變異鏈球菌對(duì)人唾液腺細(xì)胞系免疫球蛋白受體影響的初步研究

龔吳儀 李永明

變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是人類口腔內(nèi)的主要病原菌之一[1],人體主要通過(guò)唾液中的免疫球蛋白來(lái)抵御其侵害[2]。唾液中的免疫球蛋白是由廣泛分布于唾液腺間質(zhì)的漿細(xì)胞合成，通過(guò)唾液腺導(dǎo)管上皮的免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,Pigr)轉(zhuǎn)運(yùn)至唾液中發(fā)揮效應(yīng)[3]。Pigr由于其運(yùn)輸免疫球蛋白的關(guān)鍵作用，在口腔黏膜免疫中發(fā)揮著重要的功能。

病原菌為逃避黏膜免疫的清除作用可影響Pigr的表達(dá)，有研究表明產(chǎn)腸毒素大腸桿菌可抑制小鼠腸道上皮細(xì)胞的Pigr表達(dá)[4]，而口腔病原菌對(duì)唾液腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞Pigr的作用尚未有報(bào)導(dǎo)。本研究旨在觀察S.mutans對(duì)人唾液腺細(xì)胞系(human salivary gland cell line，HSG)中Pigr的影響，將有助于更深入了解S.mutans的致病過(guò)程，為齲病等口腔感染性疾病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人下頜下腺閏管來(lái)源的HSG為本實(shí)驗(yàn)室凍存。使用含有1%青霉素、鏈霉素(Hyclone公司, 美國(guó)); 10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)在37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HSG。每天更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)以1∶2的比例進(jìn)行傳代。

1.2 免疫熒光染色

24 孔板放置細(xì)胞爬片后，每孔接入5×103個(gè)HSG細(xì)胞，細(xì)胞于37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待其貼壁。細(xì)胞用PBS沖洗及4%多聚甲醛固定。用Triton X-100穿孔后5%牛血清白蛋白室溫封閉0.5 h。Pigr抗體(1∶200，武漢愛(ài)博泰克公司)與細(xì)胞角蛋白14(cytokeratin 14， K14)抗體(1∶1 000， Invitrogen公司， 美國(guó))4 ℃孵育過(guò)夜。去除一抗后熒光二抗(1∶1000，Invitrogen公司)室溫孵育1 h。DAPI(Sigma-Aldrich公司， 美國(guó))孵育10 min后將爬片取出，于載玻片上封片，共聚焦顯微鏡(Nikon公司, 日本)下觀察。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

Streptococcusmutans(ATCC 25175)(ATCC公司,美國(guó))。使用腦心浸出培養(yǎng)液(brain heart infusion，BHI)(青島海博公司)于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)S.mutans至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，于BHI培養(yǎng)液中60 ℃、 30 min水熱滅活后，以一定數(shù)量比例與HSG進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

96 孔板每孔接入3×103個(gè)HSG細(xì)胞，對(duì)照組不加任何處理因素，共培養(yǎng)組分別加入使細(xì)菌細(xì)胞比例為10∶1， 100∶1的滅活S.mutans菌液，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。共培養(yǎng)12、 24、 36、 48 h后加入CCK-8試劑(江蘇凱基公司)，按照說(shuō)明書(shū)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.5 RNA提取及qPCR

6 孔板每孔接入2×105個(gè)HSG細(xì)胞，對(duì)照組不加任何處理因素；BHI對(duì)照組加入與菌液等量的BHI培養(yǎng)液；共培養(yǎng)組分別加入使細(xì)菌細(xì)胞比例為10∶1， 100∶1的滅活S.mutans菌液。細(xì)菌與細(xì)胞于37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)12 h或24 h。細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗后使用TRIzol(Takara公司, 日本)提取細(xì)胞總RNA,然后使用PrimeScript RT(Takara公司, 日本)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。配制SYBR Green(上海翊圣公司)qPCR反應(yīng)體系后，于LightCyclerqPCR儀(Roche公司, 瑞士)中進(jìn)行檢測(cè)。磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase， GAPDH)為內(nèi)參，結(jié)果根據(jù)對(duì)照組水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列見(jiàn)表 1。

表 1 qPCR引物序列表

1.6 蛋白提取及Western印跡法

6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿每皿接入5×105個(gè)HSG細(xì)胞，對(duì)照組不加任何處理因素；BHI對(duì)照組加入與菌液等量的BHI培養(yǎng)液；共培養(yǎng)組加入使細(xì)菌細(xì)胞比例為100∶1的滅活S.mutans菌液。細(xì)菌與細(xì)胞于37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h。細(xì)胞用PBS沖洗后使用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(上海碧云天公司)裂解細(xì)胞。 12 000 r離心10 min后取上清進(jìn)行電泳。電泳完畢后于轉(zhuǎn)膜液中115 V轉(zhuǎn)膜1.5 h。應(yīng)用3%牛血清白蛋白室溫封閉2 h后一抗4 ℃孵育過(guò)夜。一抗信息如下： Pigr抗體(1∶1000，中國(guó)愛(ài)博泰克公司)，GAPDH抗體(1∶1000，中國(guó)碧云天公司)。去除一抗TBST漂洗3次后室溫避光孵育Western熒光二抗(1∶10 000，CST公司， 美國(guó))1.5 h。去除二抗用TBST再次漂洗3 次后顯影(LI-COR公司， 美國(guó))。GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果根據(jù)對(duì)照組水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞系來(lái)源與Pigr在HSG中的表達(dá)情況

鏡下觀察HSG細(xì)胞呈上皮細(xì)胞典型的“鋪路石樣”生長(zhǎng)(圖 1)，K14為導(dǎo)管上皮細(xì)胞的標(biāo)志物[5]，免疫熒光染色可觀察到K14在HSG中的陽(yáng)性信號(hào)，證明HSG的唾液腺導(dǎo)管上皮源性。同時(shí)也觀察到Pigr穩(wěn)定表達(dá)于HSG胞質(zhì)中(圖 1)。

2.2 S.mutans對(duì)HSG增殖的影響

共培養(yǎng)12、 24、 36、 48 h后，CCK-8結(jié)果顯示細(xì)菌細(xì)胞比例為10∶1、 100∶1的兩組與對(duì)照組相比吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 2)，說(shuō)明在此共培養(yǎng)的細(xì)菌比例與共培養(yǎng)時(shí)間下S.mutans不影響HSG的增殖。

圖 2 S.mutans對(duì)HSG細(xì)胞增殖的影響

2.3 S.mutans對(duì)HSG中Pigr表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示共培養(yǎng)12 h后，細(xì)菌細(xì)胞比例為10∶1、 100∶1的2 組Pigr的mRNA水平與對(duì)照組相比均顯著下降。共培養(yǎng)24 h后，細(xì)菌細(xì)胞比例為100∶1組與對(duì)照組相比Pigr的mRNA表達(dá)水平顯著下降。隨著共培養(yǎng)的時(shí)間增加與共培養(yǎng)的細(xì)菌比例上升， Pigr的mRNA表達(dá)水平呈下降的趨勢(shì)(圖 3A)。

Western印跡結(jié)果顯示細(xì)菌細(xì)胞比例為100∶1共培養(yǎng)24 h后，Pigr的蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖 3B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明S.mutans可在mRNA及蛋白水平抑制HSG中Pigr的表達(dá)。

圖 3 S.mutans對(duì)HSG中Pigr的mRNA與蛋白表達(dá)水平影響

3 討 論

在唾液腺中Pigr主要表達(dá)于閏管及紋狀管的上皮細(xì)胞中[3]，該研究使用唾液腺導(dǎo)管上皮來(lái)源的細(xì)胞系HSG，并通過(guò)導(dǎo)管上皮細(xì)胞標(biāo)志物K14的陽(yáng)性信號(hào)證明了其導(dǎo)管上皮源性。該研究觀察到HSG呈“鋪路石樣”生長(zhǎng)，且Pigr在HSG細(xì)胞質(zhì)中呈彌散性分布，這與前人的研究結(jié)果一致[3，6]。

Pigr負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)漿細(xì)胞合成的免疫球蛋白，使其到達(dá)黏膜表面中發(fā)揮免疫效應(yīng)，其中含量最多的是免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)。腸道IgA促進(jìn)內(nèi)源共生菌群的定植與外源病原菌的清除[7]。唾液IgA可抑制微生物在黏膜和牙齒表面的粘附，并輔助固有免疫系統(tǒng)清除病原菌如S.mutans[8-9]?；诖岁P(guān)系，微生物也演化出相應(yīng)機(jī)制來(lái)作用于Pigr以利用或逃避IgA的作用[10-11]。

腸道共生菌群可通過(guò)調(diào)控上皮細(xì)胞的Pigr表達(dá)來(lái)幫助其腸道定植，如乳雙歧桿菌與結(jié)腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)可上調(diào)細(xì)胞Pigr蛋白水平[12]，小鼠灌喂多形擬桿菌后回腸組織Pigr基因表達(dá)量增加[13]，腸桿菌屬也可以促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的Pigr基因表達(dá)[14]。與腸道共生菌相反，腸道病原菌如產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，其感染的小鼠腸道組織Pigr基因表達(dá)下降[4]。在口腔中，有報(bào)道曾指出口腔感染鏈球菌屬(如唾液鏈球菌，血鏈球菌)的患者舌下腺上皮細(xì)胞中，Pigr在mRNA水平及蛋白水平表達(dá)下降[15]，該研究體外實(shí)驗(yàn)初步證明了S.mutans可下調(diào)HSG中Pigr的mRNA及蛋白表達(dá)水平，可能導(dǎo)致唾液IgA含量的降低，成為S.mutans躲避唾液IgA清除的機(jī)制之一。有研究報(bào)導(dǎo)細(xì)菌信號(hào)可通過(guò)上皮細(xì)胞Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)/核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-kB)上調(diào)Pigr[14,16]。TLR可識(shí)別細(xì)菌成分如外毒素、內(nèi)毒素、菌體蛋白等，將信號(hào)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，激活NF-kB與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，介導(dǎo)下游的促炎反應(yīng)，S.mutans作用于HSG中Pigr的具體機(jī)制可能與TLR/NF-kB/MAPK信號(hào)通路有關(guān)[17-18]。

S.mutans是公認(rèn)的口腔致齲性病原菌，其牙面黏附、產(chǎn)酸、耐酸等特性會(huì)造成牙體組織的齲壞[19]。Pigr負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)耐僖篒gA作為口腔內(nèi)保護(hù)性免疫球蛋白可抑制S.mutans[20]并預(yù)防齲齒的發(fā)生，唾液IgA含量降低是齲齒的易感因素之一[21]。此外，Pigr本身也可直接參與固有免疫[11]，其水平下調(diào)加之其導(dǎo)致的唾液IgA含量減少將使得口腔黏膜免疫下降，可誘發(fā)多種口腔感染性疾病[22]，包括齲病、牙髓根尖周病、牙周病等，甚至與口腔癌癥發(fā)病有關(guān)，嚴(yán)重危害口腔健康[23]。

綜上所述，S.mutans可抑制HSG中Pigr的表達(dá)，可能屬于其逃避口腔黏膜免疫的機(jī)制之一，并且Pigr水平的下降會(huì)導(dǎo)致口腔感染性疾病的易感性增加。此過(guò)程涉及的細(xì)菌信號(hào)分子及具體信號(hào)通路還有待進(jìn)一步深入研究，以利于口腔疾病防治與口腔健康維護(hù)。