流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定水中鉻實(shí)驗(yàn)教學(xué)改進(jìn)研究*

王冬梅，葉長(zhǎng)江，周 歡，孫恩濤

(皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

重視實(shí)驗(yàn)實(shí)踐教學(xué)，提高大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力和實(shí)際操作能力，是一流本科人才培養(yǎng)的重要方面[1]。實(shí)驗(yàn)課不僅要保證開(kāi)出率，還要保證與理論課相輔相成，讓學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)課更好的理解運(yùn)用理論知識(shí)并提高動(dòng)手能力和實(shí)驗(yàn)技能。

化學(xué)發(fā)光法屬于分子發(fā)光光譜分析法的重要分支，具有靈敏度高、線性范圍寬、快速、易自動(dòng)化、低成本等特點(diǎn)，在醫(yī)藥[2]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[3]、食品檢驗(yàn)[4-5]等方面都有著廣泛的應(yīng)用。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀作為一種價(jià)格低，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高的檢測(cè)儀器，在各檢測(cè)單位及機(jī)構(gòu)十分常見(jiàn)，因此很多院校的儀器分析課開(kāi)設(shè)了“化學(xué)發(fā)光法測(cè)定水中鉻”這一實(shí)驗(yàn)內(nèi)容?；瘜W(xué)發(fā)光法測(cè)鉻不僅靈敏度和選擇性好，精密度和準(zhǔn)確度也很有保障，通過(guò)此實(shí)驗(yàn)可讓學(xué)生充分理解并掌握流動(dòng)注射進(jìn)樣技術(shù)與化學(xué)發(fā)光定量分析相結(jié)合建立的一種有效痕量分析技術(shù)。但在實(shí)際教學(xué)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的講授后，學(xué)生對(duì)儀器的優(yōu)勢(shì)及構(gòu)造認(rèn)識(shí)不深，只是機(jī)械的“按方抓藥”，對(duì)儀器的構(gòu)造及其背后的原理理解不深刻，并不能與學(xué)過(guò)的理論知識(shí)融會(huì)貫通，學(xué)習(xí)處于被動(dòng)，浮于表面，自然談不上對(duì)實(shí)驗(yàn)的興趣、熱情和主動(dòng)性[6]。為了加深學(xué)生對(duì)流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法優(yōu)勢(shì)及基本原理的理解，有必要在教學(xué)環(huán)節(jié)上作一系列的設(shè)計(jì)，在課程導(dǎo)入、構(gòu)造講解、知識(shí)拓展等方面需要教學(xué)改進(jìn)，通過(guò)結(jié)合實(shí)際案例，拆解關(guān)鍵組件，增加實(shí)驗(yàn)課的深入性、趣味性，激發(fā)學(xué)生對(duì)儀器分析實(shí)驗(yàn)的興趣，亦對(duì)其他類似實(shí)驗(yàn)課在實(shí)驗(yàn)教學(xué)改進(jìn)方面具有借鑒意義。

1 原實(shí)驗(yàn)方案

儀器分析實(shí)驗(yàn)“化學(xué)發(fā)光法測(cè)定水中鉻”，作為化學(xué)發(fā)光法中的一個(gè)較為經(jīng)典實(shí)例，在眾多高等教育實(shí)驗(yàn)教材中均有出現(xiàn)。本文的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)以2015年出版的王倫等人主編的高等學(xué)校教材—《化學(xué)實(shí)驗(yàn)》(第二版)中冊(cè)的實(shí)驗(yàn)四“流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定水中鉻”為基礎(chǔ)。

1.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1.1 試液配制

分別吸取100 μg·mL-1的鉻(Ⅲ)操作液0.0、0.5 mL、 1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL及2.0 mL水樣于50 mL容量瓶中，分別加入5 mL 2.5 mol·L-1KBr溶液，5 mL 1.0×10-2mol·L-1KBr溶液，二次水定容。

1.1.2 測(cè)定

儀器(示意圖見(jiàn)圖1)通電后30 min，打開(kāi)測(cè)試軟件，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置：調(diào)節(jié)高壓至500 V，增益至1，蠕動(dòng)泵采樣速度為30 r/min，進(jìn)樣速度為25 r/min，穩(wěn)定30 min。當(dāng)將系統(tǒng)中的管路與相應(yīng)的溶液接好后，在測(cè)量界面點(diǎn)擊開(kāi)始測(cè)量，系統(tǒng)自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)并自動(dòng)記錄光強(qiáng)-時(shí)間曲線。儀器停止后，在數(shù)據(jù)處理界面找出光強(qiáng)-時(shí)間曲線中的最大峰值。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀示意圖

每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，取平均值，繪制光強(qiáng)-濃度工作曲線，并計(jì)算出未知樣品的鉻的含量，最后用蒸餾水將儀器徹底清洗并關(guān)機(jī)。

1.2 不足之處

(1)原實(shí)驗(yàn)方案中只關(guān)注了儀器的操作步驟，沒(méi)有對(duì)化學(xué)發(fā)光分析法的特點(diǎn)進(jìn)行剖析?；瘜W(xué)發(fā)光本身的特點(diǎn)決定了化學(xué)發(fā)光必須與流動(dòng)注射進(jìn)樣器聯(lián)用才能具有較好實(shí)用價(jià)值。因此，對(duì)于流動(dòng)注射進(jìn)樣器的作用的分析應(yīng)是本實(shí)驗(yàn)較為重要的內(nèi)容。而原方案中沒(méi)有相關(guān)內(nèi)容介紹。

(2)對(duì)于儀器分析實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，儀器構(gòu)造和工作原理是除實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)理論以外的另一重要內(nèi)容。因此，本實(shí)驗(yàn)中，流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光儀的儀器構(gòu)造的詳細(xì)解析是非常重要且必要的。然而，原方案中的儀器構(gòu)造部分內(nèi)容(圖1)僅介紹了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)，而對(duì)發(fā)揮重要作用的流動(dòng)注射進(jìn)樣器部件卻未做相應(yīng)介紹，十分不利于學(xué)生整體理解掌握和熟悉操作流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光儀。

(3)精密度反映一組數(shù)據(jù)的離散程度，是評(píng)價(jià)定量方法的一項(xiàng)重要性能指標(biāo)。在實(shí)際評(píng)價(jià)時(shí)，常以“誤差棒”的形式體現(xiàn)在所繪制的圖中。在常見(jiàn)的儀器分析實(shí)驗(yàn)中，樣品進(jìn)樣時(shí)的狀態(tài)通常等同于樣品信號(hào)采集時(shí)的狀態(tài)，單個(gè)樣品分析結(jié)果的離散程度普遍不高，難以清晰反映在圖中。而化學(xué)發(fā)光法由于進(jìn)樣樣品僅為信號(hào)采集體系的眾多組成中的一部分，其單個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果離散程度較大，非常適合于精密度(誤差棒)的教學(xué)實(shí)踐。而原方案中，僅計(jì)算了三次平均測(cè)試結(jié)果的平均值，未能充分利用該實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)開(kāi)展定量分析法的性能評(píng)價(jià)教學(xué)。

2 改進(jìn)研究

2.1 流動(dòng)注射進(jìn)樣器的導(dǎo)入

對(duì)于本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，流動(dòng)注射進(jìn)樣器的引入是一個(gè)重要內(nèi)容。因此，進(jìn)樣器作用的介紹及合理的內(nèi)容導(dǎo)入是相對(duì)重要的。鑒于此，在介紹魯米諾在堿性條件下與過(guò)氧化氫產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光可以被部分過(guò)渡金屬離子(Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)等)催化而大幅增強(qiáng)以后，引入魯米諾試劑在刑事偵查上的應(yīng)用介紹。利用“絲血尋兇”技術(shù)解析來(lái)闡釋魯米諾試劑參與的化學(xué)發(fā)光體系在定性分析領(lǐng)域的應(yīng)用，同時(shí)提高學(xué)生對(duì)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的學(xué)習(xí)興趣。

在上述基礎(chǔ)上，告訴學(xué)生化學(xué)發(fā)光定性分析應(yīng)用較早而定量分析應(yīng)用較晚。引導(dǎo)學(xué)生分析化學(xué)發(fā)光用于定量分析可能存在的問(wèn)題。通過(guò)討論得出，化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度高度依賴于發(fā)光體系的混合狀態(tài)和信號(hào)采集時(shí)間點(diǎn)，傳統(tǒng)的手動(dòng)進(jìn)樣方式難以保證上述兩參數(shù)的重現(xiàn)性，因此用于定量分析時(shí)誤差大，實(shí)際應(yīng)用受到限制。

在上述背景下，介紹流動(dòng)注射進(jìn)樣技術(shù)的定義、發(fā)展歷史和工作原理。明確流動(dòng)注射進(jìn)樣代替?zhèn)鹘y(tǒng)手動(dòng)進(jìn)樣能夠很好提高化學(xué)發(fā)光體系混合狀態(tài)和信號(hào)采集時(shí)間點(diǎn)的重現(xiàn)性，保證定量分析的準(zhǔn)確性。如圖2，與流動(dòng)注射聯(lián)用后，化學(xué)發(fā)光法就能夠廣泛用于定量分析領(lǐng)域，在環(huán)境檢測(cè)和衛(wèi)生檢驗(yàn)方面發(fā)揮了重要作用。

圖2 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測(cè)Cr(Ⅲ)示意圖

2.2 換向閥的拆解與展示

實(shí)驗(yàn)所使用的儀器為流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光儀，主要由兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的部分組成：流動(dòng)注射進(jìn)樣器和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器。其中，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，主要由光電倍增管和暗盒組成，在學(xué)習(xí)過(guò)熒光儀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，學(xué)生是比較容易理解的。而流動(dòng)注射器部分主要由蠕動(dòng)泵、混合器和換向閥組成，其中前兩個(gè)部件是比較容易直觀理解的。因此，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，較好地理解換向閥的構(gòu)造和工作原理是學(xué)生理解和使用整臺(tái)儀器的關(guān)鍵所在。

為了更好地理解換向閥的結(jié)構(gòu)和工作原理，其拆解和展示十分必要。因此，實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，我們對(duì)流動(dòng)注射進(jìn)樣器的關(guān)鍵部件-換向閥進(jìn)行了拆解講解，重點(diǎn)介紹限位點(diǎn)(圖3A和3B)的設(shè)置及液體通路設(shè)計(jì)，讓學(xué)生更好地理解左右閥位變換、閥位切換前后不同液體流動(dòng)的走向。同時(shí)也捎帶介紹不同部件的材質(zhì)，讓學(xué)生理解聚丙烯(硬塑料)和聚四氟乙烯(軟塑料)的有機(jī)結(jié)合在液體流路中的密封作用。

圖3 換向閥的拆解

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的主要構(gòu)成部分為光電倍增管，可以有效地將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，從而被檢測(cè)。其光學(xué)檢測(cè)窗口及其配套的反應(yīng)池附件的展示有助于學(xué)生更好地理解化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器的構(gòu)造。如圖4A所示，圓形玻璃記為光電倍增管檢測(cè)窗口，其材質(zhì)為石英玻璃，其正上方放置反應(yīng)容器。對(duì)于靜態(tài)注射-化學(xué)發(fā)光法，為了方便試劑添加，反應(yīng)容器一般使用敞口玻璃皿。而在流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法中，敞口玻璃皿不能自動(dòng)排廢液，不利于儀器自動(dòng)化測(cè)試的現(xiàn)實(shí)。此外，皿狀容器體積大，死角多，體混合狀態(tài)難以控制，發(fā)光信號(hào)波動(dòng)大。因此，密閉管狀反應(yīng)池不僅可以自動(dòng)排液，還可以精準(zhǔn)控制混合狀態(tài)、保證反應(yīng)體系的實(shí)時(shí)更新(圖4B)。除此以外，反應(yīng)池的螺旋狀設(shè)計(jì)可以大大提高發(fā)光液體在檢測(cè)窗口的停留時(shí)間，增大了信號(hào)強(qiáng)度，提高了儀器靈敏度。

圖4 流通反應(yīng)池的拆解

2.3 總鉻含量測(cè)定內(nèi)容的引入

盡管Cr(Ⅲ)是地表水中鉻元素存在的重要價(jià)態(tài)，但其工業(yè)廢水或受其污染的水體中鉻元素通常還以另一種毒性更大的Cr(Ⅵ)價(jià)態(tài)存在。一般認(rèn)為，Cr(Ⅵ)的毒性是Cr(Ⅲ)的100倍，且更易被人體所吸收而在體內(nèi)蓄積，因此環(huán)境中總鉻的檢測(cè)更加具有現(xiàn)實(shí)意義。目前總鉻測(cè)定的通用方法主要為原子吸收光譜法和分光光度法。其中原子吸收光譜法儀器較為昂貴，需要復(fù)雜的前處理過(guò)程。而分光光度法主要是將Cr(Ⅲ)轉(zhuǎn)換成Cr(Ⅵ)后，與二苯碳酰二肼顯色進(jìn)行測(cè)定，靈敏度不高?；瘜W(xué)發(fā)光法由于靈敏度高、儀器簡(jiǎn)單，能夠?yàn)橹行⌒推髽I(yè)和基層環(huán)境檢測(cè)部門(mén)監(jiān)控環(huán)境水樣中總鉻含量提供較大便利。

為了更好地讓學(xué)生掌握化學(xué)發(fā)光法在環(huán)境檢測(cè)方面的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中將Cr(Ⅲ)檢測(cè)拓展為總鉻的檢測(cè)具有較好的現(xiàn)實(shí)意義，能夠一定程度提升教學(xué)效果。因此，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，我們使用亞硫酸氫鈉將工業(yè)廢水中Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)[7]，進(jìn)行模擬樣品總鉻的檢測(cè)。此部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)過(guò)試做，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，教學(xué)效果良好。

2.4 數(shù)據(jù)處理軟件及相關(guān)的分析參數(shù)的熟悉

本實(shí)驗(yàn)的教學(xué)對(duì)象是普通本科生中的高年級(jí)學(xué)生，引導(dǎo)學(xué)生使用常規(guī)數(shù)據(jù)處理軟件origin來(lái)對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪圖對(duì)實(shí)驗(yàn)類本科畢業(yè)設(shè)計(jì)的順利完成是非常有幫助的。使用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，通常要以多次測(cè)量取平均值的方式來(lái)提高準(zhǔn)確性?；瘜W(xué)發(fā)光教學(xué)實(shí)驗(yàn)的特性為origin作線性關(guān)系圖中“誤差棒”的理解和繪制提供較為理想的情境。首先通過(guò)講解，讓學(xué)生理解平均值相同的一組測(cè)量數(shù)據(jù)可以差別很大，精密度能夠反映的是一組數(shù)據(jù)的一個(gè)離散程度，作圖時(shí)可以以“誤差棒”的形式體現(xiàn)出來(lái)。作圖時(shí)，先讓學(xué)生掌握標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation, SD)、標(biāo)準(zhǔn)誤(Standard Error, SE)、置信區(qū)間(Confidence Interval, CI)是常用的誤差棒的代表形式，熟悉相應(yīng)的計(jì)算公式，通過(guò)計(jì)算掌握三者間的區(qū)別與聯(lián)系。在上述三種表現(xiàn)形式中，SD是誤差棒使用最多的代表形式，反映的是數(shù)據(jù)點(diǎn)圍繞均值的分布狀況。同時(shí)也應(yīng)該指出，為了避免混淆，使用誤差棒時(shí)應(yīng)該明確指出其代表的具體概念。

除了上述誤差棒的理解與掌握外，本實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，也可以讓學(xué)生進(jìn)一步掌握使用origin軟件來(lái)處理所得數(shù)據(jù)，繪制化學(xué)發(fā)光信號(hào)隨Cr(Ⅲ)濃度增加的變化圖及線性關(guān)系圖。作為一種重要的科研數(shù)據(jù)處理軟件，在本科中的高年級(jí)階段逐漸強(qiáng)化origin使用是非常有必要的，能夠提高學(xué)生在大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目和畢業(yè)論文寫(xiě)作中的數(shù)據(jù)處理和分析能力。

3 結(jié) 語(yǔ)

我們結(jié)合實(shí)際教學(xué)實(shí)踐，對(duì)流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測(cè)水中的鉻離子儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行了改進(jìn)。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好激發(fā)學(xué)生對(duì)化學(xué)發(fā)光分析法的學(xué)習(xí)興趣，加深對(duì)化學(xué)發(fā)光用于定性和定量分析的理解，使得學(xué)生能夠較好理解流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光儀器的構(gòu)造、工作原理及優(yōu)勢(shì)。實(shí)施于教學(xué)之后，學(xué)生反饋良好，對(duì)儀器的理解更加深入透徹。