多組學技術在非小細胞肺癌脾虛濕滯證中的應用研究

陳卓 馬冠君 錢祥 傅曉璇 張愛琴

中國科學院大學附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院） 中國科學院基礎醫(yī)學與腫瘤研究所 杭州 310022

系統(tǒng)生物學是以現(xiàn)代不斷發(fā)展的生物實驗技術為基礎的一門新興學科，研究方法包括轉錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、腸道微生態(tài)學等。中醫(yī)證候是中醫(yī)理論對機體某階段功能狀態(tài)的描述，是疾病發(fā)生和演變過程中某階段生理、病理狀態(tài)的高度概括，因此證候具有即時性、動態(tài)性、整體性的特點[1]。系統(tǒng)生物學的概念，與中醫(yī)的整體觀念相似，運用系統(tǒng)生物學方法研究中醫(yī)證候，有利于從客觀上揭示證候的本質(zhì)。肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率（約占全球癌癥總病例的11.6%）和死亡率（約占全球總癌癥死亡人數(shù)的18.4%）最高的惡性腫瘤[2]。脾虛濕滯證是肺癌的常見證候，健脾祛痰方藥治療本證具有較好療效[3]。本研究運用16S核糖體DNA（16S ribosomal DNA，16S rDNA）鑒定和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）技術對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）脾虛濕滯證進行了蛋白質(zhì)組學、代謝組學和腸道微生態(tài)學的研究，旨在為NSCLC的中醫(yī)證候診斷提供生物學基礎，為今后開展中醫(yī)藥抗癌治療提供實驗依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 診斷標準 經(jīng)組織病理學和（或）細胞學確診為NSCLC[4]。符合《中醫(yī)臨床診療術語證候部分》脾虛濕滯證的診斷標準：以面目肌膚淡黃，甚則晦暗不澤，肢體乏力，食少納呆，大便溏薄，舌質(zhì)淡苔薄，脈濡細等為常見證候[5]。

1.2 納入、排除及脫落標準

1.2.1 納入標準 （1）符合診斷標準；（2）無其他惡性腫瘤病史；（3）符合中醫(yī)辨證標準；（4）性別不限，年齡18～75歲；（5）患者本人同意，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準 （1）近3周內(nèi)使用過抗生素治療；（2）有精神疾病，無完全民事行為能力。

1.2.3 脫落標準 （1）患者依從性差；（2）患者要求終止試驗。

1.3 一般資料 本研究對象為2019年3月至9月于浙江省腫瘤醫(yī)院胸部外科門診就診的NSCLC患者共13例，入組前未行任何治療，均擬行肺癌根治術，由中醫(yī)科兩名副主任以上的中醫(yī)師同時辨證為脾虛濕滯證。性別比男:女為5:8，年齡36～75歲，平均（56.69±11.28）歲，惡性腫瘤國際臨床病期分類（tumor node metastasis classification，TNM）：原位癌1例，Ⅰa期11例，Ⅰb期1例。 同時招募健康志愿者15例，要求經(jīng)體格檢查及實驗室檢查排除心腦血管、肝腎、內(nèi)分泌等重要系統(tǒng)疾病，且近3周內(nèi)無感染性疾病，未使用抗生素。本臨床研究通過浙江省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核（批準號：IRB-2018-219）。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 腸道微生態(tài)分析 采集受試者自然排出至無菌容器內(nèi)的新鮮糞便，迅速置于取樣試管中，并于1 h內(nèi)運至實驗室進行樣品前處理。稱取糞便樣本200 mg，加入30 mL緩沖溶液，充分振蕩混勻，1 000 r/min離心5 min后收集沉淀，以10 mL緩沖溶液重懸。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit對糞便微生物DNA進行提取。提取后，以瓊脂糖凝膠電泳和ThermoNanoDrop 2000紫外微量分光光度計進行總DNA質(zhì)檢。對樣本進行16S V3-V4區(qū)域擴增，引物信息：正向：CCTACGGGNGGCWGCAG；反向：GACTACHVGGGTATCTAATCC。 本研究所用引物由杭州聯(lián)川生物技術有限公司代為合成。將稀釋后的基因組DNA作為模板，使用Phanta Max Master Mix（Vazyme）高保真酶進行聚合酶鏈式反應 （polymerase chain reaction，PCR）。 反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，重復25個循環(huán)；最后72℃持續(xù)5min。反應體系：2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）25 μL，引物各2 μL，加入ddH2O至50 μL。 取PCR產(chǎn)物1.5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像系統(tǒng)進行紫外成像并拍照。

文庫質(zhì)檢合格后，使用量子位（Qubit）對混合文庫pool進行濃度定量，并依據(jù)每個樣品的數(shù)據(jù)量要求進行相應的比例混合，最后運行測序儀（Miseq）測序程序。將序列完全一樣的原始測序數(shù)據(jù)（clean reads）根據(jù)豐度大小進行排序，把其中的Singletons過濾掉，利用Usearch對0.97相似度進行聚類，并進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分，最后將所有clean reads與OTU序列進行比對，將能比對上OTU的Reads提取出來，得到最終的比對后數(shù)據(jù)（mapped reads）。

1.4.2 蛋白質(zhì)組學分析 采集受試者空腹外周血5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心分離血清。在待測血清樣本中加入裂解液，沸水浴15 min，-20℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液。分裝樣品，-20℃低溫保存。鑒定每個樣本中蛋白，進行電泳并定量。取蛋白提取物30 μg，加入8 mol·L-1尿素200 μL并充分混合，-20℃下14 000 r/min離心15 min，濃縮液加入8 mol·L-1尿素200 μL，并以pH8.5的0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽稀釋后離心濃縮。濃縮液以胰蛋白酶消化，消化液以0.5 mol·L-1氯化鈉溶液50 μL沖洗后再離心。將得到的溶液與10%三氟乙酸結合并酸化，酸化后脫鹽、活化、平衡、肽洗和洗脫，以50%乙腈兩次漂洗活化，再以0.1%三氟乙酸水溶液兩次漂洗平衡。將富含多肽的溶液緩慢抽吸后洗滌脫鹽，然后洗脫真空干燥，再以0.1%甲酸30 μL懸浮。含脫鹽肽3 μL的溶液采用納流液相色譜儀系統(tǒng)進行在線納米流動液相色譜分離。將液相色譜儀連接到內(nèi)徑為100 μm的預柱上，填充5 μm C18樹脂，柱前反應后，以3 μm C18樹脂填充75 μm×15 cm毛細管柱，通過逐步梯度洗脫從柱前和分析柱上洗脫多肽。在Maxquant1.6的UniProt人類蛋白序列數(shù)據(jù)庫中搜索所有的原始文件，以Perseus統(tǒng)計各亞組的折疊變化。數(shù)據(jù)框中變化大于兩倍（＞2或＜0.5）的蛋白質(zhì)組被標記為顯著改變的蛋白質(zhì)。

1.4.3 代謝組學分析 采集受試者空腹外周血5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心分離血清，-80℃保存。取血清樣本200 μL，室溫下冰上解凍，加入-20℃過夜的甲醇乙腈（11）600 μL，渦旋30 s，4 ℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液置離心管中，真空離心濃縮干燥。干燥后加入乙腈/甲醇（80/20）-水混合溶液（1:1）復溶，渦旋60 s，4 ℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液4 μL進行LC-MS分析。

待測樣品采用ExionLCAD超高效液相色譜系統(tǒng)（Ultra Performance Liquid Chromatography，UHPLC）ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）進行分離，進樣盤溫度4℃；柱溫40℃；進樣量4 μL；流動相組成A：乙腈（含0.1%甲酸），B：水（含0.1%甲酸）；以0.3 mL/min的流速進行洗脫，洗脫梯度：0～1 min，95%B；1～20 min，95%～1%B；20～23 min，1%B。樣品經(jīng)UHPLC分離后用X-500R質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。通過單、多維統(tǒng)計分析篩選得到具有差異有統(tǒng)計學意義的離子（P＜0.05），差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.5且變量影響投影（variable influence on projection，VIP）＞1.0，作為潛在生物標記物。

1.4.4 腸道微生態(tài)-代謝組學聯(lián)合分析 對篩選得到的差異二級代謝物和16S測序獲得的差異具有統(tǒng)計學意義的屬水平菌群進行Spearman相關性分析，獲得差異菌群與差異菌群，差異代謝物與差異代謝物，差異代謝物與差異菌群之間的關系?；谟嬎憬Y果選擇合適的篩選條件，獲得最終的差異代謝物與差異代謝物的相關關系及網(wǎng)絡圖等。

1.4.5 蛋白質(zhì)組學-代謝組學聯(lián)合分析 通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）將代謝組學和蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)聯(lián)合起來，找到同一生物進程中發(fā)生顯著性變化的蛋白質(zhì)和代謝物，快速鎖定關鍵基因。主要分為以下幾步：（1）通過KEGG代謝通路進行蛋白質(zhì)組與代謝組關聯(lián)；（2）顯著差異數(shù)據(jù)和調(diào)控關系對數(shù)據(jù)篩選；（3）基因本體（gene ontology，GO）和KEGG富集分析；（4）關聯(lián)數(shù)據(jù)表達模式聚類；（5）關聯(lián)數(shù)據(jù)網(wǎng)絡圖繪制。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用秩和檢驗找出差異腸道菌群，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，同時對所有的P值進行錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discover rate，F(xiàn)DR）校驗。在差異蛋白分析中，生物學重復組間比較，將FC為1.2（上下調(diào)）且P＜0.05的蛋白視為差異表達蛋白。有生物學重復的兩組樣本之間的比較采用t檢驗。兩組樣本間的差異代謝物分析采用單變量分析，以FC＞1.5且P＜0.05作為篩選標準，從而篩選潛在的標志代謝物。聯(lián)合分析采用斯皮爾曼相關系數(shù) （Spearman correlation coefficient，SCC），相關系數(shù)以r表示，r的絕對值越大表明相關性越強。

2 結果

2.1 微生態(tài)組間差異

2.1.1 維恩圖 16S rDNA測序分析結果顯示，本研究中28個樣本共產(chǎn)生了254個OTU，患者組有34個獨有的OTU，對照組有67個獨有的OTU，兩組有153個共有OTU，相較于對照組，患者組的腸道菌群差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見圖1。

圖1 OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram

2.1.2 差異物種分析 組間群落差異 （LDA effect size，LEfSe）分析提示，患者組布魯菌、鞘氨醇單胞菌豐度水平明顯低于對照組，脫硫弧菌明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 LEfSe分析圖Fig.2 Plot of LEfSe analysis

2.1.3 差異物種Spearman相關分析 通過差異物種Spearman相關分析發(fā)現(xiàn)，埃希菌屬/志賀桿菌屬（Escherichia/Shigella） 與腸桿菌目（Enterobacteriales）存在正相關關系（r=0.52，P＜0.05），鏈球菌屬與放線菌屬也存在正相關關系（r=0.66，P＜0.05）。 見圖3。

圖3 豐度top 30的差異物種相關性系數(shù)分析Fig.3 Correlation coefficient analysis of differential species for top 30 abundance

2.2 蛋白質(zhì)組學組間差異

2.2.1 差異蛋白統(tǒng)計分析 蛋白定量分析提示，與對照組比較，患者組有9個上調(diào)蛋白和5個下調(diào)蛋白，共計14個差異蛋白。見圖4。

圖4 差異蛋白圖Fig.4 Differential protein map

2.2.2 差異蛋白基因功能分析 GO富集分析結果顯示細胞外間隙、細胞外外泌體、胞外區(qū)等通路上富集明顯。見圖5。

圖5 GO富集散點圖Fig.5 GO enrichment scatter plot

2.2.3 差異蛋白KEGG通路分析 KEGG富集分析結果顯示，在補體信號通路（complement and coagulation cascades）、Pertussis、 磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）等通路上富集明顯。見圖6。

圖6 KEGG富集散點圖Fig.6 KEGG enrichment scatter plot

2.3 代謝組學組間差異 將P＜0.05和FC＞1.5的代謝物作為差異代謝物，進一步采用MetDNA和OSI/SMMS軟件進行代謝物結構鑒定。見表1。差異代謝物強度比對柱狀圖見圖7。本項目共鑒定出差異代謝物13個，其中負離子模式下2個、正離子模式下11個。將得到的差異代謝物上傳到Metaboanalyst 4.0網(wǎng)站，進行代謝通路分析。分析結果顯示，差異代謝物主要涉及卟啉和葉綠素代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、視黃醇代謝、泛酸和輔酶A（coenzymeA，CoA）生物合成、脂肪酸降解、初級膽汁酸生物合成、脂肪酸生物合成、氨?；?tRNA生物合成和類固醇激素生物合成等代謝通路。見圖8。

表1 差異代謝物Tab.1 Differential metabolites

圖7 差異代謝物強度比對柱狀圖Fig.7 Histogram of differential metabolite intensity ratios

圖8 差異代謝物富集代謝通路示意圖Fig.8 Schematic diagram of the differential metabolite enrichment metabolic pathway

2.4 腸道微生態(tài)-代謝組學聯(lián)合分析

2.4.1 差異代謝物-差異菌群相關性分析 通過菌群-代謝物聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，瘤胃球菌與膽紅素存在正相關關系，與纈氨酸、糞卟啉存在負相關關系。鏈球菌與纈氨酸存在正相關關系。狄氏副擬桿菌與纈氨酸、（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）-二十二碳六烯酸存在負相關關系，與維生素A醛、氫化黃體酮存在正相關關系。見圖9。

圖9 差異代謝物-差異菌群關聯(lián)熱圖Fig.9 Heat map of differential metabolite-differential flora association

2.4.2 差異代謝物與菌群網(wǎng)絡調(diào)控分析 代謝物-菌群網(wǎng)絡調(diào)控分析提示，纈氨酸與鏈球菌、瘤胃球菌、氣單胞菌呈正相關，與狄氏副擬桿菌、嗜膽菌呈負相關。見圖10。

圖10 差異代謝物與菌群網(wǎng)絡調(diào)控圖Fig.10 Diagram of differential metabolite and colony network regulation

2.5 蛋白質(zhì)組學-代謝組學聯(lián)合分析 蛋白質(zhì)組學-代謝物聯(lián)合分析提示，患者組差異蛋白質(zhì)和信號通路包括基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、90kDa熱休克蛋白 β1（heat shock protein 90kDa β1，HSP90β1）、纖連蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）、整合素2B（integrin alpha2B，ITGA2B）、胰島素樣生長因子2受體（insulin-like growth factor 2 receptor，IGF2R）、巨噬細胞集落刺激因子1受體（macrophage colony-stimulating factor 1 receptor，CSF1R）、 血小板源生長因子受體 （platelet-derived growth factor receptor，PDGFRG）及下游代謝物雄烯二酮與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、PI3K-Akt、Ras信號通路、癌癥信號通路、細胞因子受體相互作用 （cytokine-cytokine receptor interaction）信號通路，這5條通路具有相關性。見圖11。

圖11 差異蛋白質(zhì)與差異代謝物關聯(lián)網(wǎng)路圖Fig.11 Differential protein and differential metabolite association network map

3 討論

脾虛濕滯證是肺癌的常見證候，臨床主要表現(xiàn)為面目肌膚淡黃，甚則晦暗不澤，肢體乏力，食少納呆，大便溏薄，舌質(zhì)淡苔薄，脈濡細等癥狀[5]。運用微生態(tài)組學研究中醫(yī)證候，有助于從客觀上揭示證候的本質(zhì)。腸道微生物是宿主不可忽視的一部分，符合中醫(yī)基礎理論中的“整體觀”[6]，而腸道菌群的現(xiàn)代研究拓展了“臟腑學說”中“肺與大腸相表里”的理論[7]。當腸道菌群失調(diào)時，宿主將出現(xiàn)中醫(yī)“脾虛濕滯證”的臨床表現(xiàn)。由此，筆者假設可通過觀察NSCLC脾虛濕滯證患者腸道微生態(tài)的差異，并研究該證型的生物學基礎，以此來闡釋證候的科學內(nèi)涵。

通過差異物種分析，本研究發(fā)現(xiàn)兩組受試者間具有顯著差異的菌屬共有3種，其中脫硫弧菌在NSCLC脾虛濕滯證患者中的豐度水平明顯高于對照組，而布魯菌、鞘氨醇單胞菌的豐度水平明顯低于對照組，這表明肺癌的發(fā)生發(fā)展可能與腸道中某些菌群的增加或者減少有關。

本研究運用代謝組學分析和16SrDNA測序分析對微生物及其代謝物的相互作用進行探究，并通過對差異代謝物與菌群進行網(wǎng)絡調(diào)控分析，結果發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬與多種代謝產(chǎn)物（纈氨酸、糞卟啉、膽紅素）具有相關性。纈氨酸的高攝取是腫瘤氨基酸代謝的特點之一，在機體蛋白質(zhì)合成和分解中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。有關證據(jù)表明，瘤胃球菌屬在肺癌患者腸道中含量較高[8]。特定的微生物和微生物失活可以通過破壞DNA、激活致癌信號傳導途徑和產(chǎn)生促進腫瘤的代謝物，從而推進相關腫瘤的發(fā)展[9-12]。因此,筆者推測瘤胃球菌屬可能通過調(diào)控多種代謝途徑影響肺癌的形成。

細胞信號通路失調(diào)會引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。為了進一步明確信號通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究在多組學水平上探索了信號通路在NSCLC脾虛濕滯證中的變化，通過KEGG代謝通路富集分析以及關聯(lián)數(shù)據(jù)網(wǎng)絡圖篩選，發(fā)現(xiàn)MAPK、PI3K-Akt、Ras信號通路、癌癥信號通路、細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）5 條信號通路。PI3K-Akt信號通路是公認的癌細胞存活第一信號通路，活化時能夠促進癌細胞增殖、加速細胞周期、促進腫瘤轉移和抑制細胞凋亡[13]。約90%的NSCLC細胞株存在PI3K-Akt信號通路的激活，倪琛琛等[14]檢測了100例NSCLC組織，發(fā)現(xiàn)PI3K及Akt蛋白陽性率分別為51%和23%，推測PI3K-Akt信號通路可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展、治療及預后密切相關。MAPK信號通路在許多細胞活動中發(fā)揮作用，其亞家族細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路在癌細胞增殖、遷移和腫瘤侵襲發(fā)生的幾個步驟中起著關鍵作用。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)，在188例肺腺癌腫瘤標本中，2/3以上至少有一個MAPK通路的基因發(fā)生突變，由此表明MAPK在肺癌的發(fā)生中可能起著非常重要的作用。綜上所述，筆者推測PI3K-Akt、MAPK通路的失調(diào)可能會導致肺癌的發(fā)生。

肺癌在中醫(yī)學內(nèi)屬“積聚”“肺積”等范疇，“扶正祛邪”是中醫(yī)學的基本治則之一。所謂“正盛邪自祛”，即通過提高正氣的方式驅(qū)邪外出；而“邪祛正自安”，即通過消除外邪的方式恢復健康?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療可以促進有益菌增殖或抑制病原菌，增加短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物生成，恢復腸道微生態(tài)平衡，發(fā)揮治療作用[16]。本課題組前期使用清肺合劑干預肺癌小鼠，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)有害菌屬另枝菌屬（Alistipes）豐度明顯減低，而益生菌屬嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）豐度明顯增高[17]。研究證實，嗜黏蛋白阿克曼菌具有改善代謝、調(diào)節(jié)宿主免疫反應和恢復腸道屏障的功能[18]。進一步研究可以以此為基礎，揭示中藥通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)從而發(fā)揮藥效的確切機制。

眾所周知，脾虛濕滯證是肺癌的常見證候，培土生金方藥治療脾虛濕滯證具有較好療效，本研究通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)NSCLC脾虛濕滯證患者PI3KAkt信號通路發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，補中益氣湯能夠降低肺癌組織中PI3K-Akt的表達[19]?；凇敖鹜料嗌崩碚?，筆者推測脾虛不運、濕邪留滯可能會導致肺組織中PI3K-Akt信號通路變化，從而進一步影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。由此可見，運用中醫(yī)理論結合生物標志物深入挖掘中醫(yī)治療肺癌的機制具有重要意義，可為臨床治療提供新的靶點。

疾病的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的網(wǎng)絡，腸道微生態(tài)、蛋白質(zhì)、代謝物等與疾病的病理生理機制密切相關。本研究通過多組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC脾虛濕滯證具有特異的腸道菌群、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。多組學聯(lián)合分析有助于推動肺癌機制和致病靶點的研究，也能為中醫(yī)藥防治肺癌提供理論支持和技術基礎。