紫色紅掌新品種明農(nóng)傾城的選育

姚鳳琴，林發(fā)壯*，鐘琳珊，陳昌銘，陳瑋婷，林輝鋒，周惠英

[1.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 福建 三明 365509； 2.福建省(山區(qū))作物遺傳改良與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗室， 福建 三明 365509； 3.古田縣林業(yè)局， 福建 寧德 352200)]

紅掌Anthuriumandraeanum原產(chǎn)于中南美洲，因具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，現(xiàn)已成為全球發(fā)展較快、需求量較高的五大設(shè)施花卉之一[1]。目前，紅掌已在中國大部分地區(qū)栽培種植，然而種源多為國外推廣的高度雜合的商業(yè)品種，基本處于被壟斷狀態(tài)[2]，這對紅掌產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展十分不利，因此積極培育推廣觀賞價值高，市場前景好，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種，并進(jìn)行國產(chǎn)化替代是強(qiáng)化紅掌種業(yè)的關(guān)鍵所在。但我國在紅掌新品種選育方面起步較晚，與國外相比還存在很大差距，目前通過自主選育的新品種還較少，已報道的僅有白馬王子[3]、小嬌紅掌[4]、粉黛[5]、夏焰[6]、明農(nóng)月華[7]等，遠(yuǎn)不能滿足市場對紅掌新品種多元化的需求。而且紅掌由于自身缺乏飛燕草色素基因F3′5′H，無法形成深紫色和藍(lán)色佛焰苞的紅掌[8]，所以直到目前為止，紫色紅掌一直是紅掌育種的難題，育出的紫色紅掌品種寥寥無幾，目前市場上比較暢銷的只有荷蘭安祖公司選育推廣的香妃，造成市場長期緊俏，供不應(yīng)求且種源受制于人，因此迫切需要選育觀賞價值高、市場前景好的紫色紅掌新品種，將豐富紅掌品種新型花色，彌補(bǔ)當(dāng)前紫色紅掌品種的缺乏；同時還能有效地推動我國紅掌新品種選育的研發(fā)力度和推進(jìn)紅掌產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，因具有數(shù)量大、二態(tài)性、穩(wěn)定遺傳和易于自動化檢測等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究[9]。紅掌基因組大，且無參考基因組，而簡化基因組測序(GBS，genotyping by sequencing)技術(shù)可以捕獲基因組重要區(qū)域，獲得大量的SNP，且無須已知基因組信息。因此通過簡化基因組測序構(gòu)建基于SNP標(biāo)記的系統(tǒng)進(jìn)化樹來確定種質(zhì)資源的親緣關(guān)系是紅掌高效育種的關(guān)鍵步驟。本研究通過雜交親本的選擇、人工授粉、無菌播種、單株篩選、擴(kuò)繁與多點(diǎn)試驗等，以期選育出觀賞價值高、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的紫色紅掌新品種，滿足消費(fèi)市場對紫色紅掌品種的需求，同時利用簡化基因組測序技術(shù)，鑒定后代苗的親緣關(guān)系，為紅掌新品種鑒定和構(gòu)建紅掌指紋圖譜等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的16份紅掌材料均來自三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉所紅掌種質(zhì)資源圃，品種信息見表1。

表1 供試材料名稱及來源

1.2 選育方法

紅掌新品種明農(nóng)傾城以Sensa為母本，該品種佛焰苞為紫色，具有雜交或自交結(jié)實(shí)率高、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的特性；以White King為父本，該品種佛焰苞為白色，具有花粉多、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的特性。

以觀賞價值高、抗病性強(qiáng)、適應(yīng)性好的紫色紅掌新品種為育種目標(biāo)，結(jié)合簡化基因組的SNP標(biāo)記開發(fā)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，選取性狀優(yōu)良的自然群體作為雜交親本，然后進(jìn)行人工授粉雜交、無菌播種、組培擴(kuò)繁、出苗、單株篩選等紫色紅掌新品種的選育。2014年經(jīng)單株篩選，編號為12-07-11的單株入選，命名為明農(nóng)傾城。

1.3 GBS測序及SNP位點(diǎn)分析

1.3.1文庫構(gòu)建流程及測序 (1)取明農(nóng)傾城、其母本Sensa、其父本W(wǎng)hite King和其他13個紅掌品種的嫩葉為試驗材料，使用CTAB法[10]提取基因組DNA，經(jīng)純度檢測，高質(zhì)量的DNA用于GBS文庫構(gòu)建和測序[11]；(2)每個樣本取250 ng，使用8 U MspI和8 U PstI HF(NEB)在30 μL反應(yīng)體系37℃下雙酶切反應(yīng)2 h，隨后在75℃下再孵育20 min，以滅活限制性酶；(3)隨后取20 μL酶切產(chǎn)物，添加1 μL的PstI Adaptor(0.1 mol·μ-1)、1.5 μL的Common Adaptor(0.1 mol·μ-1)、200 U的T4-DNA ligase、4 μL 10×T4-DNA ligase buffer混合，總體積為40 μL在22℃下進(jìn)行連接反應(yīng)2 h；(4)使用0.7體積的Sera-Mag SpeedBbeads(GE Healthcare Life Sciences)對連接產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并清除小于300 bp的片段，室溫下孵育5min，使用磁性支架將珠與上清液分離，并用200 μL新鮮制備的70% 乙醇洗滌3次。用40 μL 10 mol·mL-1Tris-HCl (pH 8.0)，從風(fēng)干珠中洗脫DNA；(5)對每個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為3 μL純化產(chǎn)物、16 μL H2O、5 μL 5×TaqMix(NEB)、0.5 μLPrimer1(10 mol·μ-1)和0.5 μLPrimer2(10 mol·μ-1)，首先在95℃下變性30 s，在95℃變性30 s，16個循環(huán)，引物在62℃退火20 s，片段在68℃延伸15 s，然后在68℃下最終片段延伸5 min；(6)在1.5%瓊脂糖凝膠上檢查8 μLPCR產(chǎn)物；(7)使用Qubit測定每個樣品的最終難度，僅對濃度>5.0 ng·μ-1的GBS文庫進(jìn)行測序，對檢測合格的樣品取相同總量的DNA(比如30 ng)混合成庫，使用步驟4對混合完的文庫進(jìn)行一次清理后即得到最終送測文庫；(8)使用Illumina Novaseq PE150 測序平臺對混合好的文庫進(jìn)行測序。

1.3.2SNP位點(diǎn)檢測及差異分析 (1)使用fastqc軟件對多樣品混池下機(jī)Raw Reads進(jìn)行質(zhì)控；使用stacks軟件包中的process_radtags程序，去除混池下機(jī)Raw Reads含有接頭序列的Reads，并依據(jù)建庫樣品與barcode對應(yīng)關(guān)系拆分為單樣品Raw Reads。(2)使用fastx toolkit軟件包中的fastx trimmer 程序，去除酶切位點(diǎn)序列以及 3′ 端fastqc質(zhì)控質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20的所有堿基，得到Clean Reads。(3)使用Stacks[12]等軟件構(gòu)建參考基因組，再使用bowtie2軟件將Clean Reads比對到參考基因組。(4)基于樣品與參考基因組的比對結(jié)果，利用GATK軟件Haplotype Caller程序生成每個樣品中的GVCF文件，再通過GATK軟件Genotype GVCFs程序進(jìn)行群體SNP檢測，對得到的群體SNP數(shù)據(jù)使用GATK軟件Select Variants程序?qū)︻A(yù)測結(jié)果進(jìn)行篩選，得到初步SNP。(5)為了降低 SNP檢測的錯誤率，使用VCFtools[13]軟件對獲得SNP分型結(jié)果進(jìn)行過濾，過濾條件為Reads支持?jǐn)?shù)(DP)不低于4；剔除MAF小于0.01的位點(diǎn)；剔除SNP分型缺失率高于20%的位點(diǎn)。(6)對SNP分型結(jié)果進(jìn)行差異位點(diǎn)統(tǒng)計分析，位點(diǎn)差異篩選標(biāo)準(zhǔn)一是基于進(jìn)行比較的兩組去掉基因型缺失的位點(diǎn)，二是組內(nèi)基因型一致。

1.3.3系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 依據(jù)SNP的基因分型結(jié)果，對個體SNP標(biāo)記進(jìn)行首尾相連，如果缺失相應(yīng)的位點(diǎn)，則用“-”代替。利用MEGA7.0軟件采用鄰接法[14](neighbor-joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹。通過treebest[15]軟件計算距離矩陣，進(jìn)化樹的可靠性通過bootstrap[16]法進(jìn)行檢驗(重復(fù)1 000次)。

1.4 品種比較試驗、多點(diǎn)區(qū)域試驗

1.4.1品種比較試驗 2014-2015年對明農(nóng)傾城與市場主流品種香妃進(jìn)行品種比較試驗。在成品花時分別隨機(jī)抽取明農(nóng)傾城、香妃各10盆(2株·盆-1)，測定其株高、冠幅、葉片長、葉片寬、葉柄長、葉柄直徑、花梗長、花梗直徑、佛焰苞長、佛焰苞寬、肉穗花序長及肉穗花序中部直徑等主要觀賞性狀。

1.4.2多點(diǎn)區(qū)域試驗 2016-2018年，在三明、寧德及龍巖對明農(nóng)傾城進(jìn)行多點(diǎn)區(qū)域栽培試驗。在標(biāo)準(zhǔn)溫室大棚中，每個試驗點(diǎn)種植明農(nóng)傾城100盆，每盆栽2株，按紅掌栽培進(jìn)行正常管理。同時大棚種植18個月時，每個試驗點(diǎn)隨機(jī)選取10盆，統(tǒng)計株高、冠幅、葉片長、葉片寬、葉柄長、葉柄直徑、花梗長、花梗直徑、佛焰苞長、佛焰苞寬、肉穗花序長及肉穗花序中部直徑等主要觀賞性狀。

1.4.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育過程

明農(nóng)傾城是由Sensa與 White King人工雜交后代單株選育，選育過程見圖1。2012年1月人工雜交，同年7月采收25粒成熟雜交種子，并進(jìn)行無菌瓶播，種子萌發(fā)后獲得18個雜交后代單株，分別對每個單株進(jìn)行小量組培擴(kuò)繁、出苗。2014年9月經(jīng)單株篩選，編號為12-07-11的單株入選，其性狀穩(wěn)定，適應(yīng)性好，抗寒性、抗病性強(qiáng)，觀賞性佳，命名為明農(nóng)傾城，并對其規(guī)?；庇?。2014-2015年對明農(nóng)傾城與近似品種香妃進(jìn)行品種比較試驗，2016-2018年在三明、寧德及龍巖對明農(nóng)傾城進(jìn)行多點(diǎn)區(qū)域試驗，2020年7月獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的植物新品種權(quán)證書。

圖1 明農(nóng)傾城選育過程Fig.1 Breeding processs of Mingnong Qingcheng

2.2 品種表現(xiàn)

2.2.1特征特性 明農(nóng)傾城株型中等、緊湊，生長勢強(qiáng)。從組培苗出瓶至第1朵花大約需8個月，成品花需15個月，平均株高48.84 cm、冠幅82.82 cm。嫩葉未完全展開時棕黃色(RHS比色卡152A)，完全展開時黃綠色(RHS比色卡144A)，成熟葉片深綠色(RHS比色卡NN137A)，有光澤、中等卵圓形(圖2)，平均長20.21 cm，寬13.24 cm；葉柄棕綠色，平均長28.53 cm。佛焰苞高于葉，花梗直立、棕紅色，平均長34.36 cm，直徑4.21 mm；佛焰苞有光澤、中等卵圓形，平均長10.39 cm，寬5.84 cm，初始和觀賞期為紫色(RHS比色卡N80A)，隨著成熟逐漸變?yōu)闇\紫色(RHS比色卡75A)，最后衰老變?yōu)榉圩仙?RHS比色卡65C)(圖2)；肉穗花序直立，平均長6.86 cm，中部直徑8.30 mm，花粉囊即將開裂時基部和先端的主色均為深紫色(RHS比色卡79A)，隨著成熟逐漸轉(zhuǎn)為淺紫色(RHS比色卡77C)。1葉1花，平均花朵數(shù)6.5個，常年開花；單花壽命60～120 d，最佳觀賞期30～35 d，花期持久。

圖2 明農(nóng)傾城葉片與花形態(tài)Fig.2 Morphology of the leaves and flowers of Mingnong Qingcheng

2.2.2品種比較試驗表現(xiàn) 由表2、圖3可知，明農(nóng)傾城株高、葉柄長和花梗直徑與香妃無顯著差異；冠幅、葉片長、葉片寬、葉柄直徑、花梗長、佛焰苞長、佛焰苞寬、肉穗花序長和肉穗花序中部直徑等與香妃差異顯著。另外，明農(nóng)傾城嫩葉為黃綠色(RHS比色卡144A)、中等卵圓形(圖3-A)，香妃嫩葉為綠色(RHS比色卡137A)、披針形(圖3-B)；明農(nóng)傾城的花梗長度顯著比香妃的長，明農(nóng)傾城的佛焰苞明顯比香妃的大，且明農(nóng)傾城的肉穗花序明顯比香妃的長且粗(圖3-C、圖3-D)。

表2 明農(nóng)傾城與香妃形態(tài)學(xué)特征比較

注：A為明農(nóng)傾城嫩葉；B為香妃嫩葉；C為明農(nóng)傾城的花；D為香妃的花圖3 明農(nóng)傾城與香妃嫩葉和花的形態(tài)比較Fig.3 Morphological comparison of the tender leaves and flowers between Mingnong Qingcheng and Xiangfei

2.2.3多點(diǎn)試驗表現(xiàn) 由表3可知，明農(nóng)傾城在3個試驗點(diǎn)的主要觀賞性狀表現(xiàn)較穩(wěn)定，其中只有株高和冠幅在寧德和三明2個試驗點(diǎn)之間有顯著差異，這可能與高海拔氣候有關(guān)，同等生長周期高海拔地區(qū)紅掌生長更快；其他性狀差異不顯著。此外，明農(nóng)傾城在3個試驗點(diǎn)的花色一致且夏季不褪色，株型中等、緊湊，生長勢強(qiáng)，未出現(xiàn)明顯的病蟲害現(xiàn)象。

表3 明農(nóng)傾城多點(diǎn)試驗主要性狀表現(xiàn)

2.2.4栽培技術(shù)要點(diǎn) 在溫室大棚中參照福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 1239-2012《紅掌盆花生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行栽培養(yǎng)護(hù)。選取生長健壯、剛剛展開的幼嫩葉片、葉柄為外植體進(jìn)行組培快繁，待生根苗高2～3 cm、根2～3條時出瓶移植，用甲基托布津或多菌靈可濕性粉劑800倍液消毒處理后，種植于128孔穴盤，種植后立馬澆透水，并用甲基托布津或多菌靈可濕性粉劑噴施1次；種植后10 d內(nèi)基質(zhì)保持濕潤，10 d后基質(zhì)保持干濕交替。待幼苗長至9 cm左右高時移至上口徑9 cm 的塑料小盆中種植，每盆2株；上盆后立馬澆透水，之后保持盆中基質(zhì)干濕交替。待苗長至15 cm高時移至上口徑13 cm 的塑料盆中種植；換盆后立馬澆透水，并合理密植。營養(yǎng)生長階段施用 N∶P∶K為20∶10∶20 的水溶肥，生殖生長階段施用 N∶P∶K為10∶30∶20 的水溶性肥。

注意防治細(xì)菌性疫病、莖基腐病等病害，病害發(fā)生后應(yīng)及時處理病株病葉，防止擴(kuò)散。注意防治紅蜘蛛、斜紋夜蛾、蚧殼蟲和薊馬等蟲害，可采用克螨特、吡蟲啉、阿維菌素等相應(yīng)殺蟲劑進(jìn)行防治。每種病蟲害用藥噴施連續(xù)使用不宜超過3次，可交替施用。

2.3 SNP位點(diǎn)檢測及差異分析

由表4可知，明農(nóng)傾城、Sensa和White King的測序序列總量為18 161 130條，總堿基數(shù)據(jù)量2.67 Gb；過濾后得到高質(zhì)量總堿基數(shù)據(jù)量為2.47 Gb，平均樣本數(shù)據(jù)量為0.82 Gb，堿基質(zhì)量值Q20和Q30分別平均為96.52%和91.29%。經(jīng)過 SNP位點(diǎn)檢測并過濾，共獲得27 969個SNP 位點(diǎn)。

從表5可知，比較明農(nóng)傾城與其母本Sensa的SNP總差異位點(diǎn)有2 835個，相同位點(diǎn)21 591個；明農(nóng)傾城與其父本W(wǎng)hite King的SNP總差異位點(diǎn)3 025個，相同位點(diǎn)22 344個；而父母本的SNP位點(diǎn)與子代相比，有更多的差異位點(diǎn)有3 794個，相同位點(diǎn)更少為20 618個；另外，明農(nóng)傾城紅掌與其母本Sensa和父本W(wǎng)hite King的SNP位點(diǎn)相似系數(shù)為88.39%、88.08%，表明明農(nóng)傾城在SNP位點(diǎn)基因型上與母本Sensa親緣關(guān)系更接近。

表4 紅掌測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

表5 明農(nóng)傾城、Sensa和 White King SNP差異位點(diǎn)統(tǒng)計

2.4 明農(nóng)傾城親緣關(guān)系分析

利用27 969個SNP標(biāo)記位點(diǎn)通過MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。對16份種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明這些種質(zhì)資源被劃分為3個居群，第一居群(綠色)包含9份紅掌種質(zhì)資源，包含Pink Champion(An107)、White Champion(An2)、Pandola(An124)、Cavalli(An139)、明農(nóng)紅唇(An21)、Casanova(An106)、明農(nóng)霞光(An36)、Piccolo(An143)和Smprem(An99)。第二居群(紅色)5份資源，包含Cherry Champion(An147)、Sensa(An80)、明農(nóng)傾城(An14)、明農(nóng)月華(An15)和 White King(An81)；其余2份種質(zhì)資源屬于第三居群(黑色) ，分別為ANTH42(An135)和Anouk(An188)(圖4)。

圖4 基于NJ法的紅掌16個個體系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on NJ of 16 individuals of A.andraeanum

3 討論與結(jié)論

紅掌為舶來品，市場種源基本處于被國外壟斷狀態(tài)，只有積極選育并推廣具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良新品種才能強(qiáng)化我國紅掌種業(yè)，而目前市場上比較暢銷的紫色紅掌品種只有荷蘭安祖公司的香妃，造成市場長期緊俏，供不應(yīng)求，因此迫切需要選育紫色紅掌新品種來豐富紅掌花色，彌補(bǔ)當(dāng)前紫色紅掌品種的缺乏。近些年來，隨著紅掌育種技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了紅掌誘變育種[17-18]、倍性育種[19-21]及分子育種[22-24]等研究的報道，但目前有性雜交和后代篩選仍是紅掌新品種選育的最主要手段[25-26]。本試驗采用常規(guī)雜交育種的方法以Sensa為母本、White King為父本雜交選育出紫色紅掌新品種明農(nóng)傾城。

利用GBS-seq 的SNP位點(diǎn)和進(jìn)化樹分析是鑒定品種間的親緣關(guān)系的可靠方法。本試驗對明農(nóng)傾城紅掌和其父母本進(jìn)行SNP分子鑒定及比較分析，結(jié)果顯示明農(nóng)傾城的SNP位點(diǎn)與其母本差異點(diǎn)要少于與其父本的差異，同時明農(nóng)傾城紅掌與其父母本相同的SNP位點(diǎn)要多于父母之間共同的位點(diǎn)，明農(nóng)傾城紅掌與其母本Sensa和父本 White King的SNP位點(diǎn)相似系數(shù)為88.39%、88.08%。另外，通過進(jìn)化樹分析，明農(nóng)傾城遺傳距離更接近母本Sensa。以上證實(shí)明農(nóng)傾城紅掌與其父母在分子水平存在差異，明農(nóng)傾城在SNP位點(diǎn)基因型上與母本Sensa親緣關(guān)系也更接近。

明農(nóng)傾城與主流品種香妃進(jìn)行品種比較試驗表明，明農(nóng)傾城比香妃的花梗更長、佛焰苞更大，且明農(nóng)傾城的肉穗花序顯著比香妃的長且粗。經(jīng)過多點(diǎn)區(qū)域試驗表明，明農(nóng)傾城在3個試驗點(diǎn)的主要觀賞性狀表現(xiàn)較穩(wěn)定，適宜于大面積推廣應(yīng)用，市場前景看好。