益氣健脾消瘀泄?jié)岱綄β阅I衰竭大鼠骨骼肌自噬的影響

程天陽 馬書云 楊丹 夏虹 張冰冰 魯科達(dá)

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)展成終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）的共通途徑，在此過程中28%～54%的透析患者會伴隨不同程度的代謝紊亂和營養(yǎng)不良[1]，被稱作蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良（protein-energy wasting，PEW）。作為CKD的常見并發(fā)癥之一，PEW以體質(zhì)量減低、血清白蛋白水平下降、肌肉萎縮（muscular atrophy，MA）等為主要表現(xiàn)，其中MA被認(rèn)為是判斷PEW嚴(yán)重程度的最佳指標(biāo)[2]。另有研究表明，MA可使透析患者4～6年死亡風(fēng)險上升3倍[3]，因此改善CRF患者整體營養(yǎng)狀態(tài)、防止肌肉萎縮，對提高其生存率及生活質(zhì)量具有重要意義。

CRF患者出現(xiàn)PEW的主要原因是蛋白質(zhì)合成與分解的代謝失衡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬溶酶體系統(tǒng)（autophagy lysosome system，ALS）作為一種新的蛋白質(zhì)降解途徑，在維持骨骼肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮了重要作用[4]。而CKD相關(guān)的臨床研究和動物實驗中均證實研究對象骨骼肌存在自噬活化現(xiàn)象[5-6]，這提示自噬極有可能參與了CRF患者M(jìn)A的發(fā)生發(fā)展。

益氣健脾消瘀泄?jié)岱绞囚斂七_(dá)教授基于“脾主肌肉”理論提出的治療CRF營養(yǎng)不良的專方，以補氣藥為主、化瘀藥為輔、健脾藥固本、蟲類藥為使，有益氣健脾、消瘀泄?jié)嶂?。前期研究已證實，其基礎(chǔ)方消瘀泄?jié)犸媽KD氣虛夾瘀證具有較好療效[7-9]。

本研究以CRF-PEW大鼠為研究對象，觀察益氣健脾消瘀泄?jié)岱綄ζ涔趋兰∽允上嚓P(guān)基因表達(dá)的影響，探討益氣健脾消瘀泄?jié)岱礁纳艭RF-PEW的作用和機(jī)制，為該方的臨床推廣提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specified pathogen free，SPF）級健康雄性SD大鼠30只，6周齡，體質(zhì)量160～180 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2018-0012]。實驗期間予SPF級低蛋白飼料（酪蛋白60 g·kg-1、淀粉539 g·kg-1、糊化淀粉130.5 g·kg-1、蔗糖100 g·kg-1、豆油70 g·kg-1、微晶纖維素50 g·kg-1、礦物鹽混合物35 g·kg-1、維生素混合物10 g·kg-1、L-胱氨酸3.0 g·kg-1、 氯化膽堿2.5 g·kg-1）飼養(yǎng)，飼料購于江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司（批號：XTLPR001），自由飲水，保持晝夜節(jié)律，室溫（22±1）℃。本研究已獲得浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：IACUC-20180507-06）。

1.2 藥品和試劑 益氣健脾消瘀泄?jié)岱接缮S芪30 g、車前草20 g、地龍12 g、制軍10 g、桃仁12 g、川牛膝12 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g組成，以上中藥由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，以單蒸水600 mL煎煮1 h，重復(fù)2次，混勻后以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1.47 g·mL-1，4℃冰箱保存待用。復(fù)方α-酮酸片購于北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司（規(guī)格：0.63 g/片，國藥準(zhǔn)字：H20041442），以0.9%氯化鈉注射液8 mL溶解，配制成78.75 mg·mL-1的混懸液，4℃保存待用。SYBR Green實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號：CW2601）；二喹啉甲酸 （bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于Solarbio Cat公司 （批號：pc0020）；兔抗p62多克隆抗體、兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3A/3B （microtubule-associated protein light chain 3A/3B，LC3A/B）多克隆抗體、兔抗Beclin-1多克隆抗體、兔抗叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3a（forkhead-box transcription factor O3a，F(xiàn)oxo3a）多克隆抗體均購于CST公司（批號：39749、4108S、3495S、12829S）。

1.3 主要儀器 TE2000-S型熒光顯微鏡購于日本Nikon公司；SorvallTMST 8型低溫高速離心機(jī)和Qubit4型核酸蛋白定量儀均為美國ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品；Mastercycler?nexus型普通PCR擴(kuò)增儀購于德國Eppendorf公司；CMaxPlus型酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 分組給藥 大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)挑選5只作為假手術(shù)組，僅剝離腎包膜；余下25只大鼠行二步法5/6腎切除，建立CRF大鼠模型，第2次術(shù)后改為低蛋白飲食喂養(yǎng)，制作CRF-PEW大鼠模型。以造模后大鼠體質(zhì)量較假手術(shù)組下降20%以上為造模成功的主要標(biāo)志，并將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型對照組8只、陽性對照組8只、中藥治療組9只，造模成功次日開始灌胃給藥。根據(jù)人-大鼠體表面積的轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25進(jìn)行換算，中藥治療組大鼠中藥用量為1 mL·100g-1，陽性對照組大鼠復(fù)方α-酮酸片混懸液用量為0.7875 g·kg-1（根據(jù)60 kg成人用量7.56 g·d-1進(jìn)行換算），模型對照組大鼠使用等體積0.9%氯化鈉注射液，各組灌胃量均為1 mL·100g-1，1次/d，持續(xù)8周。

1.4.2 標(biāo)本采集 治療前后采用代謝籠收集大鼠24 h尿液；給藥前頜下靜脈采血，給藥完成后心臟取血，血液靜置離心后取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管；心臟取血后，于冰上剝離雙側(cè)脛骨前肌和腓腸肌，置于凍存管。所有標(biāo)本均-80℃凍存，用于后續(xù)檢測。

1.4.3 指標(biāo)檢測

1.4.3.1 腎功能檢測 采用全自動生化分析儀檢測大鼠給藥前后血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清白蛋白（albumin，ALB）以及24 h尿蛋白（24 hours urine protein，24 h Upr）水平。

1.4.3.2 骨骼肌形態(tài)改變觀察 大鼠骨骼肌放入10%中性甲醛中固定24 h后，取材包埋，切片后60℃烘片1 h，二甲苯脫蠟后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，200倍光鏡下觀察各組骨骼肌形態(tài)差異。

1.4.3.3 Real-time qPCR檢測骨骼肌p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達(dá) 嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因。引物由杭州鷹旸生物科技有限公司合成，序列見表1。設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，將已提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)，72℃終止延伸5 min。生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線，采用2－△△CT方法計算各基因的相對表達(dá)量。

1.4.3.4 免疫印跡檢測骨骼肌p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達(dá) 取大鼠骨骼肌提取蛋白，蛋白定量后按照試驗操作步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗，4℃孵育過夜。加入對應(yīng)二抗，室溫避光孵育1 h后熒光法掃描顯像，并進(jìn)行蛋白條帶分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.4.3.5 免疫組化檢測骨骼肌Foxo3a表達(dá) 嚴(yán)格按照實驗步驟對骨骼肌病理切片進(jìn)行抗原修復(fù)、免疫雜交、復(fù)染、封膠，在200倍光鏡下隨機(jī)選取6個不重復(fù)視野觀察染色區(qū)域，并采用Image Pro Plus 6.0軟件測定陽性染色面積（Area）、累積光密度（integrated optical density，IOD）值，并計算平均光密度值（mean optical density，MOD）進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間總體比較采用單因素方差分析，其中方差齊的資料采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊的資料采用Dunnett's T3法進(jìn)行兩兩比較；非正態(tài)分布的資料組間比較采用非參數(shù)檢驗方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能比較 與假手術(shù)組比較，治療前與治療后造模各組Scr、BUN均顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療后陽性對照組、中藥治療組Scr有所下降（P＜0.05），BUN顯著下降（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組治療后Scr、BUN降低更明顯（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠腎功能比較Tab.2 Comparison of kidney function in each group （±s）

表2 各組大鼠腎功能比較Tab.2 Comparison of kidney function in each group （±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，☆P＜0.05。Note:Compared with sham operation group，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with positive drug control group，☆P＜0.05.

BUN（mmol·L-1）治療前 治療后 治療前 治療后假手術(shù)組 28.53±2.07 38.98±3.74 2.64±0.18 3.47±0.50模型對照組 58.76±10.34** 55.15±9.46** 8.86±0.50** 10.77±2.29**陽性對照組 59.66±9.37** 45.95±4.77**△ 8.97±0.37** 7.37±0.47**△△中藥治療組 60.56±11.22** 42.94±5.22**△☆ 8.88±0.48** 6.15±0.54**△△☆Scr（μmol·L-1）組別

2.2 各組大鼠ALB與24 h Upr水平比較 與假手術(shù)組比較，治療前造模各組ALB水平下降（P＜0.05），24 h Upr升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療后陽性對照組ALB水平升高、24 h Upr下降（P＜0.05），中藥治療組ALB、24 h Upr變化更顯著（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組治療后ALB水平升高更明顯（P＜0.05）、24 h Upr降低更明顯（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠ALB與24 h Upr水平比較Tab.3 Comparison of ALB and 24 h Upr in each group （±s）

表3 各組大鼠ALB與24 h Upr水平比較Tab.3 Comparison of ALB and 24 h Upr in each group （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，☆P＜0.05。Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with positive drug control group，☆P＜0.05.

24 h Upr（mg·24 h）治療前 治療后 治療前 治療后假手術(shù)組 32.06±0.68 32.82±2.04 22.56±1.77 23.96±2.55模型對照組 25.38±3.63* 24.50±2.06* 35.72±2.13** 36.10±3.07**陽性對照組 25.67±3.58* 27.51±1.18*△ 35.08±2.39** 30.05±1.44**△中藥治療組 25.80±3.59* 28.22±0.70*△△☆ 35.16±2.07** 27.51±0.75**△△☆A(yù)LB（g·L-1）組別

2.3 各組大鼠骨骼肌形態(tài)改變比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠骨骼肌明顯萎縮；與模型對照組比較，陽性治療組與中藥治療組大鼠骨骼肌萎縮程度均有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌形態(tài)改變（HE染色，200×）Fig.1 Changes in skeletal muscle morphology of rats in each group（HE staining，200×）

2.4 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a表達(dá)比較

2.4.1 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組p62基因表達(dá)量降低（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1和Foxo3a基因表達(dá)量升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，治療后陽性對照組、中藥治療組p62基因表達(dá)量升高（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1和Foxo3a基因表達(dá)量均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組p62基因表達(dá)量升高更明顯（P＜0.05）、Foxo3a基因表達(dá)量降低更明顯（P＜0.05）。 見表4。

表4 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達(dá)比較Tab.4 Comparison of p62，LC3A/B，Beclin-1 and Foxo3a gene expressionin skeletal muscle in each group （±s）

表4 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因表達(dá)比較Tab.4 Comparison of p62，LC3A/B，Beclin-1 and Foxo3a gene expressionin skeletal muscle in each group （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，☆P＜0.05。Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with positive drug control group，☆P＜0.05.

組別 p62 LC3A/B Beclin-1 Foxo3a假手術(shù)組 0.99±0.07 0.99±0.03 1.01±0.11 1.02±0.10模型對照組 0.33±0.02** 1.09±0.02** 3.95±0.09** 3.57±0.49**陽性對照組 0.89±0.08*△△ 0.75±0.13*△ 2.50±0.33*△△ 1.57±0.26*△△中藥治療組 1.00±0.06*△△☆ 0.61±0.06*△ 2.23±0.12*△△ 1.22±0.05*△△☆

2.4.2 各組大鼠骨骼肌組織p62、LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組p62蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，陽性對照組、中藥治療組p62蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中藥治療組p62蛋白表達(dá)升高更明顯（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 免疫印跡檢測骨骼肌目標(biāo)基因蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of target gene protein in skeletal muscle by Western blot

2.4.3 各組大鼠骨骼肌組織Foxo3a表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組、陽性對照組、中藥治療組骨骼肌細(xì)胞胞質(zhì)中均顯示不同程度的棕褐染色，提示Foxo3a表達(dá)上調(diào)。見圖3。與假手術(shù)組比較，模型對照組與陽性對照組Foxo3a表達(dá)均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型對照組比較，中藥治療組與陽性對照組Foxo3a表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。 見表5。

圖3 各組大鼠骨骼肌中Foxo3a蛋白的表達(dá)情況（200×）Fig.3 Expression of Foxo3a protein in skeletal muscle in each group（200×）

表5 各組大鼠骨骼肌中Foxo3a蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of Foxo3a protein expression in skeletal muscle in each group （±s）

表5 各組大鼠骨骼肌中Foxo3a蛋白表達(dá)比較Tab.5 Comparison of Foxo3a protein expression in skeletal muscle in each group （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model control group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

組別 Area IOD MOD假手術(shù)組 106 293.858±9 930.774 4 223.246±440.466 0.040±0.007模型對照組 2 903 643.125±245 918.724** 164 787.390±10 908.831** 0.057±0.006**陽性對照組 2 618 414.623±208 672.230*△ 130 005.233±15 777.401*△ 0.050±0.007*△中藥治療組 620 986.378±34 813.336△△ 27 275.249±2 028.691△△ 0.044±0.005△△

3 討論

PEW是CRF患者的常見并發(fā)癥，在加速疾病進(jìn)展的同時更易誘發(fā)心血管事件，增加感染風(fēng)險，是ESRD患者住院率和死亡率增加的主要原因[10]。蛋白質(zhì)合成與分解失衡是發(fā)生PEW的根本原因，包括膳食中蛋白質(zhì)和能量攝入不足，以及由于代謝性酸中毒、內(nèi)分泌紊亂以及微炎癥狀態(tài)等造成的蛋白質(zhì)代謝失調(diào)，透析患者在治療過程中更容易伴隨額外的營養(yǎng)丟失?，F(xiàn)有的臨床營養(yǎng)支持療法對經(jīng)濟(jì)條件要求較高，患者依從性較差，且尚無足夠循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持其降低了患者死亡率。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為CRF屬于“水腫”“關(guān)格”范疇，以脾腎虧虛為本，濁毒壅滯為標(biāo)，病程日久，臟腑衰退，氣血兩虛，故面色無華，肢體痿廢。針對PEW導(dǎo)致的骨骼肌萎縮，魯科達(dá)教授依據(jù)“脾主肌肉”理論，強調(diào)健脾在CKD治療中的作用，其一“諸濕腫滿，皆屬于脾”，脾為太陰濕土，虛則水寒相侮，陽虛運化不利，飲停發(fā)為浮腫；其二“氣血生化，脾為之源”，脾為后天之本，受納運化水谷，消化吸收不佳，臟腑氣血失養(yǎng)；其三“脾氣散精，充養(yǎng)四肢”，脾為升降樞紐，協(xié)調(diào)五臟陰陽，水精四布不暢，肌骨筋脈失榮。由此，魯科達(dá)教授在“祛瘀生新”治法基礎(chǔ)上結(jié)合“脾主肌肉”理論，創(chuàng)立益氣健脾消瘀泄?jié)岱?，作為治療CRF-PEW患者的專方。該方為消瘀泄?jié)犸嬇c四君子湯合方化裁所得，由生黃芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、制軍10 g、車前草20 g、黨參15 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g組成。方中重用黃芪補氣行血，鼓動諸藥；制軍蕩滌腸胃，消積破滯；桃仁、牛膝協(xié)同活血，逐瘀通經(jīng)；地龍性喜走竄，功擅通絡(luò)；車前草利水通淋，導(dǎo)濁下行；參術(shù)茯苓助陽補氣，化濕健脾。氣足則推動，血行則瘀去，水行則濁泄，諸藥合用，消補兼施，共奏益氣健脾、消瘀泄?jié)嶂Α?/p>

自噬在PEW骨骼肌萎縮過程中發(fā)揮重要作用，其調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，自噬相關(guān)基因（autophagy related genes，Atg）表達(dá)可受多種信號分子影響。p62是自噬特異性底物，可通過與Atg8的同源蛋白LC3結(jié)合，介導(dǎo)自噬-溶酶體系統(tǒng)降解[11]；Atg6同源蛋白Beclin-1，在自噬體的形成中必不可少，可促進(jìn)自噬小泡的成核及胞質(zhì)蛋白的招募，是自噬體形成的標(biāo)志[12]；Foxo轉(zhuǎn)錄因子在CKD誘導(dǎo)的MA過程中起著關(guān)鍵作用，活性Foxo3a可通過自噬刺激肌肉中的溶酶體蛋白水解[6]。

本研究中陽性對照組使用復(fù)方α-酮酸片預(yù)防和治療因CRF導(dǎo)致的PEW，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣健脾消瘀泄?jié)岱降寞熜?yōu)于復(fù)方α-酮酸片。首先，益氣健脾消瘀泄?jié)岱脚c復(fù)方α-酮酸片均可降低CRF-PEW大鼠Scr、BUN和24 h Upr水平，升高ALB水平；而益氣健脾消瘀泄?jié)岱降恼{(diào)節(jié)作用相較復(fù)方α-酮酸片更為顯著，證實了該方對CRF腎功能的保護(hù)作用。其次，與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠骨骼肌明顯萎縮，p62基因及蛋白表達(dá)水平顯著下降，LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因及蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示肌肉蛋白質(zhì)分解可能與自噬激活有關(guān)；而中藥治療組大鼠骨骼肌p62基因及蛋白表達(dá)水平有所上升，而LC3A/B、Beclin-1、Foxo3a基因及蛋白表達(dá)水平有所下降，比陽性對照組更顯著，表明益氣健脾消瘀泄?jié)岱娇梢种乒趋兰∽允蓮亩纳芃A，在該方面的作用亦優(yōu)于復(fù)方α-酮酸片。

綜上所述，益氣健脾消瘀泄?jié)岱綄δI功能具有保護(hù)作用，且能夠在一定程度上改善CRF-PEW，減輕骨骼肌萎縮，其作用機(jī)制可能與抑制骨骼肌自噬有關(guān)。未來的研究將進(jìn)一步探索益氣健脾消瘀泄?jié)岱秸{(diào)控的具體信號通路，以加深對其作用機(jī)制的了解，為中醫(yī)藥多靶點治療與現(xiàn)代化推廣提供實驗依據(jù)。