TNF-α和檳榔堿對口腔黏膜成纖維細胞增殖和羥脯氨酸蛋白表達的影響及姜黃素對其影響的作用

夏麗 王金竹 李冰

口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis, OSF)是一種是具有癌變傾向的口腔黏膜病變，累及部位包括口腔、口咽部和食道黏膜。纖維化能夠?qū)е驴谇火つ?、黏膜下層、肌層等組織的纖維彈性喪失，臨床上可表現(xiàn)為口干、灼痛、進刺激性食物疼痛、進行性張口受限、吞咽和發(fā)音困難等癥狀[1]。OSF的病因不明確，流行病學調(diào)查證實，咀嚼檳榔是其主要的致病因素。OSF病變過程主要伴有炎癥反應(yīng)、氧化損傷和纖維性變。目前治療方法多采用局部注射的保守治療和手術(shù)治療，還沒有有效的治愈方法。姜黃素(curcumin)是一種從姜黃根莖中提取和分離出來的化合物[2]，是姜黃的主要活性成分之一。姜黃素具有廣泛的生物學作用，如抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎、消毒、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗真菌等[3-4]。

對OSF的研究，需要建立口腔黏膜下纖維化的細胞模型。本研究采用TNF-α和檳榔堿模擬外界環(huán)境對口腔黏膜成纖維細胞的刺激作用，評價兩種方法在建立OSF細胞模型中的作用，并探索姜黃素在兩種OSF細胞模型中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與主要材料、儀器

實驗細胞：人口腔黏膜成纖維細胞(武漢普諾賽)。胎牛血清(Gibco，美國)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；重組人TNF-α(北京義翹神州科技)；檳榔堿、姜黃素(成都曼思特)；CCK-8試劑盒(DoJinDo，日本)；MTT試劑盒(上海碧云天)；人羥脯氨酸(Hyp)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海江萊)；生物倒置顯微鏡(Olympus，德國)；酶標儀(深圳雷杜)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人口腔黏膜成纖維細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長至80%消化傳代。

1.3 細胞增殖檢測

CCK-8檢測：選用對數(shù)生長期細胞， 4 000 個/孔接種于96 孔細胞板中，實驗分為：對照組，TNF-α 100、1 000、10 000 U/mL組和對照組，檳榔堿10、 20、 40 μg/mL組。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、 48、 72 h后向每孔加入10 μL CCK-8反應(yīng)液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。MTT實驗檢測：按上述方法培養(yǎng)消化細胞，分為1 000 U/mL TNF-α組和40 μg/mL檳榔堿組，兩組細胞計數(shù)4 000 個/孔接種于96 孔細胞板中，兩組分為對照組， 10、 20、 40 μmol/L姜黃素組。培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、 24、 48 h后向每孔加入10 μL MTT反應(yīng)液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標儀測定在595 nm處的吸光度。

1.4 羥脯氨酸蛋白檢測

取各組48 h的細胞培養(yǎng)上清，采用人羥脯氨酸(Hyp)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 2 種模型中口腔黏膜成纖維細胞的變化

2.1.1 TNF-α對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響 不同濃度TNF-α作用于口腔黏膜成纖維細胞， CCK-8結(jié)果顯示，在24 h時，TNF-α濃度為1 000 U/mL和10 000 U/mL能夠顯著促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖；在48和72 h時，TNF-α濃度為100、 1 000、 10 000 U/mL均能夠促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖(圖 1)。

圖 1 TNF-α及檳榔堿對人口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響(* P<0.05)

2.1.2 檳榔堿對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響 不同濃度的檳榔堿作用于口腔黏膜成纖維細胞，CCK-8結(jié)果顯示(圖 1)，在24、 48和72 h時，檳榔堿濃度為10、 20、 40 μg/mL均能夠抑制口腔黏膜成纖維細胞的增殖。

2.1.3 TNF-α和檳榔堿對口腔黏膜成纖維細胞羥脯氨酸合成的影響 選擇TNF-α濃度為1 000 U/mL，檳榔堿濃度為40 μg/mL組，與對照組比較羥脯氨酸的合成，結(jié)果顯示(圖 2)，口腔黏膜成纖維細胞羥脯氨酸的合成，在TNF-α刺激下增多，在檳榔堿作用下減少。

圖 2 TNF-α和檳榔堿對口腔黏膜成纖維細胞羥脯氨酸合成的影響

2.2 姜黃素對兩種模型口腔黏膜成纖維細胞的影響

2.2.1 不同濃度姜黃素對TNF-α刺激的口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響 不同濃度的姜黃素作用于濃度為1 000 U/mL TNF-α刺激的口腔黏膜成纖維細胞，MTT結(jié)果顯示(圖 3)，在12 h時、 5、 20、 40 μmol/L的姜黃素促進細胞增殖；在24 h時， 5 μmol/L的姜黃素促進細胞增殖， 20、 40 μmol/L的姜黃素抑制細胞增殖；在48 h時， 5 μmol/L的姜黃素促進細胞增殖， 40 μmol/L的姜黃素抑制細胞增殖。

圖 3 不同濃度姜黃素對TNF-α、檳榔堿刺激的口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響

2.2.2 不同濃度姜黃素對檳榔堿刺激的口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響 不同濃度的姜黃素作用于濃度為40 μg/mL檳榔堿刺激的口腔黏膜成纖維細胞，MTT結(jié)果顯示(圖 3)，在12 h時，10和40 μmol/L的姜黃素促進細胞增殖；在24 h時， 40 μmol/L的姜黃素抑制細胞增殖；在48 h時，5 μmol/L的姜黃素促進細胞增殖， 40 μmol/L的姜黃素抑制細胞增殖。

2.2.3 不同濃度姜黃素對TNF-α刺激的口腔黏膜成纖維細胞羥脯氨酸合成的影響 不同濃度的姜黃素作用于TNF-α刺激的口腔黏膜成纖維細胞， 結(jié)果顯示(圖 4)，與對照組相比，羥脯氨酸合成均減少，并表現(xiàn)為濃度依賴性。

圖 4 不同濃度姜黃素對TNF-α及檳榔堿刺激的口腔黏膜成纖維細胞羥脯氨酸合成的影響

2.2.4 不同濃度姜黃素對檳榔堿刺激的口腔黏膜成纖維細胞羥脯氨酸合成的影響 不同濃度的姜黃素作用于檳榔堿刺激的口腔黏膜成纖維細胞，結(jié)果顯示(圖 4)，與對照組相比，羥脯氨酸合成均減少，并表現(xiàn)為濃度依賴性。

3 討 論

OSF的病因并不明確，病變主要表現(xiàn)為結(jié)締組織膠原纖維的堆積和變性，局部通常伴有炎癥相關(guān)的細胞浸潤和細胞因子分泌[5-6]?？谇火つこ衫w維細胞是產(chǎn)生膠原纖維的主要細胞之一，其增殖和膠原蛋白的分泌受多種炎癥和纖維化相關(guān)的細胞因子、檳榔提取物等調(diào)控。

TNF-α是炎癥反應(yīng)中最重要的細胞因子之一，對多種細胞都具有強大的調(diào)節(jié)作用。有研究采用TNF-α刺激正常的口腔黏膜成纖維細胞，模擬OSF的疾病過程[7]。本研究也采用了此方法， 觀察到較長時間和較高濃度的TNF-α，能夠明顯促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖，而在較短時間和較低濃度的刺激下，細胞并未表現(xiàn)出明顯的增殖反應(yīng)。隨著時間的延長和濃度的增高，細胞的增殖更加明顯，表現(xiàn)出一定的時間依賴性和濃度依賴性。羥脯氨酸是膠原中特有的氨基酸，是研究結(jié)締組織的重要指標[8]。在口腔黏膜成纖維化過程中，膠原纖維變性，結(jié)締組織增生，羥脯氨酸蛋白增多。本研究在TNF-α濃度為1 000 U/mL刺激細胞后，羥脯氨酸的分泌明顯增高。

檳榔的刺激是口腔黏膜下纖維化的主要致病因子，檳榔堿是檳榔的重要成分。本研究用不同濃度的檳榔堿作用于口腔黏膜成纖維細胞后，抑制細胞增殖，并表現(xiàn)為一定的濃度依賴性。選擇檳榔堿濃度為40 μg/mL刺激細胞后，羥脯氨酸的分泌降低。檳榔堿作用于細胞后，細胞增殖和膠原分泌的結(jié)果與TNF-α相反。檳榔堿可以通過直接作用于口腔黏膜成纖維細胞，刺激結(jié)締組織生長因子的產(chǎn)生，形成纖維化[9]，同時產(chǎn)生間接作用影響口腔黏膜成纖維細胞。例如檳榔堿作用于口腔黏膜的其他細胞，如口腔角質(zhì)形成細胞、血管內(nèi)皮細胞等[10]，這些細胞產(chǎn)生炎癥和纖維化的細胞因子，使口腔黏膜成纖維細胞發(fā)生纖維化改變。

姜黃素是姜黃提取物，具有多種細胞功效，如抗炎、抗纖維化、抗氧化等[11-12]。有研究顯示，在OSF中使用姜黃素可顯著降低與OSF的發(fā)生和進展相關(guān)的結(jié)締組織生長因子[13]。也有臨床研究利用姜黃素治療口腔黏膜下纖維化，取得了一定的效果[14-15]。本研究用不同濃度的姜黃素作用于兩種黏膜下纖維化的細胞模型，探索其作用效果。結(jié)果顯示在兩種細胞模型中，較長的時間和較高的濃度下，姜黃素能夠抑制細胞增殖，抑制羥脯氨酸的分泌。采用1 000 U/mL TNF-α和40 μg/mL檳榔堿作用的細胞模型， 40 μmol/L姜黃素在48 h抑制細胞增殖，不同濃度的姜黃素均能抑制羥脯氨酸的分泌。

在本研究檢測的兩項指標中，TNF-α作用的細胞模型可以造成細胞增殖和膠原蛋白的分泌增加，檳榔堿則相反。長時間和高濃度的姜黃素能夠抑制2種模型中的細胞增殖，抑制膠原蛋白的分泌。但姜黃素在OSF中的作用機制、作用機理和用藥途徑、方法等方面，還有待進一步研究。