侗藥馬卡列丙總皂苷的提取工藝研究*

羅貞貴，李 星，曾雅靜，許培增，周偉道，何 碩，劉 冰

(湖南醫(yī)藥學院藥學院，湖南 懷化 418000)

馬卡列丙Duhaldeanervosa(WallichexCandolle)A．Anderberg為菊科羊耳菊屬顯脈旋覆花的全草，廣泛分布于中國湖南、貴州、云南、廣西等地，是一種多民族的民間常用藥材[1-2]。馬卡列丙在云南、貴州等地是苗族常用藥，俗稱“小黑藥”、“草威靈”等，根供藥用，有滋補功效?！对颇现胁菟庍x》記載，此藥祛風濕，通經(jīng)絡，消積止痛，治風濕性關節(jié)炎、腰腿痛、胃痛、消化不良、骨鯁喉；《貴州民間藥物》中，該藥補氣血，止汗。湖南通道地區(qū)馬卡列丙又稱毛秀才，是侗鄉(xiāng)從古到今常用的跌打損傷特效單方良藥，常用于跌打損傷，傷目出血，骨折，肚痛[3-4]。

馬卡列丙中已報道的主要化學成分為揮發(fā)油類、黃酮類、苯丙素類、三萜和甾體類等成分[5-7]。譚紫玲等[8]已對馬卡列丙的化學成分進行了預實驗，初步確定馬卡列丙含有皂苷類化學成分，但有關馬卡列丙總皂苷的研究尚未見報道。已有研究報道，皂苷類成分具有廣泛的生理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等。如重樓皂苷可通過線粒體途徑近而實現(xiàn)誘導腫瘤細胞凋亡[9]。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷也可通過血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有效的治療阿爾茨海默等疾病[10]。因此本對馬卡列丙總皂苷的提取工藝進行研究，對闡明侗藥馬卡列丙有效成分、對下一步進行活性研究、從而尋找新藥源具有重要意義。

1 實驗材料與儀器

1.1 藥 材

馬卡列丙Duhaldeanervosa干燥根和莖于 2018 年12 月購于云南，經(jīng)湖南醫(yī)藥學院侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室生藥學專家汪冶教授鑒定為菊科顯脈旋覆花，根(編號為 2018120401)標本存于藥學院。

1.2 試 劑

人參皂苷Re標準品(含量≥98.0%，批號B04D9S76499)，上海源葉生物科技有限公司、甲醇、石油醚(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司；95%乙醇、高氯酸、硫酸，成都金山化學試劑有限公司；香草醛(分析純)，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；實驗用水均為超純水。

1.3 儀 器

AUW120D型電子分析天平，日本島津有限公司；MY-50分級連續(xù)投料粉碎機，廣州市揚鷹醫(yī)療儀器有限公司；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋，北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；L53R醫(yī)用離心機，長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機有限公司；UV752N紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Mighty-10超純水機，上海礫鼎水處理設備有限公司。

2 實驗方法

2.1 含量測定

2.1.1 馬卡列丙總皂苷制備流程

取經(jīng)粉碎的馬卡列丙粉末(過60目篩)，加3倍粉末體積的石油醚索式提取脫脂，濾渣40 ℃減壓干燥。取脫脂后的馬卡列丙粉末，加水100 ℃回流提取1.0 h，多次離心，直至上清液無色，合并上清液，減壓濃縮至干燥，即得馬卡列丙總皂苷粗品。

2.1.2 標準曲線繪制

標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液20 μL、40 μL、 80 μL、120 μL、160 μL、200 μL,分別置于具塞試管中,低溫揮去溶劑,加人1%香草醛高氯酸試液0. 5 mL,置60 ℃恒溫水浴上充分混勻后加熱15 min,立即用冰水冷卻2分鐘,加入77%硫酸溶液5 mL,搖勻;以相應試劑作空白,照紫外-可見分光光度法(通則0401),在540nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標繪制標準曲線[11]。得回歸方程為 A= 0.0266C-0.03，R2= 0.9996。表明該化合物在 20～ 120 μg范圍內(nèi)存在很好的線性關系。

2.2 單因素試驗

取1.00 g 馬卡列丙粉多份，其他因素不變的情況下，按“2.1”項下方法實驗，分別考察提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時間以及提取次數(shù)對馬卡列丙總皂苷得率的影響，以總皂苷提取率為指標進行單因素試驗。

2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選取對試驗影響較大的因素通過 L9(34)正交表進行試驗。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 溶劑的選擇

固定料液比1:20，提取時間1 h，提取溫度 60 ℃，考察水和不同濃度的乙醇對馬卡列丙總皂苷得率的影響。結果見圖1。結果表明，乙醇體積分數(shù)越小，總皂苷得率越高，水的提取效率高于乙醇溶液，隨著乙醇濃度增加時，馬卡列丙總皂苷得率呈下降趨勢。可能原因是隨著乙醇濃度增加，導致蛋白質等物質變性，吸附皂苷，不利于其溶出，得率下降[12]。故用水代替乙醇溶液繼續(xù)試驗。

圖1 乙醇濃度對總皂苷得率的影響

3.1.2 料液比

固定提取時間1 h，提取溫度60 ℃，考察料液比1:10、 1:15、1:20、1:25、1:30對馬卡列丙總皂苷得率的影響。結果見圖2。在料液比1:20時，馬卡列丙總皂苷得率值最大，隨后料液比繼續(xù)降低時，總皂苷得率呈下降趨勢?？赡苁怯捎谌芤毫康脑黾?，加大了其與原料的接觸面積及液體傳質推動力，利于皂苷的溶出，在料液比一定時，得率最高；之后溶液量的繼續(xù)增加，會使原料吸附皂苷使其不易溶出[13]，得率下降。

圖2 料液比對總皂苷得率的影響

3.1.3 提取溫度

固定提取時間 1 h，料液比 1:20，考察提取溫度60，70，80，90，100 ℃對馬卡列丙總皂苷得率的影響。結果見圖3。在提取溫度100 ℃時，馬卡列丙總皂苷得率最大。說明溫度的升高能促進馬卡列丙總皂苷的提取[14]。

圖3 提取溫度對總皂苷得率的影響

3.1.4 提取時間

固定料液比1:20(g·mL-1)，提取溫度 100 ℃，考察提取時間 1，1.5，2，2.5，3 h對馬卡列丙總皂苷得率的影響。結果見圖 4。結果顯示，1 h 時，馬卡列丙總皂苷得率最大，當時間繼續(xù)延長時，總皂苷得率呈下降趨勢。在提取時間較短時，可能皂苷與多糖、蛋白質等物質結合不易溶出；隨時間的延長，原料中的皂苷大量快速溶出，溶液趨于飽和，同時長時間高溫會導致皂苷降解，使其得率下降[15]。

圖4 提取時間對總皂苷得率的影響

3.1.5 提取次數(shù)

固定提取時間1 h，提取溫度60 ℃，料液比1:20(g·mL-1)，考察提取次數(shù)1、2、3、4次對馬卡列丙總皂苷得率的影響。結果見圖 5。結果顯示，隨著提取次數(shù)增加，馬卡列丙總皂苷得率呈現(xiàn)增加的趨勢，但幅度較小。為節(jié)省時間和減少溶劑用量，故之后的實驗選擇提取次數(shù)為1次。

圖5 提取次數(shù)對總皂苷得率的影響

3.2 正交試驗設計

將馬卡列丙加熱回流的工藝路線，通過L9(34)正交表進行試驗設計，以馬卡列丙總皂苷得率為醇提評價指標，提取溫度(A)、料液比(B)、提取時間(C)為影響因素進行優(yōu)化，因素水平表見表1。

表1 馬卡列丙提取工藝因素水平表

3.3 正交試驗結果

稱取馬卡列丙藥材9份，每份1.00 g，按L9(34)正交表的條件提取，提取溶劑為水，提取1次，多次離心至上清液無色透明，合并上清液，定容至250 mL，備用。共得到9份提取液，按“2.1”項下方法測定馬卡列丙總皂苷含量。結果見表2，方差分析見表3。

表2 馬卡列丙總皂苷提取L9(34)正交試驗及結果

表3 馬卡列丙提取工藝正交試驗方差分析表

由表2和表3可見，以總皂苷含量為指標，馬卡列丙的正交提取實驗中考察因素的影響大小依次為：A提取溫度>C液料比>B提取時間，且A因素具有顯著性差異(P<0.05)。A因素中A3>A2>A1，故選擇A3；B因素中B3>B1>B2，故選B3；C因素中，C2>C3>C1，故選C2，由此可推出，A3B3C2為最優(yōu)方案，即提取溫度100 ℃，料液比1:25，提取時間 1.0 h。

3.4 最佳工藝驗證試驗

稱取馬卡列丙藥材3份，每份10.00 g，按照以上結果分析的最佳工藝提取，即提取溫度100 ℃，料液比1:25，提取時間 1.0 h，測定總皂苷含量，結果見表4。

表4 馬卡列丙提取工藝驗證試驗結果

通過表4可以看到最佳的工藝條件下所得到的總皂苷含量處于較高水平，且RSD值很小，說明本提取工藝合理、可靠。

4 結 論

通過查閱文獻，譚紫玲等[8]已對馬卡列丙的化學成分進行了預實驗，初步確定馬卡列丙含有皂苷類化學成分，但有關馬卡列丙總皂苷的研究尚未見報道。因此，通過單因素和正交試驗，確定最佳的提取工藝，為馬卡列丙總皂苷的開發(fā)利用奠定基礎。

在單因素試驗中，考察水和不同濃度乙醇對馬卡列丙總皂苷得率的影響，隨著乙醇濃度增加時，馬卡列丙總皂苷得率呈下降趨勢，故選擇水為提取溶劑。提取次數(shù)相比較料液比、提取時間、提取溫度這3個因素時，不是馬卡列丙總皂苷提取的主要因素，為了節(jié)省時間和減少溶劑用量，故提取次數(shù)選擇為1次。綜合以上單因素試驗和正交試驗結果，確定馬卡列丙總皂苷的最佳工藝：提取溶劑為水，料液比1:25，提取溫度100 ℃，提取時間 1.0 h，提取1次，總皂苷提取率可達 6.40%。