山西連翹葉無(wú)機(jī)元素指紋圖譜的建立及主成分分析*

張國(guó)香，郭俊俊

(山西省科技資源與大型儀器開(kāi)放共享中心，山西 太原 030000)

連翹為木犀科連翹屬落葉灌木，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效[1-2]，連翹葉是連翹的干燥葉，其莖葉與果實(shí)的成分具有一致性，連翹葉亦可藥用[3]。山西是連翹道地藥材生產(chǎn)地，果實(shí)制成中藥材后，大量的連翹葉被廢棄[4-5]。連翹葉不僅有抗氧化、抗衰老、抗癌、抑菌、降血糖等的功效[6-7]，而且還有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，已被列為藥食同源原料[8-9]。目前有關(guān)連翹葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究已有很多報(bào)道，主要集中在有機(jī)活性成分的研究[10-13]。研究表明，除活性成分外，中藥植物體內(nèi)的無(wú)機(jī)元素尤其是某些微量元素與中藥材的藥效有著緊密的聯(lián)系[14-16]，很多藥物在人體內(nèi)發(fā)揮藥效時(shí)需要以無(wú)機(jī)元素為基礎(chǔ)，對(duì)藥效的發(fā)揮起著協(xié)同或拮抗作用[17-18]。目前關(guān)于山西連翹葉無(wú)機(jī)元素指紋圖譜的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此研究和掌握連翹葉中無(wú)機(jī)元素的組成有助于其質(zhì)量和安全性評(píng)價(jià)，為連翹葉資源開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)

本試驗(yàn)采用ICP-MS法測(cè)定了山西連翹10個(gè)主產(chǎn)區(qū)的連翹葉中13種無(wú)機(jī)元素的含量，并繪制了無(wú)機(jī)元素指紋圖譜，利用夾角余弦法計(jì)算了不同地區(qū)連翹葉的相似度，采用spss22.0統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行了元素相關(guān)性和主成分分析。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

Perkin Elmer NexTON 300X ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)PerkinElmer公司；DigiBlock ED54電熱消解儀，Lab Tech公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；內(nèi)標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；濃硝酸(優(yōu)級(jí)純)，成都市科龍化工試劑廠；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

樣品：選取山西連翹主產(chǎn)地安澤、陵川、長(zhǎng)子等10個(gè)縣區(qū)的連翹葉，見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

將晾干的連翹葉粉碎后過(guò)60目篩，稱(chēng)取樣品約0.5 g(精確到0.0001 g)于50 mL玻璃消解管中，加入5 mL濃硝酸加蓋置于電熱消解儀上，浸泡過(guò)夜，30 min升至120 ℃保持1 h， 30 min由120 ℃升至150 ℃保持1 h后，打開(kāi)蓋子趕酸至近干，消解結(jié)束后用2%硝酸溶液定容至25 mL，作為待測(cè)液。同時(shí)平行做空白試液。

1.2.2 ICP-MS儀器參數(shù)

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作條件設(shè)定：射頻功率1100 W，等離子體氣流速度15.0L/min，霧化氣流速1.0 L/min，輔助氣流速1.0 L/min，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3 檢出限

在1.2.2條件下平行測(cè)定空白溶液11次，以測(cè)定結(jié)果的 3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度值為13種元素的檢測(cè)限(LOD)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將多元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋后配制成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，按1.2.2儀器條件進(jìn)行測(cè)定，采用在線內(nèi)標(biāo)法用三通將內(nèi)標(biāo)液和標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后進(jìn)入ICP-MS進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，各元素線性關(guān)系均良好，相關(guān)系數(shù)0.9953～0.9999。

1.2.5 精密度和回收率

稱(chēng)取樣品(S3)約0.5 g，按1.2.1前處理和1.2.2儀器條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算各元素含量RSD，結(jié)果見(jiàn)表2，方法精密度(RSD)為1.36%～7.66%，符合要求。

稱(chēng)取樣品(S3)約0.5 g，平行制備6份，分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.1前處理，在1.2.2儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率(見(jiàn)表2)。各元素加標(biāo)回收率88.44%～105.63%，符合要求。

表2 13種元素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用ICP-MS法測(cè)定元素含量，以元素種類(lèi)為橫坐標(biāo)，相對(duì)含量為縱坐標(biāo)通過(guò)Origin8.0軟件繪制無(wú)機(jī)元素指紋圖譜；通過(guò)SPSS22.0軟件分析各元素之間的相關(guān)性和主成分分析。

1.4 指紋圖譜相似度計(jì)算

利用SPSS22.0軟件計(jì)算元素指紋圖譜與元素標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似度，計(jì)算原理為夾角余弦法[19]。兩向量的夾角余弦于公式(1)：

(1)

式中：X為N維向量(x1,x2,.........xn)；X·Y表示兩向量的內(nèi)積，|X|表示向量的模；cosα越接近1，說(shuō)明兩個(gè)向量越相似。

2 結(jié)果與討論

2.1 連翹葉中無(wú)機(jī)元素的含量

10個(gè)地區(qū)連翹葉樣品中13種無(wú)機(jī)元素的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，連翹葉中13種無(wú)機(jī)元素含量存在一定的差異，其中含有較豐富的K、Ca、Mg人體必須的常量元素，其次含量較高的為Fe、Zn、Mn、Cu微量元素，而Se、Mo、Co、Sn元素的含量較低。同一元素在不同產(chǎn)地之間的含量存在較大差異，如K元素含量最高值為13160.28 μg/g，最低值為9967.23 μg/g。

表3 連翹葉中無(wú)機(jī)元素含量

續(xù)表3

為了進(jìn)一步分析連翹葉中各元素之間的相關(guān)性，利用SPSS22.0計(jì)算13種元素的Pearson相關(guān)系數(shù)(表4)。結(jié)果表明不同地區(qū)連翹葉中無(wú)機(jī)元素之間存在一定的相互作用關(guān)系。Mg-K、Ni-Cu、和Se-Fe元素間達(dá)到極顯著正相關(guān)，Cu-Ca、Cu-Zn、Ni-Ca、和Co-Fe元素間達(dá)到顯著正相關(guān)。連翹葉中無(wú)機(jī)元素間未出現(xiàn)極顯著或顯著負(fù)相關(guān)。

表4 各元素之間的Pearson相關(guān)系數(shù)

2.2 連翹葉中無(wú)機(jī)元素指紋圖譜的建立及相似度分析

由于連翹葉中13種無(wú)機(jī)元素含量差別較大，為了使無(wú)機(jī)元素指紋圖譜更加直觀，便于繪制，將不同元素的含量擴(kuò)大或縮小至統(tǒng)一數(shù)量級(jí)(K縮小1000倍，Ca、Mg縮小100倍，F(xiàn)e縮小10倍，Se、Sn擴(kuò)大1000倍，Cu、Mn、Mo、Co、V、Ni擴(kuò)大10倍)，以元素種類(lèi)為橫坐標(biāo)，相對(duì)含量為縱坐標(biāo)，繪制指紋圖譜(圖1A)。雖然不同地區(qū)連翹葉在元素含量上存在一定差異，但無(wú)機(jī)指紋圖譜峰形相似，其走勢(shì)基本一致。為了進(jìn)一步比較相似度，將10個(gè)地區(qū)連翹葉樣品以平均數(shù)構(gòu)建連翹葉無(wú)機(jī)元素對(duì)照指紋圖譜(圖1B)，通過(guò)夾角余弦法計(jì)算樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，值越接近1，說(shuō)明相似度越高。

圖1 連翹葉無(wú)機(jī)元素指紋圖譜(A)和無(wú)機(jī)元素對(duì)照指紋圖譜(B)

采用向量夾角余弦法由公式(1)計(jì)算出10個(gè)產(chǎn)地連翹葉樣品的無(wú)機(jī)元素指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。從表中可以看出，山西連翹葉的無(wú)機(jī)元素指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度取值為0.983～0.999，即各連翹葉樣品之間的相似度均在0.9以上，說(shuō)明山西不同地區(qū)間無(wú)機(jī)指紋圖譜的相似度較高。

表5 連翹葉元素指紋圖譜相似度分析

2.3 連翹葉中無(wú)機(jī)元素主成分分析

進(jìn)一步對(duì)10個(gè)地區(qū)連翹葉中13種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行PCA 分析(表6)。主成分分析法能夠很好的從幾十種元素和不同地區(qū)的樣品中篩選出特征元素[20]，根據(jù)Kaiser準(zhǔn)則(特征值大于1)及累積貢獻(xiàn)率準(zhǔn)則(累計(jì)貢獻(xiàn)率一般大于85%)，前5個(gè)主成分初始特征值均大于1且累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)90.087%，說(shuō)明前5個(gè)成分代表了山西10個(gè)不同地區(qū)連翹葉無(wú)機(jī)元素90%的變量信息。因此提取前5個(gè)主成分因子進(jìn)行分析。前5個(gè)主成分的因子負(fù)荷量見(jiàn)表7，第1主成分因子負(fù)荷量較大的是Cu、Ni，第2主成分因子負(fù)荷量較大的Se、Fe，第3主成分因子負(fù)荷量較大的Mg、K，第4主成分因子負(fù)荷量較大的是V，第5主成分因子負(fù)荷量較大的是Mn。因此Cu、Ni、Se、Fe、Mg、K、V、Mn為山西連翹葉的特征無(wú)機(jī)元素。

表6 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率

2.4 討 論

本研究建立的山西連翹葉無(wú)機(jī)元素指紋圖譜是對(duì)連翹葉整體質(zhì)量控制的有力補(bǔ)充，山西連翹葉篩選出的8種特征元素，其中K、Mg是人體必需常量元素，Se增強(qiáng)機(jī)體免疫力，影響抗氧化系統(tǒng)，F(xiàn)e、Mn能與藥材中的有機(jī)成分形成絡(luò)合物，從而起到抗菌作用，Ni影響Fe的吸收[20]。這些元素與連翹葉具有抗氧化、抗衰老、抗癌等作用相一致。連翹葉無(wú)機(jī)元素中有7對(duì)呈顯著正相關(guān)，無(wú)顯著負(fù)相關(guān)，表明連翹葉中的無(wú)機(jī)元素能很好的發(fā)揮協(xié)同作用，因此，可認(rèn)為連翹葉所含的這些無(wú)機(jī)元素是其功效物質(zhì)基礎(chǔ)之一?？蔀樘接戇B翹葉藥效藥性的機(jī)理提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。目前關(guān)于連翹葉中藥效成分與特征元素的相關(guān)性分析還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本研究采用ICP-MS法同時(shí)測(cè)定山西連翹葉中13種無(wú)機(jī)元素，結(jié)果表明，山西連翹葉含有豐富的常量元素和人體所必需的微量元素。通過(guò)對(duì)所含無(wú)機(jī)元素的組成特點(diǎn)分析，建立了無(wú)機(jī)元素指紋圖譜，通過(guò)PCA確定了山西連翹葉中特征元素，分別為Cu、Ni、Se、Fe、Mg、K、V、Mn，為后續(xù)研究藥效之間的協(xié)同作用提供了數(shù)據(jù)參考。