuǎn)染miR-3175 mimics的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于各自的對照組，A172細(xì)胞凋亡率為（11.85±1.85）%，高于同一細(xì)胞對照組（7.53±1.63）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；U251細(xì)胞為（18.53±3.46）%，高于同一細(xì)胞對照組（7.80±1.13）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 而轉(zhuǎn)染miR-3175 inhibitors的細(xì)胞凋亡率顯著低于同一細(xì)胞對照組，A172細(xì)胞為（4.91±0.82）%，低于對照組的（7.53±1.63）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；U251為（4.58±1.60）%，低于同一細(xì)胞對照組（7.80±1.13）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2B。

2.3 SIX5是miR-3175的潛在靶基因 生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，SIX5的3'-非翻譯區(qū)（untranslated area，UTR）區(qū)域存在與miR-3175成熟序列互補(bǔ)配對的結(jié)合區(qū)，提示SIX5可能是miR-3175的潛在靶基因。見圖3A。

圖3 SIX5是miR-3175的潛在靶基因Fig.3 SIX5 is a potential target gene of miR-3175

為進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的靶向關(guān)系，首先檢測了miR-3175對SIX5蛋白表達(dá)水平的影響。免疫印跡法結(jié)果顯示，與各自對照組比較，miR-3175 mimics轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SIX5表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05），miR-3175 inhibitors轉(zhuǎn)染后的SIX5表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖3B。

其次，分別在A172與U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)SIX5，以檢測SIX5對miR-3175表達(dá)水平的影響。見圖3C。膠質(zhì)瘤細(xì)胞在過表達(dá)SIX5后miR-3175的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。 見圖3D。

最后，將pmirGLO SIX5-WT或pmirGLO SIX5-MUT載體與miR-3175mimics共轉(zhuǎn)染入U251細(xì)胞中，通過熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，與pmirGLO SIX5-MUT比較，pmirGLO SIX5-WT報告分子的相對熒光素酶活性被抑制了53%（P＜0.01）。見圖3E。上述結(jié)果表明SIX5與miR-3175的表達(dá)負(fù)相關(guān)，它是miR-3175的下游靶基因。

2.4 SIX5在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)且與患者預(yù)后相關(guān)為了研究SIX5在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)模式，對TCGALGG及TCGAGBM數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果顯示，SIX5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見圖4A。與TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，GSE4290數(shù)據(jù)集的膠質(zhì)瘤組織中SIX5的表達(dá)水平顯著增高，且與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級有關(guān)（P＜0.05）。 見圖4B。 此外，對GSE16011數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變型的腫瘤組織中SIX5基因表達(dá)明顯高于野生型（P＜0.05）。見圖4C。采用免疫印跡法檢測人正常膠質(zhì)細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SIX5的表達(dá)，結(jié)果顯示A172與U251細(xì)胞中SIX5的表達(dá)量均明顯高于HA-1800（P＜0.01）。 見圖4D。 以上結(jié)果提示，SIX5基因表達(dá)上調(diào)可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)。

圖4 SIX5在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)且與患者預(yù)后相關(guān)Fig.4 SIX5 is highly expressed in glioma tissues and is related to patient prognosis

以SIX5相對表達(dá)量中位數(shù)為界，將TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)瘤患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組，生存分析結(jié)果顯示，SIX5高表達(dá)的患者總生存期（overall survival，OS）和無進(jìn)展生存期（progress free survival，PFS）均顯著低于低表達(dá)組患者（P＜0.01）。見圖4E。GSE16011數(shù)據(jù)集分析結(jié)果同樣表明，SIX5高表達(dá)的患者OS顯著低于SIX5低表達(dá)的患者（P＜0.01）。見圖4F。以上結(jié)果提示SIX5高表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后有關(guān)。

2.5 SIX5上調(diào)降低了miR-3175 mimics抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-3175是否通過靶向抑制SIX5的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的各項(xiàng)惡性生物學(xué)行為，將pCDNA3.4-SIX5、pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics和miR-3175 mimics分別轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后 pCDNA3.4-SIX5組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率明顯高于pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組 （P＜0.05），miR-3175 mimics組的膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率遠(yuǎn)低于pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖5A。 以上結(jié)果表明，SIX5的過表達(dá)削弱了miR-3175 mimics對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制能力。

圖5 SIX5上調(diào)降低了miR-3175 mimics對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用Fig.5 Up-regulation of SIX5 reduced the inhibitory effect of miR-3175 mimics on the proliferation and migration of glioma cells

Transwell結(jié)果顯示，pCDNA3.4-SIX5組通過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于其他組（P＜0.01），而miR-3175 mimics組通過濾膜的細(xì)胞數(shù)量明顯低于pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5B。以上結(jié)果說明，SIX5過表達(dá)削弱了miR-3175對膠質(zhì)瘤遷移能力的抑制作用，提示SIX5參與了miR-3175抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的過程。

2.6 SIX5上調(diào)逆轉(zhuǎn)了miR-3175 mimics對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，與各自對照組和pCDNA3.4-SIX5+miR-3175mimics組比較，pCDNA3.4-SIX5組處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯減少，處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.01）；而miR-3175 mimics組處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比例明顯增加，處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01）。見圖6A。結(jié)果表明，SIX5的過表達(dá)可以緩解miR-3175 mimics對細(xì)胞周期的阻滯作用。

圖6 SIX5上調(diào)逆轉(zhuǎn)了miR-3175 mimics對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用Fig.6 Up-regulation of SIX5 reversed the effect of miR-3175 mimics on glioma cell apoptosis

pCDNA3.4-SIX5組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率明顯低于各自對照組（P＜0.05，P＜0.01）；pCDNA3.4-SIX5+miR-3175 mimics組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于pCDNA3.4-SIX5組（P＜0.01），但明顯低于miR-3175 mimics組（P＜0.01）。 見圖6B。 說明SIX5的過表達(dá)削弱了miR-3175 mimics對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

3 討論

膠質(zhì)瘤惡性程度高、浸潤性強(qiáng)，往往腫瘤邊界不清，手術(shù)難以完整切除，所以常伴有不良預(yù)后。雖然隨著顯微外科的進(jìn)展，以及術(shù)中磁共振及神經(jīng)導(dǎo)航等方法的應(yīng)用，膠質(zhì)瘤手術(shù)治療的效果得到了一定程度的改善，并延長了患者的生存期，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高[12-13]。因此，尋找膠質(zhì)瘤預(yù)后標(biāo)志物和有效的靶標(biāo)分子對指導(dǎo)和優(yōu)化治療尤其重要。

目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過調(diào)控其對應(yīng)靶基因及下游信號通路，參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展中的許多重要進(jìn)程，包括調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移和生長以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[14-16]。Ke等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-326的過表達(dá)可以抑制成纖維細(xì)胞生長因子1（fibroblast growth factor 1，F(xiàn)GF1）的表達(dá)，并進(jìn)一步阻斷磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB）和絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2（mitogen activated protein kinase kinase1/2，MEK1/2）通路的活性，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為。Nan等[18]研究證明，miR-451通過靶向結(jié)合鈣結(jié)合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39），調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮生長因子（mammalian target of rapamycin/hypoxia inducible factor-1α/vascular endothelial growth factor，mTOR/HIF-1α/VEGF）信號通路，從而能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

miR-3175定位于人類15號染色體長臂的26.1區(qū)，研究證實(shí)其在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖遷移密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，與人正常膠質(zhì)細(xì)胞比較，miR-3175在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。為驗(yàn)證miR-3175是否對膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為有影響，本研究對膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行miR-3175過表達(dá)以及敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-3175過表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力顯著降低、凋亡率顯著升高；而miR-3175敲除后細(xì)胞的增殖、遷移能力明顯升高、凋亡率明顯下降，表明miR-3175在膠質(zhì)瘤中扮演著抑癌基因的作用，可以作為治療膠質(zhì)瘤的潛在靶標(biāo)分子。然而有報道稱，miR-3175在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，在肺癌組織中低表達(dá)，說明miR-3175在不同腫瘤中的表達(dá)存在異質(zhì)性[8-9]。

為了進(jìn)一步探索miR-3175在膠質(zhì)瘤中的抑癌機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)SIX5可能是miR-3175的潛在靶基因之一。SIX5隸屬于SIX家族，該家族有6個成員，包括SIX1、SIX2、SIX3、SIX4、SIX5和SIX6，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附和遷移過程中具有重要作用[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，SIX1參與了人類多種癌癥的發(fā)生，包括胃癌[19]、乳腺癌[20]和結(jié)腸直腸癌[21]等。SIX2通過下調(diào)E-鈣黏蛋白水平，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[22]。SIX3的高表達(dá)則有助于改善肺腺癌患者的臨床結(jié)局，增加肺癌細(xì)胞中SIX3的表達(dá)，可以抑制細(xì)胞增殖和遷移[23]。Wei等[24]證實(shí)，SIX4蛋白豐度增高與食管鱗狀細(xì)胞癌的不良分化和浸潤深度增加密切相關(guān)。有研究表明，SIX5的表達(dá)異?？赡軈⑴c1型肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制[25]。降低 SIX5的表達(dá)可改善mdx小鼠的營養(yǎng)不良，并能夠延長其壽命[26]。Klesert等[27]還發(fā)現(xiàn)，缺乏SIX5會引發(fā)小鼠白內(nèi)障。目前SIX5在腫瘤中研究較少，Liu等[11]的研究表明SIX5在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，但其在膠質(zhì)瘤中的作用至今未有報道。本研究免疫印跡法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-3175可以抑制SIX5的表達(dá)。雙熒光素酶報告基因分析進(jìn)一步證實(shí)，miR-3175通過結(jié)合SIX5 mRNA的3'-UTR來抑制SIX5的表達(dá)，與本研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-3175低表達(dá)，而SIX5高表達(dá)的結(jié)果相符。此外，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)SIX5可以逆轉(zhuǎn)miR-3175對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的抑制作用，提示miR-3175可能靶向負(fù)調(diào)控SIX5，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-3175在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，并能夠抑制膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為，進(jìn)一步證明了miR-3175靶向負(fù)調(diào)控促癌基因SIX5在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤增殖和遷移中的作用。本研究結(jié)果為膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制提供了新的見解，miR-3175/SIX5途徑也可能成為膠質(zhì)瘤靶向治療的新途徑。